李學(xué)優(yōu) 曹丁 肖宏艷 黃秀敏 甘祥武

摘要??對重組人溶菌酶真核表達(dá)載體的構(gòu)建篩選、表達(dá)與活性鑒定，經(jīng)過雙酶切和測序鑒定表明，重組載體正確。電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GWDL菌株，通過G418抗性平板篩選得到高表達(dá)高效價菌株，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，檢測蛋白含量，體外抑菌檢測，表達(dá)產(chǎn)物15 ku和預(yù)期結(jié)果一致，篩選得到效價為1 907 U/mL，編號為 SMD1168-pPIC9k-HLZ的高效價菌株;采用重組人溶菌酶制劑，檢測樣品GWDL對5種菌的最小抑菌濃度（MIC） ，藤黃微球菌的最小抑菌濃度較好，表明重組人溶菌酶在畢赤酵母中成功表達(dá)，活性較為穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞??畢赤酵母;菌株篩選;高效表達(dá);抑菌活性

中圖分類號??S??188文獻(xiàn)標(biāo)識碼??A

文章編號??0517-6611（2020）04-0100-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.029

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Expression of Human Lysozyme in Pichia Pastoris and Its Antibarterial Activity in vitro

LI Xue-you，CAO Ding，XIAO Hong-yan et al??（Guangzhou lnstitute of Microbiology，Guangzhou，Guangdong 510663）

Abstract??The screening， expression and activity identification of constructed recombinant human lysozyme eukartic expression vectors were studied.The recombinant vectors were shown to be correct through double enzyme digestion and sequencing identification.To electro-transform the pichia pastoris GWDL strain， through G418 resistance flat screening to obtain high expression of high-efficiency strains，the expression product（15 ku） was consistent with the expected results after induced expression， detection of protein content and in vitro antiseptic detection，

we obtained No. SMD1168-pPIC9k-HLZ high titer strain with a titer of 1 907 U/mL;To detect the sample GWDL minimum bacterial concentration （MIC） for five bacteria by using Recombinant human lysozyme preparation，the minimum concentration of micrococcus luteus was better， indicating that recombinant human lysozyme in pichia pastoris successfully expressed，the activity was more stable.

Key words??Pichia pastoris;Strain screening;Efficient expression;Antibacterial activity

溶菌酶是小分子堿性蛋白，因其能有效地降解微生物的細(xì)胞壁，溶解作用較好，不易產(chǎn)生耐藥性，無副作用等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥制劑、食品防腐等多個行業(yè)。溶菌酶可從胎盤中少量提取得到，因提取量較少，有著巨大的應(yīng)用前景[1-3]。

畢赤酵母是一種真核表達(dá)菌株，此系統(tǒng)具有穩(wěn)定性、高效表達(dá)、分泌性等特點(diǎn)，可通過甲醇誘導(dǎo)，提高溶氧量，使得菌株效價更高[4-5]。該研究以畢赤酵母為表達(dá)系統(tǒng)，重組質(zhì)粒，經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化SMD1168，菌株經(jīng)G418抗性篩選，對篩選菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，加大溶氧量提高表達(dá)量，檢測活性，得到畢赤酵母的高效表達(dá)，以期為后期擴(kuò)大培養(yǎng)打下基礎(chǔ)。

1??材料與方法

1.1??材料與試劑

大腸桿菌DH5α、pPIC9K質(zhì)粒、藤黃微球菌、畢赤酵母SMD1168由廣東省微生物種質(zhì)資源庫保存。

PFU Mix、DNA 膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、引物、核酸染色劑、瓊脂糖購自生工生物工程（上海）股份有限公司;T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、G418、DNA Marker、Protein Marker購自TaKaRa公司;酵母抽提物、胰蛋白胨購自英國 Oxoid公司;cDNA合成試劑盒購自Toyobo公司;重組人溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司;瓊脂粉購自廣州環(huán)凱生物科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2??主要儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱，DHZ-DA大容量全溫振蕩器，752N型紫外可見分光光度計，PCR儀，恒溫金屬浴，水平/垂直電泳儀，藍(lán)光切膠儀，顯微鏡，電子天平，pH計等。

1.3??引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank上發(fā)表的人溶菌酶基因成熟肽序列及表達(dá)載體pPIC9k多克隆位點(diǎn)，用DNA star 5.0設(shè)計合成引物C1、引物C2，其中引物C1含有Xho I 酶切位點(diǎn)（下劃線部分），引物C2含有Not I 酶切位點(diǎn)（下劃線部分），插入序列帶有蛋白酶裂解位點(diǎn)，表達(dá)的溶菌酶有天然的N端。

引物C1：CCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAGGTCTTTG;引物C2：CTGCGGCCGCTTACACTCCACAACCTTGAACATA。

1.4??人外周血淋巴細(xì)胞總RNA的提取及cDNA模板的克隆

收集無菌血樣，取 5 ?mL（適量肝素抗凝）。將采得的抗凝血在無菌狀態(tài)下緩慢加入 2倍 Ficoll淋巴細(xì)胞分離液， 2 000 r/min離心10 min，取云霧狀的單核細(xì)胞層;用Trizol法按照試劑盒說明提取人外周血淋巴細(xì)胞總RNA，即得到人淋巴細(xì)胞總RNA;并以總RNA為模板，用cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行cDNA合成反應(yīng)。

1.5??人溶菌酶基因序列的PCR擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，取引物C1、C2（10 μmol/L）各2 μL，PFU Mix ?25 μL，補(bǔ)充雙蒸水至50 μL， PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min;94 ℃30 s，58 ℃30 s ，72 ℃40 s，30個循環(huán);72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)產(chǎn)物分別于1%瓊脂糖凝膠中電泳，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收，回收產(chǎn)物即為人溶菌酶成熟肽基因片段。

1.6??人溶菌酶真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將人溶菌酶基因片段和pPIC9k質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和Not Ⅰ進(jìn)行雙酶切反應(yīng)后，回收酶切產(chǎn)物并進(jìn)行連接反應(yīng)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9k-HLZ。將轉(zhuǎn)化菌落經(jīng)菌落PCR鑒定，提取陽性克隆質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行序列測定。

1.7??重組質(zhì)粒對畢赤酵母SMD1168的轉(zhuǎn)化及篩選

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPIC9k-HLZ，根據(jù)《畢赤酵母表達(dá)手冊》用Sac Ⅰ進(jìn)行單酶切，線性化質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化SMD1168，轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞在無組氨酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)至長出單菌落。挑選轉(zhuǎn)化平板上長出來的菌落，用裂解液進(jìn)行PCR模板制備，利用通用引物α-Factor和3AOX進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將篩選到的陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)濃度逐漸增高的G418抗生素篩選高拷貝克隆，用于表達(dá)目的蛋白。取證實(shí)整合有人溶菌酶目的基因的菌落，為提高目的基因拷貝數(shù)，提取質(zhì)粒進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化，最后將轉(zhuǎn)化菌液涂布于含1 mg/mL G418的YPD平板上，做高抗篩選，依次增加G418抗性平板濃度，篩選高拷貝克隆菌株，篩選菌株標(biāo)記為SMD1168-pPIC9k-HLZ。

1.8??人溶菌酶的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測

將菌株SMD1168-pPIC9k-HLZ每組抗生素濃度分別選擇3株接種到BMGY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后按照10%接種量轉(zhuǎn)接BMMY表達(dá)培養(yǎng)基中用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，于培養(yǎng)的24、48、72 h取表達(dá)上清進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳和抑菌活性檢測。

1.9??重組酵母表達(dá)人溶菌酶抑菌活性測定

1.9.1??重組人溶菌酶抑菌效價測定。將培養(yǎng)好的藤黃微球菌菌液調(diào)整至合適的菌濃，加適量入熔化后的固體檢測培養(yǎng)基中，吸取混合均勻的含菌檢測培養(yǎng)基20 mL，使其在90 mm培養(yǎng)皿底內(nèi)均勻攤布，放置在超凈工作臺上待其凝固。然后用滅菌的打孔器（孔徑4.2 mm）在每個培養(yǎng)皿均勻地打孔，每孔加入20 μL重組畢赤酵母表達(dá)上清，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40～48 h。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：將稀釋好的2萬、1.5萬、1萬、5 000、2 500、1 000標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣于同一個平板上。分別以標(biāo)準(zhǔn)品溶菌圈直徑的平方為橫坐標(biāo)，活性單位的常用對數(shù)值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取待測樣品稀釋，使其活性單位在標(biāo)準(zhǔn)曲線的活性濃度范圍內(nèi)，將樣品的抑菌圈直徑數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品抑菌效價（U/mL）。

1.9.2??重組人溶菌酶制劑對體外常見致病菌的最小抑菌濃度測定。

調(diào)整每管致病菌菌液濃度約為1×106 CFU/mL，使用常量稀釋法，將重組人溶菌酶制劑稀釋成濃度分別為50.200、25.100、12.550、6.275、3.138、1.569、0.784、0.392、0.196、0.098 mg/mL，檢測重組人溶菌酶制劑對藤黃微球菌、大腸標(biāo)準(zhǔn)菌株、大腸桿菌K12D31、巨大芽孢桿菌、沙門氏菌5種菌株抗菌藥物最低抑菌濃度。

2??結(jié)果與分析

2.1??人溶菌酶基因序列的PCR擴(kuò)增

由圖1可知，反轉(zhuǎn)錄后克隆人溶菌酶成熟肽基因序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)有一條清晰的條帶，PCR擴(kuò)增后的溶菌酶成熟肽基因序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)有一條清晰的條帶，與DNA Marker相比，大小位于500 bp左右，帶酶切位點(diǎn)的人溶菌酶基因序列為429 bp，條帶大小相符。

2.2??人溶菌酶真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

從圖2可看出，選取人溶菌酶基因和pPIC9k連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化子，經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增，有明顯條帶，與DNA Marker比對，位于500 bp附近。由于鑒定PCR中采用的是α-Factor和3AOX引物，因此擴(kuò)增出來的片段是583 bp，與PCR檢測的結(jié)果基本相符。將鑒定為陽性克隆的重組子委托上海生工進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果顯示，此基因序列與GenBank上提供的相關(guān)基因序列的同源性為100%。將此步構(gòu)建的重組質(zhì)粒含重組人溶菌酶基因命名為pPIC9k-HLZ。

2.3??重組質(zhì)粒對畢赤酵母SMD1168的轉(zhuǎn)化及篩選

用載體的通用引物α-Factor和3AOX進(jìn)行PCR分析，得到約583 bp的片段，陰性對照無擴(kuò)增片段，表明人溶菌酶基因表達(dá)單元已成功重組到酵母染色體上，獲得了人溶菌酶重組菌株，表型均為His+Mut+（圖3）。獲得的這些菌株可以作為甲醇誘導(dǎo)表達(dá)的菌株。

2.4??表達(dá)蛋白的電泳檢測

分別取重組酵母24、48、72 h的搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)上清做電泳鑒定，同時以空酵母菌SMD1168的誘導(dǎo)上清和空載體pPIC9k轉(zhuǎn)化酵母菌的誘導(dǎo)上清作為對照，進(jìn)行15%SDS-PAGE分析。

將篩選到的高拷貝陽性畢赤酵母重組子SMD1168-pPIC9k-HLZ進(jìn)行搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)，分別取不同時間表達(dá)上清進(jìn)行15%SDS-PAGE電泳。從圖4可以看出，在15 ku左右出現(xiàn)特異蛋白條帶，與預(yù)期分子量16 ku大小基本相符，而陰性對照未重組的SMD1168和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對照SMD1168-pPIC9k未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。光密度掃描結(jié)果顯示，重組人溶菌酶基因重組酵母搖瓶蛋白表達(dá)量在48 h達(dá)到最高，72 h保持穩(wěn)定，可選擇48 h為結(jié)束培養(yǎng)時間。

2.5??抑菌活性檢測

從圖5可看出，溶菌酶的抑菌活性與菌株的抗生素抗性在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，拷貝數(shù)的增加并不能持續(xù)提高溶菌酶的表達(dá)，可能跟宿主菌細(xì)胞的物質(zhì)代謝有關(guān)。選取抗3.0 mg/mL的重組畢赤酵母分泌表達(dá)菌株SMD1168-pPIC9k-HLZ進(jìn)行后續(xù)的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.6??重組人溶菌酶制劑對體外常見致病菌的最小抑菌濃度測定

取抑菌效價為12 000 U/g左右的重組人溶菌酶制劑，測定其對不同致病菌株的MIC。從表1可看出，其對革蘭氏陽性菌有較好的抑菌作用，對革蘭氏陰性菌抑菌作用較差，對藤黃微球菌的最低抑菌濃度最小，抑菌效果最好，對沙門氏菌無抑菌作用，此抑菌數(shù)據(jù)對重組人溶菌酶制劑后期在飼料添加劑領(lǐng)域的應(yīng)用具有指導(dǎo)作用。

3??結(jié)論與討論

該研究成功構(gòu)建載體，整合重組人溶菌酶，通過轉(zhuǎn)化篩選，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，檢測蛋白含量，進(jìn)行體外抑菌檢測，表達(dá)產(chǎn)物15 ku，和預(yù)期結(jié)果一致，篩選得到效價為1 907 U/mL，編號為 SMD1168-pPIC9k-HLZ的高效價菌株;重組人溶菌酶制劑，通過檢測樣品畢赤酵母GWDL對5種菌的最小抑菌濃度（MIC），對藤黃微球菌的最低抑菌濃度最小，抑菌效果最好，對陽性菌有較好的抑菌作用。

畢赤酵母分泌表達(dá)人溶菌酶基因的研究較多，其成分簡單，便于制成溶菌酶基因工程產(chǎn)品，而關(guān)于胞外表達(dá)的研究較少，關(guān)于溶菌酶的研究很多[6-7]。目前，國內(nèi)外人溶菌酶主要是基因工程表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物大多都是包涵體的形式，為保證蛋白分離純化和重組蛋白的活性 ，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)物都分泌于培養(yǎng)上清中，自身所分泌的蛋白較少，比較有利于蛋白分離純化[8] 。但市面上由于致病菌的耐藥性問題日益加劇，抗生素的濫用，導(dǎo)致安全性問題越來越嚴(yán)重。人溶菌酶是人體自身產(chǎn)生的堿性肽類抗菌物質(zhì)，其解決了抗生素濫用引起的耐藥性和藥物殘留問題[9-10]。將溶菌酶添加到飼料中，會大大減低畜禽的發(fā)病率，可提高動物的生產(chǎn)性能。試驗(yàn)重組人溶菌酶，提高菌株活性，在后期大量生產(chǎn)得到高效能產(chǎn)物，減少生產(chǎn)成本。

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