陳興連, 林 濤, 劉興勇, 梅文泉, 王 麗,耿慧春, 程 龍, 汪祿祥*

(1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(昆明), 云南 昆明 650205; 2. 上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司, 上海 200335)

隨著現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)呈集約化和規(guī)?；l(fā)展,水產(chǎn)生物疫情的爆發(fā)頻率也逐漸增高,為了治療和預(yù)防水產(chǎn)生物病蟲害,以及減少高密度飼養(yǎng)帶來的風(fēng)險(xiǎn),養(yǎng)殖過程中常使用磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類、硝基呋喃類等抗生素及三苯甲烷類獸藥。這些藥物抗菌效果好,價(jià)格低廉,部分藥等效替代品少,而使用者和經(jīng)營者對(duì)這些藥物的毒性和危害認(rèn)識(shí)不足,導(dǎo)致超量和超種類的濫用、誤用、違規(guī)使用,以及不遵守休藥期等現(xiàn)象屢禁不止[1-4],由此引起水產(chǎn)品中獸藥的殘留、超標(biāo)現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。大量獸藥污染的水產(chǎn)品經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體后,會(huì)破壞人的造血系統(tǒng),導(dǎo)致毒性損傷、激素障礙變態(tài)反應(yīng)、過敏反應(yīng)及細(xì)菌耐藥性等危害[5,6]。復(fù)旦大學(xué)相關(guān)研究人員還認(rèn)為抗生素的暴露模式可能是促進(jìn)脂肪生成并導(dǎo)致兒童肥胖的危險(xiǎn)因素之一[7]。我國農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告將三苯甲烷類、氯霉素和硝基呋喃類列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥,而磺胺類、喹諾酮類、甲砜霉素、氟甲砜霉素列為水產(chǎn)養(yǎng)殖限用藥。目前,食品安全監(jiān)督機(jī)構(gòu)以及相關(guān)企業(yè)將這5類獸藥作為日常檢測(cè)項(xiàng)目進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)控?？兹甘G及硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)迅速代謝,而與蛋白結(jié)合的代謝物在生物體內(nèi)能長期穩(wěn)定存在[8],因此常通過檢測(cè)其代謝物以反應(yīng)樣品真實(shí)的藥物殘留情況。

測(cè)定獸藥殘留的現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法[9-15]多按照化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的同族或單一藥物來測(cè)定。雖樣品前處理方法適合多類基質(zhì),但完成一個(gè)樣品中不同類獸藥檢測(cè)需經(jīng)幾次前處理,檢測(cè)成本高,周期長,造成儀器設(shè)備、人員浪費(fèi),也難以滿足愈來愈多突發(fā)事件的應(yīng)急監(jiān)控需要[16,17]。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)在滿足多組分同時(shí)檢測(cè)的情況下仍具有選擇性強(qiáng)、基質(zhì)干擾小、靈敏度和檢測(cè)效率高等優(yōu)勢(shì),是近幾年來水、土、動(dòng)物源性食品及排泄物等基質(zhì)中多類獸藥殘留快速測(cè)定的首選[18-25]。盡管同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中多類獸藥殘留也有較多文獻(xiàn)報(bào)道[26-28],但同時(shí)測(cè)定磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類、硝基呋喃類代謝物、孔雀石綠、隱色孔雀石綠的文獻(xiàn)鮮有報(bào)道,且國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全例行監(jiān)測(cè)要求水產(chǎn)品(魚、蝦)測(cè)定這5類獸藥。因此,迫切需要建立水產(chǎn)品中這5類獸藥的快速檢測(cè)方法。

本研究通過優(yōu)化樣品前處理方法、色譜及質(zhì)譜條件,建立了同時(shí)提取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速測(cè)定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物、喹諾酮類、磺胺類、三苯甲烷類、氯霉素類共5類28種藥物的新方法。該方法對(duì)提高水產(chǎn)品監(jiān)管工作效率、節(jié)約檢測(cè)成本、保障食品安全具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

1290超高效液相色譜儀、ZORBAX C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm)(美國Agilent公司); QTRAP 5500三重四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司);渦旋振蕩器(美國Thermo公司); JD200-2電子天平(沈陽龍騰電子有限公司); TGL-15 B型高速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國海道爾夫公司)。

表 1 28種獸藥、12種同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

DP: declustering potential; CE: collision energy; * quantitative ion.

本實(shí)驗(yàn)所用溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(見表1)均購于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心(北京), 7種喹諾酮類、12種磺胺類、4種硝基呋喃類代謝物的質(zhì)量濃度均為10 mg/L, 3種氯霉素類藥物的質(zhì)量濃度均為100 mg/L,其余物質(zhì)的質(zhì)量濃度均為5 mg/L。

甲醇、乙腈(色譜純,德國Merck公司);甲酸(色譜純,美國Sigma公司);乙酸銨、氯化鈉、正己烷(分析純,上海國藥集團(tuán));磷酸氫二鉀(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司);純凈水(杭州娃哈哈公司);N-丙基乙二胺(PSA)、C18、氨基鍵合硅膠填料(NH2, 50 μm)(中國迪馬科技有限公司);二甲亞砜(分析純,天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司); 2-硝基苯甲醛(純度>98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);鹽酸(優(yōu)級(jí)純,上海國藥集團(tuán))。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

用甲醇稀釋各獸藥溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)物質(zhì):氯霉素、喹諾酮類、磺胺類、硝基呋喃類代謝物配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/L,甲砜霉素和氟甲砜霉素配制成質(zhì)量濃度為10.0 mg/L,其他物質(zhì)配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于4 ℃避光保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1提取

稱取5.00 g(精確至0.01 g)均質(zhì)試樣,置于50 mL塑料離心管中,依次加入13.0 mL 0.2 mol/L鹽酸和0.05 mL 0.16mol/L 2-硝基苯甲醛溶液,置于37.0 ℃恒溫振蕩器中保持16 h,取出冷卻至室溫,再加入6～8 g氯化鈉、15.0 mL乙腈,渦旋提取5～7 min,以5 000 r/min離心3 min,取出上清液,再加入15.0 mL乙腈重復(fù)提取一次,合并兩次提取液,待凈化。

1.3.2凈化

向提取液中加入5～6 mL正己烷,渦旋1 min,以5 000 r/min離心3 min,取出乙腈層濃縮至干,加入1.0 mL甲醇復(fù)溶,待凈化。

取50 mg C18、30 mg PSA及60 mg NH2吸附材料,置于50 mL離心管中,加入2.0 mL甲醇,渦旋30 s后去除上清液,將上述1.0 mL待凈化溶液轉(zhuǎn)移至離心管中,渦旋1 min,取上清液過0.22 μm濾膜,待UHPLC-MS/MS測(cè)定。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

采用正交試驗(yàn)方差分析方案[1]，研究播種架傾角、種勺線速度、種勺空間尺寸與播種架播種性能指標(biāo)之間的關(guān)系，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，分析影響播種質(zhì)量上述3因素中的主要因素；再用綜合加權(quán)分析法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的參數(shù)范圍。

色譜柱:ZORBAX C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:35 ℃;流速:0.2 mL/min;進(jìn)樣量:2.0 μL。

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素:流動(dòng)相A為水,B為甲醇。梯度洗脫程序?yàn)?～3.0 min, 5%B～95%B; 3.0～6.0 min, 95%B; 6.0～6.5 min, 95%B～5%B; 6.5～8.5 min, 5%B。

其他化合物:流動(dòng)相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液(含0.1 mmoL/L乙酸銨), B為乙腈。梯度洗脫程序?yàn)?～3.0 min, 5%B～30%B; 3.0～4.0 min, 30%B～40%B; 4.0～6.0 min, 40%B～95%B; 6.0～8.0 min, 95%B; 8.0～8.2 min, 95%B～5%B; 8.2～10.0 min, 5%B。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:ESI源;離子源溫度:550 ℃;噴霧氣(GS1)壓力:0.379 MPa;輔助加熱氣(GS2)壓力:0.379 MPa;氣簾氣壓力:0.241 MPa。氯霉素類藥物為負(fù)離子模式掃描,噴霧電壓:-4 500 V;監(jiān)測(cè)模式:-MRM;磺胺類、喹諾酮類、孔雀石緑、隱色孔雀石緑、硝基呋喃類代謝物為正離子模式掃描,噴霧電壓:5 500 V;監(jiān)測(cè)模式:+MRM。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜條件中的去簇電壓和碰撞能量對(duì)離子豐度具有較大影響,對(duì)方法靈敏度有決定性作用。去簇電壓過低時(shí)難以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物與被其吸附的溶劑分子的去簇;過高時(shí)離子碎裂,導(dǎo)致源內(nèi)裂解。碰撞能量過高時(shí),由母離子生成的碎片過多,子離子響應(yīng)過低;碰撞能量過低時(shí),不能生成所需的子離子。同一離子在不同型號(hào)儀器上所需的去簇電壓和碰撞能量也不盡相同,本實(shí)驗(yàn)通過針泵以流動(dòng)注射的方式對(duì)1.2節(jié)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析,為每個(gè)待測(cè)藥物選取響應(yīng)最高的兩對(duì)離子對(duì)及相應(yīng)的最佳去簇電壓和碰撞能量,并根據(jù)各離子對(duì)的響應(yīng)高度確定定量與定性離子對(duì),相關(guān)參數(shù)見表1。

2.1.2色譜條件優(yōu)化

流動(dòng)相對(duì)化合物的離子化效率、色譜峰形、峰高和分離效果都有較大影響。由于這5類藥物結(jié)構(gòu)中含有叔氨基、強(qiáng)堿性基團(tuán)等,易與色譜填料中殘余的硅醇基產(chǎn)生氫鍵作用,造成色譜峰拖尾、展寬,以及保留時(shí)間漂移等現(xiàn)象[1],為了盡可能提高藥物分離度,實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)相似化合物及同分異構(gòu)體的分離,減少雜質(zhì)峰干擾,提高化合物響應(yīng),實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了優(yōu)化,選擇甲醇、乙腈為有機(jī)相,同時(shí)在水相中添加甲酸、乙酸銨,考察分離效果。

實(shí)驗(yàn)還考察了以乙腈為有機(jī)相,水相中分別加入乙酸銨、甲酸及二者均加入時(shí)4類藥物的色譜行為及靈敏度。結(jié)果表明,水相中只加入乙酸銨或甲酸時(shí)部分藥物峰響應(yīng)較低,部分峰形差且展寬嚴(yán)重,乙酸銨和甲酸均加入時(shí)4類藥物的峰形及靈敏度均較好。可能原因是甲酸可提供ESI源在Q1四極桿內(nèi)離子化所需的H+,促進(jìn)了[M+H]+峰形成的同時(shí)抑制了目標(biāo)化合物[M+Na]+峰的形成。此外,流動(dòng)相在弱酸性環(huán)境條件下加入適量乙酸銨可以再次提高待測(cè)物離子化效率,且乙酸銨的加入還能夠調(diào)節(jié)溶液的離子強(qiáng)度,致使色譜峰形更加對(duì)稱[4,7]。經(jīng)對(duì)甲酸體積分?jǐn)?shù)和乙酸銨濃度的考察,最終選擇乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(含0.1 mmoL/L乙酸銨)為流動(dòng)相。

(2)在ESI-模式下測(cè)定3種氯霉素類藥物。采用乙腈為流動(dòng)相測(cè)定時(shí),草魚等部分樣品中藥物受雜質(zhì)峰干擾大于甲醇。此外,水相中無論加氨水還是乙酸銨,樣品中藥物響應(yīng)均較純水時(shí)低。因此最終選擇甲醇-水為流動(dòng)相。

優(yōu)化后的28種藥物的MRM色譜圖見圖1。

圖2 不同水解液對(duì)羅非魚中28種獸藥峰響應(yīng)強(qiáng)度的影響Fig. 2 Effect of different hydrolysates on the peak response intensities of the 28 veterinary drugs in tilapia samples

圖1 28種獸藥的MRM總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of the 28 veterinary drugs in MRM mode a. sulfonamides, quinolones, malachite green, leucomalachite green and nitrofuran metabolites; b. chloramphenicols.

2.2 樣品前處理?xiàng)l件

喹諾酮類、硝基呋喃類代謝物等部分藥物在肌體內(nèi)與蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的結(jié)合作用,但經(jīng)適當(dāng)?shù)乃峄驂A水解后可游離出來[29,30]。因此本實(shí)驗(yàn)通過選擇水解液、優(yōu)化提取條件和凈化材料等將水產(chǎn)品中5類藥物同時(shí)提取和凈化。

2.2.1樣品水解液

以羅非魚為例,添加同等濃度的獸藥標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后分別用10.0 mL 0.2 mol/L鹽酸溶液、甲酸溶液及1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液水解,衍生化反應(yīng)后提取、測(cè)定,考察各藥物的峰響應(yīng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,采用甲酸溶液水解時(shí),大部分藥物的響應(yīng)低于采用磷酸氫二鉀及鹽酸溶液時(shí)的響應(yīng)。采用磷酸氫二鉀溶液水解時(shí),氨基脲不出峰,且氯霉素類、孔雀石綠及代謝物、大多喹諾酮類、硝基呋喃類代謝物的響應(yīng)低于鹽酸溶液(見圖2)。因此本實(shí)驗(yàn)最終選擇0.2 mol/L鹽酸為樣品的水解液。

實(shí)驗(yàn)還考察了0.2 mol/L鹽酸溶液的加入體積(5.0、7.0、9.0、11.0、13.0、15.0和17.0 mL)對(duì)28種獸藥提取效率的影響。結(jié)果表明,當(dāng)鹽酸加入量少時(shí),部分藥物及內(nèi)標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)(ME)較強(qiáng),提取效率偏低,氯霉素、AMOZ等受雜質(zhì)峰干擾較大。隨著加入鹽酸體積的增大,雜質(zhì)干擾逐漸減小,大多藥物及內(nèi)標(biāo)物的提取效率逐漸增高,當(dāng)鹽酸用量為13.0 mL時(shí)，大多數(shù)藥物回收率達(dá)到最佳且干擾最小,當(dāng)鹽酸用量超過13 mL時(shí),由于水相過多不利于部分藥物提取,導(dǎo)致提取效率降低。綜合考慮各種藥物提取效率及雜質(zhì)干擾情況,最終確定水解液體積為13.0 mL。

2.2.2提取條件優(yōu)化

多類殘留藥物同時(shí)檢測(cè)的難點(diǎn)在于提取試劑種類、提取試劑酸堿度、提取次數(shù)的選擇。標(biāo)準(zhǔn)方法[15]測(cè)定硝基呋喃代謝物時(shí),衍生化反應(yīng)后需將樣品的pH值調(diào)至7.0～7.5,因此本實(shí)驗(yàn)考察了磷酸氫二鉀溶液加入量與提取試劑、提取次數(shù)3個(gè)因素對(duì)28種藥物回收率的影響,每個(gè)因素取3個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)(見表2)。

表 2 正交實(shí)驗(yàn)條件

結(jié)果表明,對(duì)于磺胺類、喹諾酮類、三苯甲烷類、氯霉素類4類藥物而言,提取次數(shù)2次最好,其中部分藥物提取1次時(shí)回收率只有50%左右,而提取3次干擾雜質(zhì)峰較多;磷酸氫二鉀溶液加入0 mL時(shí)回收率最好,加入13 mL和26 mL時(shí)回收率相差不大;采用提取試劑乙腈時(shí)回收率最好,因此上述4類藥物的最優(yōu)方案為A2B1C2。對(duì)于硝基呋喃類代謝物,以上因素組合的27種方案中,采用A1B2C2與A2B1C2時(shí),藥物的回收率及峰響應(yīng)高度均優(yōu)于其他25種方案,雖A1B2C2部分藥物響應(yīng)值略高于A2B1C2,但回收率采用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算,二者相差不大,且檢出限仍低于標(biāo)準(zhǔn)方法[15]。通過綜合分析,最終確定同時(shí)提取28種藥物的提取方案為A2B1C2，即采用乙腈提取2次。

由于樣品加入13.0 mL鹽酸水解時(shí)將大量的水帶入了提取液中,而乙腈與水混溶,若不將水去除,則難以將提取液濃縮至干,因此于樣品中加入提取試劑的同時(shí)再加入6～8 g氯化鈉至水相飽和,離心后取乙腈濃縮。與標(biāo)準(zhǔn)法[12-14]相比,不僅可大大減少濃縮時(shí)間,且由于在鹽析作用下,提取液中大量的雜質(zhì)沉淀于水相,因此還避免了濃縮時(shí)大量起泡的缺陷及泡沫溢出對(duì)目標(biāo)物帶來的損失,也減少了雜質(zhì)對(duì)儀器的污染及對(duì)藥物峰的干擾。

2.2.3凈化條件優(yōu)化

樣品采用1.3.1節(jié)方法提取后將提取液濃縮至近干,加1.0 mL甲醇定容,過膜后上機(jī)測(cè)定。結(jié)果顯示,部分藥物回收率超出70%～120%范圍;部分樣品中氨基脲、氯霉素、氟甲砜霉素的色譜響應(yīng)較低且受雜質(zhì)峰干擾嚴(yán)重;不同批次的草魚、鯉魚中隱色孔雀石綠色譜響應(yīng)的重復(fù)性較差?？赡茉蚴腔|(zhì)中的雜質(zhì)與目標(biāo)物相互競(jìng)爭(zhēng)電離或目標(biāo)物隨基質(zhì)共流出所致[31],而選擇合適的凈化方式及凈化材料除去雜質(zhì)可降低基質(zhì)效應(yīng),減少共流出。

圖3 去除凝膠狀物(a)前、(b)后草魚中氯霉素的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of chloramphenicol in grass carp (a) before and (b) after removing gelatinous substance

本文考察了正己烷液液萃取及分散固相萃取凈化的效果。結(jié)果表明,經(jīng)正己烷凈化后,氯霉素、氨基脲及氟甲砜霉素的回收率有較大提高,實(shí)驗(yàn)還觀察到,提取液加入正己烷，經(jīng)渦旋、離心后離心管底部聚集了一層凝膠狀物質(zhì),將去除凝膠狀物前、后的色譜圖進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)去除凝膠狀物后,氯霉素、氨基脲及氟甲砜霉素的色譜響應(yīng)顯著增高,而干擾峰大大降低,從而推測(cè)氯霉素、氨基脲及氟甲砜霉素的干擾峰及基質(zhì)抑制效應(yīng)是該凝膠狀物所致。以草魚中氯霉素為例的色譜圖見圖3。

此外,由于C18、PSA、NH2對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)、脂類、脂肪酸及強(qiáng)極性雜質(zhì)等有較好的吸附效果,實(shí)驗(yàn)根據(jù)樣品基質(zhì)的特點(diǎn),將正己烷凈化后的提取液濃縮至近干,甲醇定容后再加入不同比例的C18、PSA與NH2材料(三者混合后加2.0 mL甲醇潤洗,去除上清液)分散固相萃取凈化,當(dāng)三者用量分別為50、30和60 mg時(shí),隱色孔雀石綠的色譜響應(yīng)值趨于穩(wěn)定,28種獸藥回收率均在70%～120%范圍內(nèi)。

因此,本實(shí)驗(yàn)最終選擇向提取液中加入5～6 mL正己烷,經(jīng)渦旋、離心、去除正己烷及凝膠狀物后再采用50 mg C18、30 mg PSA和60 mg NH2填料進(jìn)行分散固相萃取凈化。

表 3 28種獸藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

y: peak area ratio of analyte to the internal standard;x: mass concentration of analyte, μg/L.

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是影響結(jié)果準(zhǔn)確性的一個(gè)重要因素,常被用于評(píng)價(jià)樣品前處理方法,基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng),方法的準(zhǔn)確性越低。本文以例行監(jiān)測(cè)抽樣數(shù)量較大的鯉魚、草魚、羅非魚、對(duì)蝦等8種陰性樣品(下同)為基質(zhì),通過(基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-1)×100%來計(jì)算28種獸藥的基質(zhì)效應(yīng),以評(píng)價(jià)基質(zhì)中干擾物對(duì)目標(biāo)分析物信號(hào)的影響。結(jié)果表明,28種獸藥中,大多數(shù)獸藥的|ME|在0～20%之間,為弱基質(zhì)效應(yīng),約3%獸藥的|ME|在20%～50%之間,為中等基質(zhì)效應(yīng)(見附表1,詳見https.//www.chrom-China.com)。表明采用該方法測(cè)定魚、蝦中本實(shí)驗(yàn)考察的28種殘留獸藥時(shí)基質(zhì)干擾較小。

2.3.2線性范圍和檢出限

配制5類獸藥的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,以目標(biāo)化合物定量離子與其內(nèi)標(biāo)物峰面積之比對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸,同時(shí)以陰性魚和蝦樣品為基質(zhì),以3倍和10倍信噪比對(duì)28種藥物進(jìn)行檢出限和定量限的考察,結(jié)果見表3。28種獸藥在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系較好,相關(guān)系數(shù)(r)>0.99,檢出限和定量限分別為0.1～0.8 μg/kg和0.3～2.7 μg/kg,與標(biāo)準(zhǔn)方法[12-15]相比,本方法具有更高的檢測(cè)靈敏度。

2.3.3回收率和精密度

分別添加約1、5、20倍定量限水平的28種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于魚和蝦陰性樣品中,進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn),每個(gè)樣品基質(zhì)做6次平行試驗(yàn),計(jì)算其平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(見附表2)。結(jié)果表明,5類獸藥的平均回收率為70.0%～120%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～10.0%。

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證方法的可行性,應(yīng)用所建立的方法對(duì)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定有恩諾沙星(54.3 μg/kg)、AOZ(0.34 μg/kg)、SEM(0.79 μg/kg)檢出的鯽魚、鯉魚、蝦樣品進(jìn)行檢測(cè),定性結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法相同,其中恩諾沙星、AOZ及SEM含量分別為54.9、0.31和0.69 μg/kg,表明本方法可用于魚、蝦中5類禁、限用獸藥的測(cè)定。

3 結(jié)論

本文建立方法通過一次前處理完成了不同性質(zhì)的5類獸藥的提取和凈化,解決了水產(chǎn)品例行監(jiān)測(cè)完成這5類藥物測(cè)定需采用4種前處理及儀器分析方法的難題,可在短時(shí)間內(nèi)完成大批量樣品的檢測(cè),大大降低了檢測(cè)成本,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可為食品檢驗(yàn)監(jiān)督機(jī)構(gòu)對(duì)魚、蝦中禁、限用獸藥殘留的測(cè)定提供更簡(jiǎn)便、快捷、廉價(jià)的技術(shù)支持。