李亞夢(mèng), 甘金華, 李晉成, 吳立冬, 李 芹, 肖雨詩(shī), 彭 婕, 陳建武, 劉 歡*

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100141; 3. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水魚(yú)類種質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(武漢), 湖北 武漢 430223)

多菌靈(carbendazim)屬于苯并咪唑類藥物,是一種農(nóng)業(yè)上常用的高效低毒內(nèi)吸性殺菌劑[1],同時(shí)也是苯菌靈、甲基硫菌靈等同類殺菌劑的共同降解物,其作用機(jī)理是干擾病原菌有絲分裂中紡錘體的形成,影響細(xì)胞分裂,起到殺菌作用[2]。在水稻生產(chǎn)過(guò)程中,多菌靈廣泛用于防治水稻紋枯病[3]、稻瘟病[4]、惡苗病[5]。使用方法主要為拌種、葉面噴灑和土壤處理,從而會(huì)對(duì)稻田水體和底泥造成污染。有研究表明,多菌靈對(duì)水生動(dòng)物具有一定的毒性[6],隨著新型生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)發(fā)展模式——稻漁綜合種養(yǎng)的推廣,其進(jìn)入水源環(huán)境后,會(huì)對(duì)與水稻共作的克氏原螯蝦產(chǎn)生不良影響。

目前多菌靈的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[7,8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9,10]、免疫分析法[11,12]以及分光光度法[13,14]等。與其他方法相比,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)低濃度分析物有較高的靈敏度和選擇性。當(dāng)前,已有相關(guān)報(bào)道研究了多菌靈在水果[15,16]、蔬菜[17,18]、水稻[19]、土壤[20]、蜂王漿[21]等基質(zhì)中的殘留分析方法,而在水產(chǎn)品中多菌靈的殘留檢測(cè)方法尚未報(bào)道。近年來(lái),克氏原螯蝦具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和消費(fèi)需求,為避免多菌靈通過(guò)食物鏈從水產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到人體,給人們帶來(lái)膳食風(fēng)險(xiǎn),建立多菌靈在水產(chǎn)品中的檢測(cè)方法十分有必要。

本文基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了典型殺菌劑多菌靈在克氏原螯蝦中的確證性方法。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高,為提高克氏原鰲蝦養(yǎng)殖過(guò)程中多菌靈監(jiān)控能力,保障克氏原鰲蝦質(zhì)量提供了技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

QTRAP5500高效液相色譜-三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀(美國(guó)SCIEX公司); Analyst工作站;W-SPE24手動(dòng)固相萃取儀(美國(guó)Supelcovisiprep公司); AP-9925-3真空泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司); Buchi R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司); MS200多管漩渦混勻儀(杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司); PL2002分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司); 4-20R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司); N-EVAP 112水浴氮吹儀(美國(guó)OA公司); SB-5200DTN超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技公司); Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。

多菌靈(純度99.6%)、多菌靈-D4(純度98.2%)標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司);鹽酸(分析純,北京化工廠);氨水、無(wú)水硫酸鈉、氫氧化鉀、磷酸氫二鉀(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);甲酸(HPLC級(jí),上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷(HPLC級(jí),德國(guó)CNW公司);聚四氟乙烯(PTFE )親水濾膜(0.22 μm,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);混合陽(yáng)離子交換小柱(MCX)固相萃取柱(3 mL/60 mg,美國(guó)Waters公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:分別精確稱取5.02 mg多菌靈和5.09 mg多菌靈-D4標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解并定容至50 mL,配制成100 mg/L的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和多菌靈-D4標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,轉(zhuǎn)移至棕色玻璃瓶中,于-20 ℃下避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別準(zhǔn)確吸取多菌靈和多菌靈-D4標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,用甲醇稀釋,分別配制成1 mg/L的多菌靈和100 μg/L的多菌靈-D4標(biāo)準(zhǔn)工作液,于-20 ℃下避光保存。

1.3 樣品處理方法

1.3.1制備

克氏原鰲蝦去頭、去殼、去蝦線,取可食肌肉部分經(jīng)過(guò)勻漿,密封,保存在-20 ℃冰箱中。

1.3.2提取

將1.3.1節(jié)制備得到的蝦糜于室溫下解凍后,準(zhǔn)確稱取2.00 g(精確至0.01 g)試樣于50 mL具塞離心管中,加入50 μL 100 μg/L多菌靈-D4的標(biāo)準(zhǔn)溶液,渦旋混勻30 s,避光放置15 min。加入15 mL乙酸乙酯提取液和0.5 mL 1 mol/L磷酸氫二鉀,渦旋混勻1 min,超聲提取10 min,加入5 g無(wú)水硫酸鈉,渦旋1 min。4 500 r/min離心5 min,取上清液于100 mL雞心瓶中,重復(fù)提取一次,合并兩次提取液,于40 ℃水浴溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,加5 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液溶解殘?jiān)?并轉(zhuǎn)移至50 mL具塞離心管中,待凈化。

1.3.3凈化

MCX柱使用前依次用3 mL甲醇、3 mL 2%(v/v)氨水進(jìn)行活化。將5 mL上述樣品鹽酸溶液轉(zhuǎn)移至已經(jīng)活化處理后的MCX小柱上,棄掉流出液。依次用2 mL 2%(v/v)氨水、2 mL 0.1 mol/L鹽酸和3 mL甲醇淋洗MCX小柱,讓洗滌液完全流出柱子,減壓抽小柱至近干。在不抽真空的情況下用3 mL 8%(v/v)氨水甲醇洗脫,收集洗脫液,氮吹濃縮至干,用乙腈-水(1∶4, v/v)定容至1 mL,超聲5 min,加1 mL正己烷脫脂,4 500 r/min離心5 min,用1 mL注射器吸取下層清液,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后,取5 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析,內(nèi)標(biāo)法定量測(cè)定。

1.4 色譜條件

色譜柱:C18柱(100 mm×2.1 mm, 3.5 μm);柱溫:40 ℃;流動(dòng)相A:水;流動(dòng)相B:乙腈;進(jìn)樣量:5 μL;流速:400 μL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 85%A; 1.0～5.0 min, 85%A～20%A; 5.0～6.0 min, 20%A; 6.0～6.1 min, 20%A～85%A; 6.1～7 min, 85%A。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源:ESI;離子化模式:正離子模式;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM);離子化電壓(IS): 5 500 V;離子傳輸毛細(xì)管溫度(TEM): 550 ℃;噴霧氣(GS1)和輔助氣(GS2)均為高純氮?dú)?分別為344.75 kPa和379.23 kPa;氣簾氣(CUR)為零級(jí)空氣,壓力為275.80 kPa;入口電壓(EP): 26 V;出口電壓(CXP): 13 V?；衔锏谋O(jiān)測(cè)離子對(duì)(m/z)、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)等其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的確定

使用50%(v/v)甲醇水溶液作為溶劑,配制20 μg/L的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用針泵恒流進(jìn)樣的方式,進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化。在正離子全掃描模式下,首先進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描(Q1 scan),獲得多菌靈的母離子信息。其次,設(shè)定一定的碰撞能量,使用碎片離子掃描(product ion scan)獲得多菌靈的子離子信息。隨后對(duì)去簇電壓和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化,以獲得最終的質(zhì)譜方法。質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表1。

表 1多菌靈、多菌靈-D4的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓和碰撞能量

Table 1Monitoring ion pairs (m/z), declustering potentials (DP) and collision energies (CE) of carbendazim and carbendazim-D4

CompoundParent ion(m/z)Product ion(m/z)DP/VCE/VCarbendazim192.1160.1?8426192.1132.18440Carbendazim-D4196.0164.0?8428196.0136.18442

*Quantitative ion.

2.2 色譜條件的確定

通過(guò)改變流動(dòng)相體系的類型和洗脫梯度程序,研究了甲醇-水、甲醇-5 mmol/L醋酸銨、乙腈-水、乙腈-5 mmol/L醋酸銨等流動(dòng)相體系對(duì)多菌靈的峰形、峰寬、保留時(shí)間和信號(hào)強(qiáng)度的影響。研究結(jié)果表明,當(dāng)選取甲醇-水為流動(dòng)相時(shí),半峰寬較寬,低濃度峰拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重;當(dāng)分別選取甲醇-5 mmol/L醋酸銨和乙腈-5 mmol/L醋酸銨為流動(dòng)相時(shí),保留時(shí)間較長(zhǎng),信號(hào)強(qiáng)度較低;當(dāng)選擇乙腈-水為流動(dòng)相時(shí),結(jié)合梯度洗脫方式選擇性地讓流動(dòng)相進(jìn)入質(zhì)譜離子源,可將多菌靈與基質(zhì)干擾峰分開(kāi)且降低基質(zhì)對(duì)質(zhì)譜信號(hào)的干擾,多菌靈、多菌靈-D4的峰形、半峰寬、保留時(shí)間和信號(hào)強(qiáng)度均比較好,因此選擇乙腈-水作為流動(dòng)相。

在優(yōu)化的流動(dòng)相條件下,研究進(jìn)樣量和流速對(duì)分離效果的影響。當(dāng)進(jìn)樣量為5 μL,流速為200、300、400 μL/min時(shí),隨著流速的增大,柱壓升高,實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)化合物在色譜柱中快速分離的效果,峰寬較窄,峰形尖銳。當(dāng)增大進(jìn)樣量為10 μL,流速為200、300、400 μL/min時(shí),隨著流速的增大,保留時(shí)間提前,與進(jìn)樣量為5 μL相比洗脫的目標(biāo)峰呈寬峰。因此最終確定流動(dòng)相為乙腈-水,進(jìn)樣量為5 μL,流速為400 μL/min。在優(yōu)化的質(zhì)譜和液相色譜條件下多菌靈及多菌靈-D4標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 多菌靈和多菌靈-D4標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the standard solutions of carbendazim and carbendazim-D4

2.3 提取條件的優(yōu)化

鑒于堿性條件下多菌靈在有機(jī)溶劑中有較好的溶解度,為了使克氏原螯蝦中殘留的多菌靈有好的提取效果,通過(guò)空白克氏原螯蝦肌肉加標(biāo)回收試驗(yàn)比較了乙腈、乙酸乙酯、乙腈-磷酸氫二鉀、乙酸乙酯-磷酸氫二鉀、含2%(v/v)氨水的乙酸乙酯作為提取劑時(shí),提取劑的提取效率。結(jié)果表明,乙腈作提取劑時(shí),回收率較低(72.6%),分析其原因是乙腈與樣品中的水互溶,樣品脫水、變性、抱團(tuán)成塊;乙酸乙酯作提取劑時(shí),回收率小于90%;用含2%(v/v)氨水的乙酸乙酯提取時(shí),回收率大于120%,分析其原因是雜質(zhì)多,本體干擾嚴(yán)重。在提取劑乙腈和乙酸乙酯中加入磷酸氫二鉀時(shí)回收率均大于90%,但是用乙腈-磷酸氫二鉀作為提取劑時(shí),旋干耗時(shí)長(zhǎng)且存在暴沸現(xiàn)象,濃縮過(guò)程難于控制;而用乙酸乙酯-磷酸氫二鉀作提取劑時(shí),回收率為95.6%,耗時(shí)比乙腈短,選擇性好,本體干擾少,因此確定提取條件為15 mL乙酸乙酯-0.5 mL 1 moL/L磷酸氫二鉀重復(fù)提取兩次。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

2.4.1凈化材料的優(yōu)化

本研究分別使用C18粉(德國(guó)CNW公司)、GCB粉(德國(guó)CNW公司)、PSA粉(北京長(zhǎng)豐未來(lái)科技有限公司)凈化濃縮后用乙腈-水(1∶4, v/v)復(fù)溶的溶液,同時(shí)分別用HLB小柱(3 mL/60 mg,美國(guó)Waters公司)、MCX小柱對(duì)含目標(biāo)物的鹽酸溶液進(jìn)行凈化萃取,比較其凈化效果。結(jié)果見(jiàn)圖2。由于多菌靈具有兩性化合物的性質(zhì),所以在使用MCX凈化時(shí),富集凈化效果更好。因此凈化材料選定MCX。

圖2 不同凈化材料對(duì)克氏原螯蝦中多菌靈回收率的影響(n=6)Fig. 2 Effect of different purification materials on the recoveries of carbendazim in Procambarus clarkii (n=6) PSA: primary secondary amine; GCB: graphitized carbon black; MCX: mixed-mode cation exchange solid phase extraction column.

2.4.2洗脫劑的優(yōu)化

SPE柱確定為MCX后,將吸附有多菌靈的MCX柱分別用3 mL含6%(v/v)、8%(v/v)、10%(v/v)氨水的甲醇混合溶液進(jìn)行洗脫,洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?用1 mL乙腈-水(1∶4, v/v)復(fù)溶液溶解,進(jìn)樣測(cè)定,通過(guò)比較回收率大小,確定最適合的洗脫劑為8%(v/v)的氨水甲醇,回收率見(jiàn)表2。

表 2 采用不同體積分?jǐn)?shù)的氨水甲醇洗脫時(shí)克氏原螯蝦中多菌靈的回收率(n=6)

2.4.3洗脫體積的優(yōu)化

分析比較了洗脫體積為2、3、4 mL時(shí)多菌靈的回收率,結(jié)果表明,當(dāng)洗脫體積為3 mL和4 mL時(shí),回收率均大于90%;當(dāng)洗脫體積為4 mL時(shí),氮吹耗時(shí)較長(zhǎng),因此洗脫體積確定為3 mL。

2.5 方法驗(yàn)證

2.5.1方法的線性關(guān)系和檢出限

分別準(zhǔn)確吸取質(zhì)量濃度為0.5、 1.0、 2.0、5.0、 10.0、 20.0、50.0 μg/L的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液,同時(shí)吸取一定質(zhì)量濃度的內(nèi)標(biāo)多菌靈-D4溶液,使內(nèi)標(biāo)濃度均為5 μg/L。在優(yōu)化后的LC-MS條件下進(jìn)行測(cè)定。以多菌靈與內(nèi)標(biāo)多菌靈-D4的色譜峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)、對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X, μg/L),考察多菌靈與內(nèi)標(biāo)多菌靈-D4的峰面積比值與質(zhì)量濃度的線性關(guān)系,并以此建立標(biāo)準(zhǔn)曲線?？傻玫骄€性方程為Y=0.018 42+0.199 88X,多菌靈在0.5～50.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)為0.998 5。

在不含目標(biāo)化合物的克氏原螯蝦組織中添加一定含量的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液,并對(duì)其進(jìn)行分析,根據(jù)7個(gè)空白樣品組織基線噪音的平均值,分別以定量離子對(duì)3倍信噪比(S/N)、10倍信噪比(S/N)的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的含量作為方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),測(cè)定結(jié)果表明多菌靈的LOD值為0.25 μg/kg,多菌靈的LOQ值為0.50 μg/kg。色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 加標(biāo)克氏原螯蝦樣品的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of spiked Procambarus clarkii samples

表 3 克氏原螯蝦中多菌靈的回收率和精密度(n=6)

2.5.2方法的回收率和精密度

在克氏原鰲蝦空白肌肉組織中分別添加低、中、高4個(gè)濃度水平的多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品,分別為0.5、 1.0、 5.0、50.0 μg/kg,每個(gè)濃度做6個(gè)平行,設(shè)置一組空白對(duì)照,按1.3節(jié)前處理?xiàng)l件處理后測(cè)定并計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果見(jiàn)表3。從表3中可以看出,4個(gè)濃度水平下多菌靈的加標(biāo)回收率為83.9%～105.5%,方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～3.2%,精密度良好,其回收率和精密度均能夠滿足多菌靈的檢測(cè)要求。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

按照1.3節(jié)樣品前處理方法制備空白基質(zhì)液,配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明,多菌靈在0.5～50.0 μg/L范圍內(nèi)線性相關(guān),線性方程為Y=0.180 9X+0.018 51,r2為0.999 6。用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比(M)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果表明,M=0.905,其比值接近1,說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)較小,因此可選擇溶劑配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

分別從菜市場(chǎng)和稻蝦綜合種養(yǎng)試驗(yàn)田中隨機(jī)抽取10批克氏原螯蝦樣品,按照1.3節(jié)前處理方法處理后對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定分析,其中2批有檢出(含量>LOD)。檢出樣品中多菌靈含量分別為1.80 μg/kg和8.55 μg/kg,檢出率為20%。

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定克氏原螯蝦肌肉組織中多菌靈的分析方法。該方法采用乙酸乙酯提取,MCX固相萃取柱凈化提取液的手段,有效地提高了檢測(cè)方法的回收率和靈敏度,適用于克氏原螯蝦肌肉組織中多菌靈的檢測(cè)。最新食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[22]中還未對(duì)甲殼類動(dòng)物中多菌靈的殘留制定最大殘留限量,因此需要更加深入研究多菌靈對(duì)甲殼類動(dòng)物的潛在危害風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。