劉仁杰,李 哲,毛思凝,梁 珊,趙 悅,王玉華

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118)

益生菌為有益的活性微生物,能夠在人體胃腸道產(chǎn)生多種天然抑菌物質(zhì),維持人體胃腸道菌群平衡并改善身體狀態(tài)[1]。植物乳桿菌是一種常見(jiàn)的益生乳酸菌,廣泛應(yīng)用于食品、藥品和飼料中。研究表明,植物乳桿菌不僅能夠改善腸道功能、調(diào)節(jié)免疫功能,還能調(diào)節(jié)焦慮、抑郁等情緒功能障礙和阿爾茲海默癥等認(rèn)知功能障礙,并具有緩解神經(jīng)退變的潛在功效[2]。據(jù)報(bào)道,乳酸菌在腸道的活菌數(shù)大于1.00×106CFU/mL時(shí)益生作用明顯,然而絕大多數(shù)乳酸菌易受溫度、氧氣、溶劑和機(jī)械壓迫等影響,且不耐胃酸和膽鹽[3]。微膠囊包埋可以增強(qiáng)菌體對(duì)外界不良環(huán)境的抵抗力,明顯提高菌體的存活率,促進(jìn)乳酸菌在腸道中定殖,使其充分發(fā)揮益生功能[4]。

目前常用的微膠囊制備方法有相分離法、噴霧干燥法、乳化法等,但都存在使益生菌活性降低的缺陷[5]。銳孔法操作簡(jiǎn)單,作用條件溫和,包埋效率高,成本低,在乳酸菌包埋中被廣泛運(yùn)用[6]。銳孔法可與其他干燥方式結(jié)合使用提高微膠囊性能,其結(jié)合冷凍干燥可縮小微膠囊粒徑,排除多余的氧氣和水分,延長(zhǎng)微膠囊儲(chǔ)藏性能[7]。而壁材的選用也是至關(guān)重要的,海藻酸鈉可快速與Ca2+、Zn2+、Al3+鰲合形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠而被廣泛使用,但其孔隙大,低pH下易降解,螯合物與陰離子能使其解聚,容易突釋與早釋[8]。而其他蛋白類壁材也存在制備時(shí)間長(zhǎng)、易被胃蛋白酶酶解和疏水性基團(tuán)易使微膠囊相互聚集等缺點(diǎn)。針對(duì)壁材的不足,國(guó)內(nèi)外研究者認(rèn)為可以從復(fù)配包埋和多層包埋乳酸菌等方面強(qiáng)化微膠囊性能。Huq等使用復(fù)配包埋提高了微膠囊的顆粒密度和強(qiáng)度,多層包埋可增大微膠囊表面積,提高乳酸菌包埋率和保護(hù)效果[9]。但消化道中的菌體存活率不理想,粒徑較大。如何實(shí)現(xiàn)各種壁材間的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)還需進(jìn)一步研究。因此,復(fù)配包埋與多層包埋乳酸菌具有較高的研究?jī)r(jià)值。

本文以包埋率、微膠囊粒徑、抗冷凍干燥存活率、消化道存活率為考察因素,研究不同壁材對(duì)植物乳桿菌包埋的影響。此外,表征對(duì)比了復(fù)配與多層包埋保護(hù)效果的差異,以期為微膠囊包埋技術(shù)與乳酸菌產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白 上海瑞豐生物科技有限公司;乳清分離蛋白 上海瑞豐生物科技有限公司;海藻酸鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;明膠 西隴化工股份有限公司;丙三醇 北京化工廠;以上材料均為食品級(jí);植物乳桿菌 由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品安全實(shí)驗(yàn)室提供;牛膽鹽 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;胃蛋白酶(酶活力3000 U/g) 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;胰蛋白酶(酶活力250 U/g) 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

Delta320pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器上海有限公司;JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器 金壇市江南儀器廠;奧林巴斯顯微鏡 奧林巴斯北京銷售服務(wù)有限公司;KYC-100B空氣恒溫?fù)u床 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;電子螺旋測(cè)微計(jì)(規(guī)格0～25 mm,分辨率0.001 mm) 鄭州衡量科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 銳孔法制備植物乳桿菌微膠囊

1.2.1.1 植物乳桿菌菌懸液的制備 將植物乳桿菌活化,4 ℃、13000 r/min離心5 min后收集菌體細(xì)胞,用 pH7.00的PBS緩沖液沖洗兩次,制備1.00×1010CFU/mL菌懸液,備用。

1.2.1.2 大豆分離蛋白復(fù)配壁材微膠囊的制備 改進(jìn)Chen等[10]的制備方法。取4.00 g大豆分離蛋白溶于100 mL無(wú)菌水,60 ℃水浴改性30 min后冷卻至室溫。加入1.00 g海藻酸鈉與6.00 g丙三醇,150 r/min攪拌10 min進(jìn)行復(fù)配,再加入菌懸液10 mL繼續(xù)攪拌5 min形成混合液,緩慢滴入1.00%氯化鈣溶液中固定化30 min,無(wú)菌生理鹽水洗滌3次,將上述制備的微膠囊在-20 ℃預(yù)凍8～12 h,置于-50 ℃冷凍干燥10 h完成微膠囊的制備。

1.2.1.3 乳清分離蛋白復(fù)配壁材微膠囊的制備 改進(jìn)Wongsasulak等[11]的制備方法。取5.00 g乳清分離蛋白溶于100 mL無(wú)菌水,60 ℃水浴改性30 min后冷卻至室溫。加入1.00 g海藻酸鈉與7.00 g丙三醇,150 r/min攪拌10 min進(jìn)行復(fù)配,再加入菌懸液10 mL繼續(xù)攪拌5 min形成混合液,緩慢滴入1.00%氯化鈣溶液中固定化30 min,無(wú)菌生理鹽水洗滌3次,參照1.2.1.2進(jìn)行凍干。

1.2.1.4 明膠-大豆分離蛋白多層微膠囊的制備 制備的大豆分離蛋白復(fù)配壁材微膠囊加入1.00%明膠溶液,150 r/min攪拌10 min,使明膠均勻覆蓋,3000 r/min離心5 min,無(wú)菌生理鹽水洗滌3次,參照1.2.1.2進(jìn)行凍干。

1.2.1.5 明膠-乳清分離蛋白多層微膠囊的制備 制備的乳清分離蛋白復(fù)配壁材微膠囊加入1.00%明膠溶液,150 r/min攪拌10 min,使明膠均勻覆蓋,3000 r/min離心5 min,無(wú)菌生理鹽水洗滌3次,參照1.2.1.2進(jìn)行凍干。

1.2.1.6 海藻酸鈉微膠囊的制備 在100 mL無(wú)菌水中加入1.00 g海藻酸鈉與6.00 g丙三醇混合均勻,加入菌懸液10 mL繼續(xù)攪拌5 min形成混合液,緩慢滴入1.00%氯化鈣溶液中固定化30 min,無(wú)菌生理鹽水洗滌3次,作空白對(duì)照組,參照1.2.1.2進(jìn)行凍干。

1.2.1.7 活菌計(jì)數(shù) 根據(jù)GB 4789.35-2016使用稀釋涂布平板法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.2 微膠囊包埋率測(cè)定 植物乳桿菌微膠囊用3.00%的檸檬酸三鈉溶液進(jìn)行破碎處理,根據(jù)1.2.1.7進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。包埋率的計(jì)算公式如下[12]:

式中:N表示包埋后的植物乳桿菌活菌數(shù),log CFU·g-1;N0表示包埋前的植物乳桿菌活菌數(shù),log CFU·g-1。

1.2.3 微膠囊的粒徑檢測(cè) 用電子螺旋測(cè)微計(jì)分別測(cè)量?jī)龈珊蟮奈⒛z囊,每份樣品測(cè)量100個(gè)微膠囊并取平均值。

1.2.4 人工唾液、胃液與腸液的配制 配制人工唾液,添加0.75 g氯化鉀、0.15 g磷酸氫二鉀、0.99 g碳酸氫鈉、0.03 g六水合氯化鎂和0.01 g碳酸銨于500 mL無(wú)菌水中混合均勻,并用1.00 mmol/L鹽酸或1.00 mmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.00,備用。

配制人工胃液,添加0.26 g氯化鉀、0.02 g磷酸二氫鉀、1.05 g碳酸氫鈉、1.40 g氯化鈉、0.01 g二水合氯化鎂、0.04 g碳酸銨和0.01 g二水合氯化鈣于500 mL無(wú)菌水中混合均勻,并用1.00 mmol/L鹽酸或1.00 mmol/L氫氧化鈉調(diào)pH至2.00,胃蛋白酶保持在3.20 g/L,備用。

配制人工腸液,添加0.25 g氯化鉀、0.01 g磷酸二氫鉀、3.27 g碳酸氫鈉、1.12 g氯化鈉、6.13 g六水合氯化鎂和0.03 g二水合氯化鈣于500 mL無(wú)菌水中混合均勻,并用1.00 mmol/L鹽酸或1.00 mmol/L氫氧化鈉調(diào)整pH至7.40,胰酶保持在10.00 g/L,膽鹽保持在3.00 g/L,備用[13]。

1.2.5 體外消化道中植物乳桿菌存活率測(cè)定方法

1.2.5.1 人工唾液中植物乳桿菌存活率測(cè)定 實(shí)驗(yàn)組:將制得的微膠囊加入20 mL人工唾液中,37 ℃、150 r/min勻速搖動(dòng)10 min,每隔1 min按GB 4789.35-2016使用涂布平板法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。對(duì)照組:將1 mL植物乳桿菌菌懸液加入20 mL人工唾液中,37 ℃、150 r/min勻速搖動(dòng)10 min,每隔1 min按同樣方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.5.2 人工胃液與腸液中植物乳桿菌存活率測(cè)定 實(shí)驗(yàn)組:將上述已通過(guò)人工唾液的微膠囊加入20 mL人工胃液中,37 ℃、150 r/min勻速搖動(dòng)120 min,通過(guò)人工胃液的微膠囊加入20 mL人工腸液中勻速搖動(dòng)120 min,每隔30 min按1.2.5.1進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。對(duì)照組:通過(guò)人工唾液的植物乳桿菌離心后加入20 mL人工胃液中,37 ℃、150 r/min勻速搖動(dòng)120 min,通過(guò)人工胃液的植物乳桿菌離心后加入到20 mL人工腸液中勻速搖動(dòng)120 min,每隔30 min按1.2.5.1進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.2.5.3 植物乳桿菌存活率的測(cè)定 植物乳桿菌微膠囊用3.00%的檸檬酸三鈉溶液進(jìn)行破碎處理,根據(jù)1.2.5.1進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。存活率的計(jì)算公式如下:

式中:S表示處理后的植物乳桿菌活菌數(shù),log CFU·g-1;S0表示處理前的植物乳桿菌活菌數(shù),log CFU·g-1。

1.2.6 微膠囊的形態(tài)特征觀察 用光學(xué)顯微鏡觀察微膠囊的形態(tài)特征,并用數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行記錄。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次平行測(cè)定,結(jié)果以Mean±SD的形式表示。采用GraphPad Prism軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差及顯著性分析,并以P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 微膠囊包埋率的檢測(cè)結(jié)果

如圖1所示,與空白對(duì)照組相比,不同壁材的微膠囊包埋率均顯著提高(P<0.05),由此得出大豆分離蛋白、乳清分離蛋白和明膠均可增強(qiáng)微膠囊的包埋效果,能夠容納更多植物乳桿菌。Khan等[14]發(fā)現(xiàn)蛋白類壁材與海藻酸鈉復(fù)配可以提高微膠囊的包埋率,這與本文的研究結(jié)果一致。與不含明膠的單層微膠囊相比,雙層微膠囊包埋率略有下降,這可能是由于雙層包埋需進(jìn)一步攪拌附著明膠,增加攪拌時(shí)間,使微膠囊外層的乳酸菌細(xì)胞被攪拌器所傷,但包埋率仍處于較高水平,這與Zaeim等的研究結(jié)果一致[15]。

圖1 不同壁材包埋的植物乳桿菌包埋率Fig.1 Encapsulation efficiency of Lactobacillus plantarum with different wall materials注:柱上字母不同表示有顯著性差異(P<0.05),圖2、圖3同。

2.2 微膠囊粒徑的測(cè)定結(jié)果

如圖2所示,多層微膠囊與空白組相比差異顯著(P<0.05),粒徑增大,可能與多層微膠囊添加壁材更多有關(guān)。但微膠囊粒徑都小于2.00 mm,不會(huì)對(duì)微膠囊感官性狀造成影響,符合微膠囊的制備要求。且粒徑較大的微膠囊具有更強(qiáng)的耐酸能力[16]。

圖2 不同壁材微膠囊的粒徑Fig.2 Particle size of microcapsules with different wall materials

2.3 冷凍干燥后植物乳桿菌的存活率

冷凍干燥過(guò)程會(huì)造成部分微生物細(xì)胞的損傷或死亡,不同壁材在冷凍干燥過(guò)程的保護(hù)效果[17],如圖3所示。結(jié)果表明不同壁材微膠囊與空白對(duì)照組差異均顯著(P<0.05),添加明膠、大豆分離蛋白或乳清分離蛋白后,菌體存活率顯著提高(P<0.05),明膠-大豆分離蛋白多層微膠囊保護(hù)效果顯著高于其他組(P<0.05),存活率為96.24%,僅用海藻酸鈉包埋對(duì)菌體活性的保護(hù)效果不佳。郝瑩等[18]研究發(fā)現(xiàn)蛋白類壁材可在細(xì)胞表面形成保護(hù)層,海藻酸鈉能形成高粘度玻璃態(tài),降低分子擴(kuò)散系數(shù),從而起到保護(hù)效果。Janja等[19]研究表明復(fù)配及多層包埋能有效提高植物乳桿菌的凍干過(guò)程中的存活率,與本文結(jié)果一致。

圖3 冷凍干燥后不同壁材包埋的植物乳桿菌存活率Fig.3 Survival rate of Lactobacillus plantarum encapsulated in different wall materials after freeze-drying

2.4 經(jīng)體外消化道試驗(yàn)后植物乳桿菌的存活率

體外消化道中復(fù)配及多層包埋對(duì)植物乳桿菌存活率的影響如圖4和圖5所示。如圖4A所示,盡管體內(nèi)含有唾液淀粉酶和大量的無(wú)機(jī)鹽,但食物通過(guò)人體口腔和食管的時(shí)間只需30～120 s,包埋前后植物乳桿菌存活率無(wú)顯著變化(P>0.05)。說(shuō)明通過(guò)人體口腔和食管時(shí)包埋與否對(duì)植物乳桿菌菌體活性影響不大。

圖5 微膠囊光學(xué)顯微鏡圖(40×)Fig.5 Microstructure of microcapsules(40×)

從圖4B得出,未包埋的植物乳桿菌在模擬胃環(huán)境120 min時(shí)菌體存活率為20.44%,進(jìn)入模擬小腸環(huán)境30 min后活菌數(shù)降為0。表明未包埋的植物乳桿菌難以通過(guò)胃腸道到達(dá)人體回腸部位。已有報(bào)道乳酸菌活菌數(shù)低于1.00×106CFU/mL時(shí)難以發(fā)揮益生作用[20]。本研究中,海藻酸鈉微膠囊包埋的植物乳桿菌在模擬消化道迅速死亡,進(jìn)入小腸后菌體存活率降為30.07%,可能是因?yàn)楹Ｔ逅徕c微膠囊存在較大孔隙,使得胃酸快速進(jìn)入微膠囊內(nèi)部,降低植物乳桿菌存活率,因此應(yīng)選擇兩種或多種壁材制備微膠囊。多層包埋微膠囊通過(guò)消化道后植物乳桿菌的存活率達(dá)到84.41%以上。明膠-大豆分離蛋白多層微膠囊菌體存活率達(dá)到85.73%,高于其他組別,證明明膠-大豆分離蛋白多層包埋具有良好的耐酸耐膽鹽效果。這可能是外層明膠阻礙了胃蛋白酶對(duì)里層壁材的酶解,并阻礙了部分胃酸的進(jìn)入[21]。里層蛋白分子具有較大數(shù)量的堿性氨基酸殘基能夠中和入侵的H+,維持微膠囊內(nèi)部pH的中性環(huán)境,從而對(duì)植物乳桿菌起到保護(hù)作用[22]。Laelorspoen等[23]研究發(fā)現(xiàn)在pH1.2(含胃蛋白酶)的模擬胃環(huán)境中,蛋白類與海藻酸鈉復(fù)配使乳酸菌存活率提高了5倍,證明了這一觀點(diǎn)。

圖4 體外消化道中的植物乳桿菌存活率變化情況Fig.4 Changes survival rate of Lactobacillus plantarum in digestive tract in vitro

由圖5可知,空白對(duì)照組與乳清分離蛋白復(fù)配壁材微膠囊表面孔隙較大、凹凸不平、結(jié)構(gòu)疏松,多層微膠囊表面更加圓滑完整且均勻,無(wú)光影,這可能由于明膠填補(bǔ)了蛋白與海藻酸鈉壁材間的孔隙,一定程度上阻斷了胃酸和膽鹽進(jìn)入微膠囊,使包埋更完整。Maria等[24]研究發(fā)現(xiàn)明膠表面正電荷與結(jié)冷膠的負(fù)電荷能夠相互作用,使得微膠囊結(jié)構(gòu)更緊實(shí),這與本文研究結(jié)果一致。在胃液中,各組微膠囊在遇強(qiáng)酸后均出現(xiàn)不同程度的收縮,阻止胃酸的進(jìn)入,其中多層包埋組別的微膠囊效果更明顯。在腸液中,明膠-大豆分離蛋白復(fù)配壁材微膠囊結(jié)構(gòu)最為完整,證明其緩釋效果最佳,其他組別在溶脹過(guò)程中微膠囊結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)不同程度的破損,進(jìn)一步證明復(fù)配結(jié)合多層包埋制備的微膠囊包埋效果更佳。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)使用復(fù)配結(jié)合多層包埋的方法制備的明膠-大豆分離蛋白多層微膠囊包埋率達(dá)到95.31%,經(jīng)冷凍干燥后菌體存活率達(dá)到96.24%,在體外消化道試驗(yàn)中菌體存活率達(dá)到85.73%,且微膠囊的結(jié)構(gòu)質(zhì)密,冷凍干燥后粒徑較小。復(fù)配結(jié)合多層包埋的方法改善了傳統(tǒng)單一海藻酸鈉微膠囊孔隙過(guò)大、蛋白類壁材易被酶解的缺陷,實(shí)現(xiàn)各類壁材的優(yōu)勢(shì)最大化,明顯提高了植物乳桿菌通過(guò)消化道的存活率,能夠更好地發(fā)揮其益生效用,為微膠囊的制備提供了新的手段和思路。同時(shí),此法制備過(guò)程簡(jiǎn)單,工藝容易控制,且制成的微膠囊滿足一定的市場(chǎng)需求,為乳酸菌微膠囊產(chǎn)品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。