戴朝政, 徐小平

(1. 中國科學院成都有機化學研究所, 四川 成都 610041; 2. 四川大學華西藥學院, 四川 成都 610041)

色譜過程動力學研究通常是把色譜柱簡化為一維空間看待,只考慮各種縱向擴散因素對分離效能的影響。實際上,物質(zhì)在柱內(nèi)的擴散是在三維空間中進行的。組分的徑向擴散改變了分子在柱內(nèi)行進的路線與距離,最終造成譜帶彌散。此外,液相色譜動力學過程研究一般也沒有考慮色譜分析過程中流動相發(fā)熱對柱效能的影響。但是隨著色譜技術(shù)的發(fā)展,吸附劑粒徑越來越小,因而所需要的色譜柱前壓力越來越高,柱壓的升高使流動相通過擔體摩擦生熱,導(dǎo)致柱溫升高。當前采用的UPLC的柱前壓可達100～150 MPa,在這樣高的壓力下，1 mL流動相通過色譜柱因摩擦生熱可達100～150 J。而毛細管電色譜(CEC)以及消滯留層色譜(eliminate stagnant fluid layer chromatography, ESFLC)都要在色譜柱兩端施加電壓,電流通過流動相也會發(fā)熱導(dǎo)致柱溫升高,發(fā)熱現(xiàn)象更加明顯。由于柱邊緣與外界接觸可以散熱,因此柱中心的溫度比柱斷面邊緣要高,可形成一個環(huán)形與中心對稱的溫度梯度。柱中心流動相溫度高、黏度低,故流速快,柱斷面邊緣流動相流速慢。斷面上流速的差異使得柱內(nèi)傳輸?shù)奈镔|(zhì)先后到達檢測系統(tǒng),形成縱向彌散。

20世紀70年代,Horvath和Lin[1,2]運用間隙滯流體模型導(dǎo)出了液相色譜塔板高度方程(公式符號意義和推導(dǎo)過程請見參考文獻[3]):

(1)

公式1沒有考慮在色譜過程中物質(zhì)的徑向擴散和流動相發(fā)熱升溫對塔板高度的影響。但隨著色譜技術(shù)的發(fā)展,必須要考慮柱發(fā)熱與升溫以及物質(zhì)的徑向擴散與塔板高度的關(guān)系。在此,筆者從熱傳導(dǎo)方程出發(fā),推導(dǎo)了包含徑向擴散和流動相發(fā)熱升溫因素在內(nèi)的液相色譜塔板高度公式。該公式既可描述傳統(tǒng)的HPLC也可以概括UPLC、CEC、ESFLC塔板高度方程，為液相色譜技術(shù)進一步發(fā)展提供指導(dǎo)意見。

1 基礎(chǔ)知識

理論上UPLC、CEC、ESFLC與HPLC除流動相驅(qū)動力的大小和方式不同,色譜過程并無實質(zhì)性差別,上述色譜過程柱發(fā)熱原理雖然有所不同,也只是熱源密度函數(shù)的表述不同。因此塔板高度統(tǒng)一公式需在公式1的基礎(chǔ)上補充流動相在柱內(nèi)溫度分布場和徑向擴散對柱效率的影響。

徑向擴散與流動相流型有關(guān),流動相流型又與柱內(nèi)溫度分布場有關(guān)。如果徑向擴散對塔板高度的貢獻為H徑,塔板高度公式應(yīng)是在公式1的基礎(chǔ)上加上H徑項,而H徑項中概括了流動相流型和溫度分布場的貢獻。根據(jù)色譜過程動力學理論,H徑與相應(yīng)的徑向擴散系數(shù)D徑關(guān)系為[3]:

(2)

其中,D徑為因徑向擴散和溫度場的存在形成譜帶彌散的擴散系數(shù),ν為譜帶在柱內(nèi)移動的速度。

2 理論推導(dǎo)

徑向擴散是在流動相中進行的,因此與流動相流型有關(guān)。流動相流型又與柱內(nèi)的溫度分布有關(guān)。因此首先要考慮色譜過程進行時，柱內(nèi)溫度是如何分布的。

2.1 均勻發(fā)熱無限長度圓柱體內(nèi)溫度場的平衡分布

通過經(jīng)典的熱傳導(dǎo)方程[4],可解得在均勻內(nèi)熱源情況下，溫度(T)沿柱截面徑向分布函數(shù)為：

(3)

式中,r0為柱內(nèi)半徑,r為離軸心的距離;T0為柱內(nèi)壁的平衡溫度;K為與熱強度、熱傳導(dǎo)系數(shù)有關(guān)的常數(shù)。對于液體溶劑摩擦生熱有：

(4)

(5)

K與電場強度E平方成正比,與流動相的熱導(dǎo)效率λc、摩爾電導(dǎo)率λi、摩爾濃度ci,以及流動相在柱斷面占有分數(shù)κ1有關(guān)(由于擔體內(nèi)部的流動相可導(dǎo)電,此處流動相在柱斷面占有分數(shù)κ1與通常理解的流動相在柱斷面占有分數(shù)κ1數(shù)值上略微不同)。

2.2 溫度場對譜帶彌散的影響

溫度的差異可以導(dǎo)致流動相黏度產(chǎn)生變化，從而引起流動相流速徑向分布產(chǎn)生差異。在溫度差不太大的情況下,Knox[5]指出,液體的黏度與溫度的關(guān)系為:

η=η0exp(α×ΔT)

(6)

其中,η0為流動相的溫度為T0時的黏度;α為流動相黏度的溫度系數(shù)。由于流動相線速度與黏度成反比,考慮到公式3,色譜柱內(nèi)流動相線速度的徑向分布函數(shù)為:

(7)

×exp(Kr2α)=Aexp(Kr2α)

(8)

其中常數(shù)(A)為:

(9)

2.3 徑向彌散系數(shù)D徑對塔板高度的貢獻

|Kr2α|遠小于1,因此有如下公式:

u(r)-ν(r)≈A(1+Kr2α)

(10)

以下把上式中u(r)和ν(r)簡寫為u和ν,則有如下公式[6]:

(11)

(12)

(13)

進一步解得到:

(14)

(15)

(16)

最后得到考慮到徑向擴散和熱效應(yīng)的液相色譜塔板高度統(tǒng)一公式:

(17)

3 結(jié)果與討論

圖1 (a)塔板高度與流動相線速度的關(guān)系和(b)Horvath和Lin曲線Fig. 1 Relationship of plate height (H) and the linear velocity of mobile phase (u)and (b) Horvath and Lin’s curve

從公式17最后一項可以看出,徑向擴散項與柱內(nèi)徑r0密切相關(guān),在高流動相線速度的情況下,采用細粒徑的擔體與細內(nèi)徑的色譜柱相配才會實現(xiàn)高效。這也就是隨著時代的發(fā)展,分析型色譜柱內(nèi)徑越來越細的原因。

(18)

圖2 毛細管內(nèi)半徑為(a)50 μm和(b)160 μm時流動性線速度與塔板高度的關(guān)系[10]Fig. 2 Relationship between u and H with radius of (a) 50 μm and (b) 160 μm[10]

毛細管電色譜在柱兩端施加了較高電壓,電場強度E值較高,往往可達1 000 V/cm,因此K值較大,流動相在柱內(nèi)發(fā)熱嚴重,導(dǎo)致毛細管電色譜只能使用內(nèi)徑較細的色譜柱才能實現(xiàn)高效。研究人員對電色譜塔板高度方程進行了考察(見圖2)[10]。實驗采用P/ACE5010電泳儀和Trisep-2000GV毛細管三用電泳儀,流動相5 mmol/L磷酸水溶液(pH 9)-乙腈(20∶80, v/v),恒溫箱溫度20 ℃,自制整體柱[11,12]柱長30 cm,填充長度21 cm,紫外檢測波長214 nm。實驗采用50 μm與160 μm內(nèi)徑的色譜柱進行比較,在相同條件下,發(fā)現(xiàn)柱效與毛細管內(nèi)徑密切相關(guān)。柱內(nèi)徑增大熱效應(yīng)明顯增加,導(dǎo)致柱效急劇下降,結(jié)論與理論相符。

以綠原酸為試樣,色譜柱采用ODS帶金屬螺帽塑料柱(35 mm×3.5 mm, 5 μm),以0.3%(v/v)甲醇水溶液-乙腈(92∶8, v/v)為流動相,施加不同消滯留層電場強度時柱塔板高度見圖3。當電場強度E=0時,相當于HPLC由于存在吸附劑顆粒表面滯留層對傳質(zhì)的影響,塔板數(shù)較低,總塔板數(shù)為1 552(塔板高度23 μm)。在柱兩端施加消滯留層電壓后,由于擔體表面電滲流的形成,滯留層消失,公式17中滯留層項的貢獻也隨之消失。當E<10 V/cm時,柱溫提高不很明顯,可以看到消滯留層的效果,最高塔板數(shù)達到1 795(塔板高度19.5 μm)。繼續(xù)升高消滯留電場強度(E>25 V/cm),電場的熱效應(yīng)對塔板高度的影響則有所體現(xiàn),柱效開始下降。繼續(xù)升高電壓塔板高度非線性急劇上升。因此,進一步提高電壓會使柱效降低,以至柱效率崩潰。

圖3 消滯留層電場強度與塔板高度的關(guān)系Fig. 3 Relationships of eliminate stagnant fluid layer electric field strength and plate height

圖4是分析同一樣品時色譜柱施加消滯留層電壓與不施加消滯留層電壓的電譜圖?？梢钥闯?施加消滯留層的電壓后，目標物峰形變狹窄,柱效增加。

圖4 施加消滯留層電壓后峰形寬度的變化Fig. 4 Variation of peak shape width after application of residual layer voltageSample: combretastatin A4 phosphate (CA4P).

4 結(jié)論

填充柱色譜過程動力學研究了幾十年,但研究工作者往往把色譜柱作為一維空間考慮,注意力集中在物質(zhì)輸運過程中縱向擴散對柱效率的影響,而沒有認識到物質(zhì)在柱內(nèi)徑向擴散對塔板高度的貢獻。實際上在色譜過程中,物質(zhì)的輸運是在三維空間進行的。組分在柱內(nèi)的輸運過程中,不但會在縱向(z軸)擴散,而且會沿徑向(x、y軸)擴散。徑向擴散使得不同的分子有不同的行進路線。此外由于溫度場的影響,流動相線速度在柱斷面分布的差異,最終導(dǎo)致色譜峰形的擴張。

本文從熱傳導(dǎo)方程出發(fā)，在Horvath和Lin公式的基礎(chǔ)上推導(dǎo)了包含徑向擴散因素及溫度場在內(nèi)的液相色譜塔板高度統(tǒng)一方程。此方程概括了HPLC、UPLC、CEC、ESFLC色譜過程動力學中各種因素對塔板高度的影響。從上述公式可見,色譜過程中發(fā)生的徑向擴散和色譜柱的發(fā)熱也是影響色譜分離效能的重要因素。液相色譜的H/u曲線并非過去認為的V型線而是U型線;過高的流動相線速度將導(dǎo)致柱效率崩潰;尤其是高流速、高壓情況下柱效與柱內(nèi)徑密切相關(guān)。

(19)

毛細管氣相色譜的Golay方程已經(jīng)考慮了流動相流型對縱向擴散的影響[6],故不再贅述。