(北京一輕研究院,北京市食品工業(yè)研究所,北京 101111)

金銀花(LonicerajaponicaThunb.),正名忍冬,是忍冬科忍冬屬植物,其干燥花蕾或帶初開的花是一種藥食同源的天然產(chǎn)物,被列于國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)目錄》中。金銀花有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效,可用浸提法來制備茶飲料[1]、泡騰飲料片[2],也可用蒸餾法來制備金銀花露[3],自古以來就是夏天消暑清熱的飲品,據(jù)《綱目拾遺》記載:“氣芬郁而味甘”。金銀花露除了作為非處方中藥制劑在藥店銷售外,也常被制成無糖型或含糖型的普通飲料在超市銷售,生產(chǎn)廠家主要集中在湖北省、山東省。

金銀花露的已有研究工作主要有:張幸生等[4]研究了防腐劑、pH、抗氧化劑等對金銀花露質(zhì)量穩(wěn)定性的影響;杜春華等[5]建立了金銀花露微生物限度與控制菌的檢查方法并進行了驗證;張瑾等[6]、陸興毅等[7]分別建立了液相色譜測定金銀花露中防腐劑的方法;張思遠等[8]研究發(fā)現(xiàn)金銀花露殘液提取物對金黃色葡萄球菌等致病菌的生長有明顯的抑制作用;肖瑛瓊等[9]利用金銀花露的生產(chǎn)固體殘渣,通過添加氧化鈣制備了生物有機肥。徐俊虎等[10]將厭氧污泥接種至金銀花露藥渣,發(fā)酵獲得了甲烷。上述工作一部分集中于金銀花露的質(zhì)量控制(性狀、微生物、防腐劑)研究;一部分集中于金銀花露生產(chǎn)廢渣的增值利用工藝開發(fā)。目前,與金銀花制品相關(guān)的揮發(fā)性成分研究主要集中于金銀花揮發(fā)油的分析[11-16],針對金銀花露揮發(fā)性成分的相關(guān)研究還很少[17-18],僅有少數(shù)研究者采用氣相色譜法測定了金銀花露中芳樟醇的含量,未涉及到金銀花露揮發(fā)性成分的種類、含量及其香氣特點分析。因此,本文采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Headspace-Solid phase microextraction-Gas chromatography-Mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)[19-22],對金銀花露不同蒸餾段揮發(fā)性成分的種類、含量進行了測定分析,并結(jié)合香氣分析、聚類分析,旨在為金銀花露實際生產(chǎn)中的蒸餾時間控制、飲品風(fēng)味設(shè)計提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花干燥花蕾 亳州市大西北藥業(yè)有限責(zé)任公司;C7～C30飽和正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品 色譜純,美國Supelco公司;環(huán)己酮 純度>99.0%,TCI公司。

7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司;手動進樣器及萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS) 美國Supelco公司;DC-NSG-20多功能提取濃縮機組 上海達程實驗設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 稱取干燥的金銀花625 g分裝于5個紗布袋,加20 L反滲透純化水,在多功能提取濃縮機組中減壓蒸餾(-0.09 MPa),觀察蒸餾液收集罐的液位,液位升至2 L刻度時排空第1段蒸餾液存于樣品瓶,繼續(xù)收集蒸餾液,待液位升至2 L刻度時又排空儲存,直至收集第7段蒸餾液后,結(jié)束蒸餾。每份樣品取三個平行,測定結(jié)果取均值。

1.2.2 HS-SPME處理條件 取5 g金銀花蒸餾液樣品,置于15 mL固相微萃取專用樣品瓶中,加入內(nèi)標(biāo)物環(huán)己酮,密封,并將樣品瓶放入50 ℃水浴中平衡15 min,之后將萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)插入樣品瓶中,繼續(xù)于50 ℃水浴中頂空萃取40 min,萃取結(jié)束后進樣,240 ℃解吸5 min。

1.2.3 GC-MS檢測條件 氣相色譜條件:DB-WAX石英毛細(xì)柱(30 m×250 μm,0.25 μm)色譜柱;進樣口溫度:240 ℃;升溫程序:40 ℃保持3 min,以5 ℃/min升至120 ℃,保持4 min,10 ℃/min升溫至200 ℃,保持4 min,20 ℃/min升至240 ℃,保持8 min;載氣氦氣(He)，流速1.0 mL/min,不分流。質(zhì)譜條件:電子電離(Electron ionization,EI)源;電子能量70 eV;傳輸線溫度240 ℃;離子源溫度230 ℃;四級桿溫度150 ℃;質(zhì)量掃描范圍20.00～500.00 m/z。

1.2.4 定性和定量分析 定性分析:利用安捷倫質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)結(jié)合NIST 11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫對各化合物進行檢索,并通過C7～C30飽和正構(gòu)烷烴作為對照標(biāo)準(zhǔn)計算保留指數(shù),對照相關(guān)文獻報道,綜合定性。定量分析:采用內(nèi)標(biāo)法半定量,各樣品中揮發(fā)性化合物含量的計算公式如下:

揮發(fā)性化合物含量(μg/g)=(組分峰面積×內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量)/(內(nèi)標(biāo)物峰面積×樣品質(zhì)量)

1.2.5 蒸出比例計算 以全部七個蒸餾段的揮發(fā)性成分含量總和為基數(shù),計算不同蒸餾段揮發(fā)性成分的本段蒸出比例和累計蒸出比例,具體計算公式如下:

式中,i=1～7代表蒸餾段數(shù),C代表各段蒸餾液揮發(fā)性成分的濃度,V代表各段蒸餾液的體積。

1.2.6 主體香氣分析 將某種揮發(fā)性化合物的濃度除以其閾值,便可以得到一個評價該化合物對整體香氣貢獻的量值,即氣味活性值(Odor activity value,OAV),具體計算公式如下:

式中,c代表揮發(fā)性化合物的濃度,cT代表該化合物在水中的閾值。一般來講,只有當(dāng)某種化合物的濃度大于其閾值,即OAV>1,才被認(rèn)為是主體香氣成分,0.1

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和Origin 2017處理實驗數(shù)據(jù)并繪圖,采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花露不同蒸餾段揮發(fā)性成分的GC-MS測定結(jié)果

圖1是金銀花露七個蒸餾段的總離子流色譜圖,可以看出揮發(fā)性成分出峰時間主要集中在15～20、25～30 min兩個時間段。通過檢索NIST 11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫,并與文獻報道的保留指數(shù)對比,在金銀花露七個蒸餾段中共鑒定出62種化合物,主要是醇、醛、萜、酮、酯類等物質(zhì),采用內(nèi)標(biāo)法半定量計算出不同蒸餾段中各化合物的含量,結(jié)果如表1所示。其中數(shù)量較多的是醇類和醛類:鑒定出醇類化合物18種,其中飽和醇13種、不飽和醇5種,它們中含量較高的有2-庚醇、正己醇、葉醇、1-辛烯-3-醇、正辛醇、(Z)-3-壬烯-1-醇;鑒定出醛類化合物17種,其中不飽和醛11種,飽和醛6種,它們中含量較高的有(E)-2-丁烯醛、(E)-2-己烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、苯甲醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛。其次,鑒定出酯類化合物12種,包括正己酸甲酯、正己酸乙酯、乙酸正已酯等,但含量都不高。再次,鑒定出萜類8種、酮類7種,香葉醇、香茅醇、芳樟醇是含量較高的萜類化合物,β-紫羅蘭酮、(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮、香葉基丙酮是含量較高的酮類化合物。

表1 不同蒸餾段金銀花露中的揮發(fā)性成分及含量Table 1 Volatile components and contents in different distillation fractions of honeysuckle flower

續(xù)表

注:“-”表示未檢出。

圖1 不同蒸餾段金銀花露中揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of volatile components in different distillation fractions of honeysuckle flower

2.2 金銀花露不同蒸餾段揮發(fā)性成分的比較

醇、醛、萜、酮、酯類在金銀花露不同蒸餾段中的含量如圖2所示,可以看出各蒸餾段中醇類、醛類的含量均較高。由圖2還可知,隨著蒸餾進行(即蒸餾段從第1～7段),金銀花露中所有揮發(fā)性化合物的總含量在不斷降低,由214.49 μg/g逐漸下降到12.21 μg/g,其中第1～2段、第2～3段、第3～4段的降幅較大,分別為75.95%、46.29%、33.70%;第4～5段、第5～6段、第6～7段的降幅較小,分別為13.12%、5.94%、18.67%。這說明在蒸餾前期大部分揮發(fā)性成分已被蒸出,到蒸餾后期揮發(fā)性成分趨于少量而穩(wěn)定地蒸出。

表2 不同蒸餾段對應(yīng)的本段蒸出比例和累計蒸出比例Table 2 Current and cumulative evaporation ratio corresponding to different distillation fractions

圖2 不同蒸餾段金銀花露中各類揮發(fā)性成分的含量Fig.2 Content of volatile components in different distillation fractions of honeysuckle flower

金銀花露揮發(fā)性成分在不同蒸餾段對應(yīng)的本段蒸出比例和累計蒸出比例見表2。由表2可知,第1段蒸出的揮發(fā)性成分含量已占所有七個蒸餾段揮發(fā)性成分含量總和的60.37%,至第3段時累計蒸出比例則已達82.68%,再往后每增加一個蒸餾段,提升比例只有3%～6%。這意味著以揮發(fā)性物質(zhì)含量為考核指標(biāo)的話,后幾個蒸餾段的能耗較高。因此,在實際生產(chǎn)中,可根據(jù)金銀花用量、蒸出揮發(fā)性物質(zhì)含量、能源成本等因素來綜合考慮最優(yōu)蒸餾時間。

除了含量不同,不同蒸餾段中各類揮發(fā)性成分的比例也有所不同,具體如圖3所示。由圖3可知,在金銀花露所有蒸餾段中,醇類和醛類都是占比較高的兩類化合物,它們含量之和占所有揮發(fā)性化合物總含量之和的比例為70%左右。隨著蒸餾進行,不同蒸餾段中各類化合物的所占比例也在不斷變化,其中變化明顯的是醇類和醛類化合物。醇類化合物由第1段占比38.78%逐漸下降并穩(wěn)定在25%左右,而醛類化合物由第1段占比32.60%逐漸上升并穩(wěn)定在45%左右,說明醇類較醛類更易蒸出,因為羥基較醛基親水性更強。萜類和酮類由第1段占比11.94%和11.05%緩慢降低至第7段占比8.52%和7.46%,酯類則由第1段占比5.63%緩慢升高至第7段占比13.37%。

圖4 不同蒸餾段金銀花露的氣味活性輪廓Fig.4 OAV profile of different distillation fractions of honeysuckle flower

圖3 不同蒸餾段金銀花露中各類揮發(fā)性成分所占百分比Fig.3 Percentage of volatile components in different distillation fractions of honeysuckle flower

2.3 金銀花露不同蒸餾段的香氣分析

不同蒸餾段金銀花露的香氣強度與風(fēng)格有所不同,這與它們所含揮發(fā)性化合物的OAV值有關(guān)。一般而言,OAV值越大,該化合物對整體香氣貢獻的程度越大。通過查閱文獻[25],共查得40種揮發(fā)性成分在水中的閾值,結(jié)合表1種這些成分在不同蒸餾段的含量,便可計算出它們的OAV值,并得到金銀花露不同蒸餾段的大致氣味活性輪廓圖,如圖4所示(根據(jù)第1段化合物OAV值從大到小,在Y軸從上到下排列化合物名稱)。

整體來看,β-紫羅蘭酮、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-壬烯醛在所有蒸餾段中的OAV值都大于100,說明這4種成分對金銀花露整體香氣有明顯的影響。β-紫羅蘭酮呈甜的花香、木香氣味,香氣柔和淳厚[26],常用于配制如紫羅蘭、桂花、蘭花等花香型香精。(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛都有一定的油脂香氣,前者還帶有花果香[27]。(E)-2-壬烯醛有類似紙板的氣味,常在老化后的啤酒中測出[28]。

其次,1-辛烯-3-醇、香葉醇、香茅醇、芳樟醇、(E)-2-己烯醛、香葉基丙酮、正己醛、苯乙醛、正辛醇基本在所有蒸餾段中的OAV值都大于10,說明這9種成分對金銀花露整體香氣也有很顯著的影響。1-辛烯-3-醇,也叫蘑菇醇,有一定的蘑菇和泥土氣味[26]。香葉醇主要呈甜的玫瑰花香氣[29-30]。香茅醇有類似新鮮玫瑰的特殊香氣[31]。芳樟醇是全世界用量靠前的香料之一,具有甜的花香、木香氣息,香氣柔和[26,31]。(E)-2-己烯醛,也叫葉醛,呈新鮮的青草香氣[31-32]。香葉基丙酮主要呈新鮮花香香氣,帶有一點甜的玫瑰花香氣[30-31]。正己醛呈青草香、油脂香[26,31]。苯乙醛具有濃厚的花香[26,31]。正辛醇帶有柑橘樣氣息,還有甜脂香味[33]。

再次,葉醇、(E)-檸檬醛、乙酸苯乙酯、正己酸乙酯、正壬醇、正癸醛、正壬醛、(E)-2-丁烯醛、正庚醛、甲基庚烯酮基本在所有蒸餾段中的OAV值都大于1,說明這10種成分對金銀花露整體香氣也會有一定的影響。葉醇呈新鮮草香、青香[26,31]。(E)-檸檬醛、正壬醇、正癸醛、正壬醛、正庚醛、甲基庚烯酮都具有一定的類似檸檬香、柑橘香的氣味,前四者還帶有油脂氣味[26,31,33]。乙酸苯乙酯呈甜的玫瑰花香氣息,還帶有類似桃子的果香[26]。正己酸乙酯具有新鮮的甜香和水果香氣味[26,33]。(E)-2-丁烯醛有特殊刺激性氣味[34]。

綜上,花香、青草香、油脂香、果香是金銀花露的主體香氣,(E)-2-壬烯醛、1-辛烯-3-醇、(E)-2-丁烯醛等化合物對其氣味進一步構(gòu)成特殊影響,最后共同構(gòu)成了金銀花露的獨特氣味。

由圖4還可以看出,第1段的氣味輪廓與其他蒸餾段明顯不同,具體而言,第1段中OAV>1的化合物有34種,而其他段中OAV>1的化合物在21～25種之間。其他蒸餾段之間對比則既有類似又有不同,如第4～7段的輪廓較為相似,第2、3段與它們有所不同。

圖5 不同蒸餾段金銀花露氣味活性值的聚類分析Fig.5 Clustering analysis of different distillation fractions of honeysuckle flower based on OAVs

為了更清晰、更客觀地區(qū)分不同蒸餾段氣味輪廓的區(qū)別,以平方歐氏距離為度量準(zhǔn)則,采用組內(nèi)連接距離方法進行系統(tǒng)聚類分析,結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,金銀花露第4、5、6、7蒸餾段在距離1.0可以聚為一類,結(jié)合圖4來看,它們的OAV輪廓也極度相似,僅有細(xì)微差別,這也進一步說明了在蒸餾后期香氣化合物趨于穩(wěn)定蒸出。第3蒸餾段單獨為一類,與第4～7蒸餾段稍有區(qū)別(相距1.0),結(jié)合圖4來看區(qū)別主要源自1-辛烯-3-醇、香葉醇、(E)-2-己烯醛的OAV差別。第2蒸餾段單獨為一類,與第3蒸餾段又稍有區(qū)別(相距1.0),結(jié)合圖4來看區(qū)別主要源自苯乙醛、葉醛、(E)-檸檬醛、正癸醛、正壬醛的OAV差別。此外,第2、3蒸餾段中的1-辛烯-3-醇、(E)-2-己烯醛氣味活性較高,使得這兩個蒸餾段有一定的青草、泥土氣息。第1蒸餾段則與其他所有蒸餾段區(qū)別明顯,單獨為一類,結(jié)合圖4來看,該區(qū)別源自于第1蒸餾段中香茅醇、芳樟醇、香葉基丙酮、正己醛、正辛醇、乙酸苯乙酯、正己酸乙酯、正壬醇等化合物的OAV值較其他段蒸餾液均高出了一個量級,使得第1段蒸餾液的花香、果香風(fēng)格尤為突出。綜上,在實際生產(chǎn)中,可分段或合并相似段來獲取不同呈香風(fēng)格的蒸餾液。

3 結(jié)論

采用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),內(nèi)標(biāo)法半定量分析了金銀花露七個不同蒸餾段揮發(fā)性成分的差異。不同于金銀花揮發(fā)油主要成分為烴類、酯類、酸類[11-16],金銀花露所含揮發(fā)性成分種類主要是醇類、醛類、萜類、酮類、酯類這五種物質(zhì)。金銀花露第1蒸餾段揮發(fā)性成分的含量(214.49 μg/g)遠高于其他蒸餾段(51.58～12.21 μg/g),說明金銀花中的大部分揮發(fā)性成分能較快地被蒸發(fā)出來。氣味活性值分析表明花香、青草香、油脂香、果香是金銀花露的主體香氣,主要由β-紫羅蘭酮、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-壬烯醛、1-辛烯-3-醇、香葉醇、香茅醇、芳樟醇、(E)-2-己烯醛、香葉基丙酮、正己醛、苯乙醛、正辛醇貢獻(OAV>10)。不同蒸餾段的氣味活性輪廓有所不同,第1段與其它段區(qū)別最為明顯,其花香、果香風(fēng)格尤為突出。綜上,本課題的研究在促進金銀花露節(jié)能生產(chǎn)、建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、設(shè)計飲品風(fēng)味等方面有一定的參考價值,生產(chǎn)廠家可根據(jù)金銀花露不同蒸餾段揮發(fā)性成分含量、比例、氣味活性輪廓的差異,并結(jié)合原料成本、能源成本等因素來確定最優(yōu)蒸餾工藝。