汪添益 張濰平 韓文文 劉 超

先天性腎盂輸尿管連接部梗阻(ureteropelvic junction obstruction,UPJO)是常見的小兒先天泌尿系疾病之一。過去十年，學(xué)者開展了大量UPJO解剖學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)以及分子生物學(xué)等方面的研究，但其確切病因仍存在爭議[1,2]。近年來國內(nèi)外研究表明，UPJO病因包括神經(jīng)支配異常，腎盂輸尿管連接部(ureteropelvic junction,UPJ)平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells,SMCs)功能紊亂、膠原替代以及UPJ間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)異常。最新研究表明，血小板源性生長因子受體-α(platelet-derived growth factor receptor α )陽性細(xì)胞作為一種新型間質(zhì)細(xì)胞，存在于人類腎盂輸尿管連接部。同時該研究發(fā)現(xiàn)PDGFRα陽性細(xì)胞表達(dá)的SK3通道在UPJO患兒中的表達(dá)顯著減少，考慮這一變化可能在UPJO發(fā)病中具有重要作用[3]。然而目前關(guān)于PDGFRα陽性細(xì)胞在UPJO發(fā)病中作用的相關(guān)研究較少，且國內(nèi)尚無文獻(xiàn)報道，因此仍需進(jìn)一步研究證實。本研究通過免疫組織熒光染色方法了解PDGFRα陽性細(xì)胞在UPJ處的分布，并分析其與Cajal細(xì)胞(interstitial cells of Cajal,ICCs)、平滑肌細(xì)胞以及神經(jīng)纖維的作用關(guān)系，探討它們在先天性腎盂輸尿管連接部梗阻發(fā)病中的作用和臨床意義。

材料與方法

一、標(biāo)本來源

于2018年7月至2019年1月收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院泌尿外科因先天性腎積水行腎盂成形術(shù)的單側(cè)腎盂輸尿管連接部狹窄段組織樣本30例為UPJO組，其中男26 例，女4例，中位年齡42個月(5～150個月)。30例均在腎盂成形術(shù)中證實為腎盂輸尿管連接部狹窄。選擇在此期間因腎臟腫瘤行腎輸尿管切除術(shù)患兒的UPJ組織(排除腎盂輸尿管連接部狹窄以及其他泌尿系統(tǒng)畸形，病理結(jié)果證實腫瘤未侵犯腎盂輸尿管交界處)10例作為對照組，其中男3例，女7例，中位年齡27.5個月(2～ 84個月)。每個病例縱行取包含UPJ的組織5～8 mm，置入2%多聚甲醛和 2.5%戊二醛的固定液中，4℃冰箱保存并固定24 h以上。每份標(biāo)本均在腎盂端縫4-0絲線做標(biāo)記。所有入組(包括UPJO組和對照組)患兒監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書，本研究經(jīng)過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(編號：2016-73)。

二、實驗方法

對30例UPJO組和10例對照組的UPJ組織標(biāo)本進(jìn)行免疫熒光染色： ①PDGFRα和C-kit采用免疫熒光雙染，探討PDGFRα陽性細(xì)胞與Cajal細(xì)胞的分布關(guān)系； ②PDGFRα和鬼筆環(huán)肽采用免疫熒光雙染，探討PDGFRα陽性細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞的分布關(guān)系，并對平滑肌細(xì)胞表型進(jìn)行對比分析； ③PDGFRα和PGP9.5免疫熒光雙染，探討PDGFRα陽性細(xì)胞與神經(jīng)纖維的分布關(guān)系； ④PDGFRα和SK3免疫熒光雙染。標(biāo)本石蠟包埋，10 μm厚橫切后，將切片置入65℃烤箱60 min。脫蠟后用10%牛血清白蛋白(Solarbio，中國北京)阻斷30 min，避免非特異性吸收。隨后切片在4℃環(huán)境下、1%牛血清白蛋白稀釋磷酸鹽緩沖液中予一抗孵育一夜。切片用磷酸鹽緩沖液沖洗，與相應(yīng)的二抗或鬼筆環(huán)肽在室溫下孵育1 h(相應(yīng)一抗、二抗種類、來源和濃度等信息見表1)。最后所有切片用4′，6-二脒基-2-苯吲哚鹽酸抗體(4′6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色10 min，用熒光封閉劑沖洗、安裝、封片。

表1 相應(yīng)抗體及鬼筆環(huán)肽信息Table 1 Antibodies and phalloidin for immunofluorescence抗體來源貨號濃度生產(chǎn)廠家一抗 PDGFRα兔ab2034911∶200Abcam,UK C-kit兔ab55051∶200Abcam,UK SK3兔ab286311∶200Abcam,UK PGP9.5兔ab1089861∶200Abcam,UK 鬼筆環(huán)肽兔CA16101∶50solarbio二抗 HRP標(biāo)記山羊 抗兔IgG山羊074-15061∶200Abcam,UK

三、結(jié)果判定

1. 免疫熒光結(jié)果判定：雙盲法下用共焦顯微鏡進(jìn)行獨立評估。采用Vectra Polaris 全自動定量病理成像系統(tǒng)進(jìn)行熒光掃描，并選擇視野進(jìn)行光譜掃描，用inform軟件對光譜進(jìn)行拆分，對免疫熒光強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。20 倍顯微鏡下(放大200倍)每例標(biāo)本用顯微鏡計算機(jī)圖像分析處理系統(tǒng)隨機(jī)截取5處視野圖片測量免疫熒光強(qiáng)度。計算公式：免疫熒光強(qiáng)度=截取區(qū)域抗體積分光密度值/共域化面積。

2. 平滑肌細(xì)胞表型分析：20 倍顯微鏡下(放大200倍)觀察鬼筆環(huán)肽(紅色)染色部分，每例標(biāo)本用顯微鏡計算機(jī)圖像分析處理系統(tǒng)截取5處不同視野。雙盲法下用Image Pro Plus 6.0軟件計算每200倍高倍鏡下截取的每張圖片平滑肌細(xì)胞所占面積百分比，取每例5處平均值。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS21.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。應(yīng)用單樣本K-S檢驗驗證是否正態(tài)分布，應(yīng)用Levene檢驗驗證是否具有方差齊性。對服從正態(tài)分布的計量資料以均值、標(biāo)準(zhǔn)差表示，若為非正態(tài)分布則采用中位數(shù)表示。若資料為正態(tài)且方差齊采用兩獨立樣本t檢驗；若資料為正態(tài)但方差不齊采用t′檢驗；若資料非正態(tài)采用Wilcoxon秩和檢驗。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PDGFRα陽性細(xì)胞的分布

PDGFRα陽性細(xì)胞在UPJ中廣泛分布，呈紡錘形或星形，且環(huán)繞于DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核周圍(圖1)。光鏡下可見PDGFRα陽性細(xì)胞形成離散的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，并分布于尿道上皮細(xì)胞、內(nèi)層環(huán)形肌以及外層縱行肌細(xì)胞之間。而免疫熒光結(jié)果顯示PDGFRα陽性細(xì)胞在UPJO組與對照組之間分布無明顯差異(P=0.30)，見表2。

表2 兩組免疫熒光及平滑肌細(xì)胞表型分析結(jié)果Table 2 Results of fluorescent intensity and phenotypic ana-lysis of SMCs in UPJO group versus control group 指標(biāo)平滑肌細(xì)胞(百分比)神經(jīng)纖維PDGFRα陽性細(xì)胞SK3通道UPJO組69.41±15.443.37±0.593.59±0.21對照組64.03±15.843.73±0.443.82±0.56t值2.416-7.535-2.328P值0.016<0.001 0.026

二、PDGFRα陽性細(xì)胞與Cajal 細(xì)胞的關(guān)系

C-kit抗體廣泛適用于標(biāo)記上尿路Cajal間質(zhì)細(xì)胞，通過免疫熒光雙染法檢測C-kit 抗體是否定位于PDGFRα陽性細(xì)胞。結(jié)果證實，在UPJO組與對照組中，PDGFRα陽性細(xì)胞均分布于Cajal 細(xì)胞附近(圖2)，但卻不同于Cajal細(xì)胞(C-kit陽性細(xì)胞)。

圖1 UPJO組(1A)與對照組(1B)PDGFRα陽性細(xì)胞免疫熒光染色(×200):圖中綠色部分代表PDGFRα表達(dá)陽性，藍(lán)色部分為以DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核。可見PDGFRα陽性細(xì)胞(白色箭頭標(biāo)記)形成離散的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)圖2UPJO組PDGFRα和C-kit免疫熒光雙染(×200)：圖中綠色部分代表PDGFRα表達(dá)陽性，紅色部分代表C-kit表達(dá)陽性，藍(lán)色部分為以DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核

Fig.1 Immunolabeling of PDGFRα in human UPJ (green area) in muscle layers.(A:UPJO group; B:control group).Nuclei were counterstained with DAPI (blue area)Fig.2 Double immunolabeling of PDGFRα (green area) and C-kit (red area) in human UPJ in UPJO group.Nuclei were counterstained with DAPI (blue area)

三、PDGFRα陽性細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞的關(guān)系

鬼筆環(huán)肽廣泛適用于標(biāo)記平滑肌細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，PDGFRα陽性細(xì)胞分布于鬼筆環(huán)肽陽性平滑肌細(xì)胞周圍(圖3)，二者分布關(guān)系密切，平滑肌細(xì)胞在UPJO組分布密度較對照組顯著增加(P=0.016)，見表2。

四、PDGFRα陽性細(xì)胞與神經(jīng)纖維的關(guān)系

泛神經(jīng)元標(biāo)記蛋白基因產(chǎn)物9.5(pan-neuronal marker protein gene product 9.5,PGP9.5)是神經(jīng)纖維中的一種特異性泛素羥基水解酶，可用作神經(jīng)軸突標(biāo)記物，抗PGP9.5抗體則可以與各種無髓或有髓的神經(jīng)纖維相結(jié)合。本研究結(jié)果顯示，光鏡下可見PDGFRα陽性細(xì)胞分布于PGP9.5陽性神經(jīng)纖維周圍(圖3)，神經(jīng)纖維在UPJO組UPJ 組織免疫熒光表達(dá)強(qiáng)度較對照組顯著降低(P<0.001)，見表2。

五、PDGFRα陽性細(xì)胞SK3 通道的表達(dá)

本研究結(jié)果顯示，PDGFRα陽性細(xì)胞的細(xì)胞膜上SK3通道表達(dá)明顯(圖3)。此外，與對照組相比，UPJO組PDGFRα陽性細(xì)胞SK3通道免疫熒光表達(dá)強(qiáng)度顯著降低(P<0.001)，見表2。

討 論

UPJO通常由內(nèi)源性因素引起(約占75%)，最常見的是腎盂輸尿管連接部狹窄(本研究主要針對腎盂輸尿管交界處狹窄，提及的所有UPJO均指此類病變)。過去幾十年來，對UPJO的病因?qū)W研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展。自1893年Santiago Ramony Cajal首次在胃腸道中發(fā)現(xiàn)Cajal間質(zhì)細(xì)胞以來，相關(guān)研究數(shù)量逐漸增多。Solari等[4]首先報道UPJ處Cajal間質(zhì)細(xì)胞密度的降低可能與UPJO發(fā)病有關(guān)，進(jìn)一步的研究則證實UPJ處Cajal間質(zhì)細(xì)胞與內(nèi)層縱行肌纖維平行排列，并與神經(jīng)纖維關(guān)系密切，提示Cajal間質(zhì)細(xì)胞參與神經(jīng)信號傳導(dǎo)，并調(diào)控輸尿管蠕動。同時該研究發(fā)現(xiàn)，UPJO患兒腎盂輸尿管連接部纖維化明顯，因此認(rèn)為Cajal間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的減少與輸尿管蠕動功能的變化相關(guān)[5]。Iino等[6]首次在小鼠胃腸道中發(fā)現(xiàn)一種新型的間質(zhì)細(xì)胞，其本質(zhì)為“成纖維樣細(xì)胞”(即PDGFRα陽性細(xì)胞)，隨后證實PDGFRα陽性細(xì)胞同樣存在于小鼠以及人類膀胱中[7]。近年來，Hunziker等[3]研究證實在人類UPJ處同樣存在PDGFRα陽性細(xì)胞，可能在UPJO發(fā)病中起重要作用。本研究表明在UPJ處至少存在兩種不同的間質(zhì)細(xì)胞，即C-kit陽性細(xì)胞(即Cajal間質(zhì)細(xì)胞)及C-kit陰性細(xì)胞(即PDGFRα陽性細(xì)胞)。免疫熒光結(jié)果顯示PDGFRα細(xì)胞呈梭形或星形，交錯形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，并分布于UPJ內(nèi)層尿道上皮細(xì)胞以及平滑肌肌層之間。

圖3 免疫熒光染色(×200) A1:UPJO組PDGFRα和鬼筆環(huán)肽免疫熒光雙染(圖中綠色部分代表PDGFRα表達(dá)陽性，紅色部分代表鬼筆環(huán)肽表達(dá)陽性); A2:紅色部分為UPJO組鬼筆環(huán)肽免疫熒光染色； A3:紅色部分為對照組鬼筆環(huán)肽免疫熒光染色； B1:UPJO組PDGFRα和PGP9.5免疫熒光雙染(圖中綠色部分代表PDGFRα表達(dá)陽性，紅色部分代表PGP9.5表達(dá)陽性); B2:紅色部分為UPJO組PGP9.5免疫熒光染色； B3:紅色部分為對照組PGP9.5免疫熒光染色； C1:UPJO組PDGFRα和SK3免疫熒光雙染(圖中綠色部分代表PDGFRα表達(dá)陽性，紅色部分代表SK3表達(dá)陽性); C2:紅色部分為UPJO組SK3免疫熒光染色； C3:紅色部分為對照組SK3(紅色)免疫熒光染色。所有圖片藍(lán)色部分為以DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核

Fig.3 Immunofluorescence staining(×200) A1:Double immunolabeling of PDGFRα (green area) and phalloidin (red area) in UPJO; A2:Immunolabeling of phalloidin in UPJO (red area); A3:Immunolabeling of phalloidin in UPJ control (red area); B1:Double immunolabeling of PDGFRα (green area) and PGP9.5 (red area) in UPJO; B2:Immunolabeling of PGP9.5 in UPJO (red area); B3:Immunolabeling of PGP9.5 in UPJ control (red area); C1:Double immunolabeling of PDGFRα (green area) and SK3 (red area) in UPJO; C2:Immunolabeling of SK3 in UPJO (red areas); C3:Immunolabeling of SK3 in UPJ control (red area).Nuclei were counterstained with DAPI (blue area)

UPJO患兒病理可見平滑肌細(xì)胞肥大/增生和萎縮/發(fā)育不全以及神經(jīng)纖維耗竭[1]。與既往研究一致，本研究免疫熒光結(jié)果表明UPJO患兒平滑肌細(xì)胞分布密度較正常兒童顯著增加，而神經(jīng)纖維免疫熒光強(qiáng)度較正常兒童顯著減少，提示存在平滑肌細(xì)胞肥大/增生以及神經(jīng)纖維耗竭。Benedetto等[9]認(rèn)為Cajal間質(zhì)細(xì)胞作為UPJ處起搏細(xì)胞，參與神經(jīng)信號傳導(dǎo)，并調(diào)控平滑肌細(xì)胞收縮。同時有研究表明在小鼠胃腸道，PDGFRα陽性細(xì)胞可導(dǎo)致周圍平滑肌細(xì)胞超極化，從而調(diào)控平滑肌細(xì)胞松弛[10]。因此越來越多學(xué)者認(rèn)為在胃腸道中，PDGFRα陽性細(xì)胞、Cajal 樣細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞分布關(guān)系密切，形成SIP(SMCs-ICCs-PDGFRα positive cells)功能性合胞體，表達(dá)多種離子通道和受體，調(diào)節(jié)神經(jīng)信號傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控平滑肌細(xì)胞收縮[10-12]。同樣，本研究結(jié)果顯示兒童UPJ處PDGFRα陽性細(xì)胞、Cajal間質(zhì)細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞在位置分布上關(guān)系密切，提示形成的SIP功能性合胞體可能共同參與神經(jīng)信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)UPJ處平滑肌細(xì)胞收縮。

既往動物實驗證實，在豚鼠胃腸道及小鼠膀胱逼尿肌組織中存在PDGFRα陽性細(xì)胞豐富表達(dá)的SK3通道[13,14]。SK3通道屬于小電導(dǎo)鈣離子激活鉀離子通道蛋白中的一種亞型，對細(xì)胞膜電位的變化并不敏感，其激活完全依賴胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，激活后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鉀離子外流，通過嘌呤能機(jī)制抑制周圍神經(jīng)傳遞，從而導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞超極化以及平滑肌松弛[13-15]。與既往研究一致，本研究發(fā)現(xiàn)在人類UPJ組織中存在PDGFRα陽性細(xì)胞SK3通道表達(dá)，且相較于對照組，UPJO組患兒PDGFRα陽性細(xì)胞SK3通道表達(dá)顯著減少。Lee[13]發(fā)現(xiàn)，阻斷小鼠膀胱逼尿肌處SK3通道可以誘導(dǎo)PDGFRα陽性細(xì)胞的細(xì)胞膜去極化，并增加周圍平滑肌的張力。結(jié)合本研究結(jié)果，筆者認(rèn)為PDGFRα陽性細(xì)胞與Cajal 間質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞在分布及功能上關(guān)系密切。Cajal間質(zhì)細(xì)胞與PDGFRα陽性細(xì)胞共同調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞，進(jìn)而調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的收縮。而當(dāng)UPJ處PDGFRα陽性細(xì)胞表達(dá)的SK3通道減少，抑制性神經(jīng)傳遞也會減少，導(dǎo)致平滑肌過度收縮，遠(yuǎn)期可能導(dǎo)致神經(jīng)纖維耗竭以及平滑肌細(xì)胞肥大/增生，最終導(dǎo)致腎盂輸尿管連接部蠕動功能的異常。

總之，UPJ處平滑肌細(xì)胞、Cajal樣細(xì)胞、神經(jīng)纖維以及PDGFRα陽性細(xì)胞上SK3通道表達(dá)和分布的改變與UPJO病因密切相關(guān)，但仍需通過更多研究證實這些病理改變與UPJO發(fā)病的因果關(guān)系。