張曉華, 呂敏明, 鄭晶晶, 母淑婷, 劉攀華, 陳 征

(許昌學(xué)院食品與生物工程學(xué)院, 河南省食品安全生物標(biāo)識(shí)快檢技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 許昌 461000)

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露,與自身分泌物混合后,經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[1-3],其主要成分有糖類、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、酚酸、黃酮等物質(zhì)。由于蜂蜜的來(lái)源不同,其成分也會(huì)有所差異,這些物質(zhì)在給予蜂蜜良好風(fēng)味的同時(shí)也賦予其較好的藥理活性,是天然的營(yíng)養(yǎng)品,具有抑菌、抗氧化、調(diào)節(jié)腸胃的功能,亦可治療便秘、燒傷等病癥,具有消炎潤(rùn)肺、止咳的作用,還可以用來(lái)預(yù)防腫瘤、治療足廯等[2-8]。

近年來(lái),蜂蜜因其具有抗氧化、抗衰老的功效而深受廣大顧客的喜愛(ài),國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究證明蜂蜜的抗氧化性能與其所含的多酚類物質(zhì)有關(guān)。Al-Mamary等[9]測(cè)定了當(dāng)?shù)氐?種來(lái)自不同種蜂蜜的總酚含量,結(jié)果顯示,總酚含量越高,其抗氧化能力就越強(qiáng)。郭夏麗等[10]采用HPLC方法,分析了洋槐蜜、棗花蜜等7種蜂蜜中的23種多酚物質(zhì),并對(duì)其抗氧化性進(jìn)行了研究。

蜂蜜中的多酚類物質(zhì)主要包括酚酸和黃酮兩大類。酚酸類物質(zhì)是多酚的重要組成部分,是一種純天然的綠色抗氧化劑,可以有效地阻止自由基對(duì)人體的損傷,是延緩人體衰老的天然“保健品”,大部分帶有苯環(huán)、羥基和羧基官能團(tuán),化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,所以具有相似的物理化學(xué)性質(zhì),例如:色譜保留時(shí)間相近,紫外可見(jiàn)及熒光光譜相似等。受蜜源和一些環(huán)境因素(如土壤、季節(jié)、溫度和氣候)等的影響,不同種類、不同產(chǎn)地蜂蜜中酚酸類物質(zhì)的含量有很大區(qū)別。所以,蜂蜜中酚酸類物質(zhì)的含量可以作為區(qū)分蜂蜜種類和蜜源的有效方式[11]。但是,由于蜂蜜基質(zhì)異常復(fù)雜,實(shí)現(xiàn)蜂蜜中多種酚酸類物質(zhì)的定性定量分析具有很大的挑戰(zhàn)。

近幾年,多元校正技術(shù),尤其是二階或三階校正方法的發(fā)展,可以很好地彌補(bǔ)上述方法的缺陷。它通過(guò)數(shù)學(xué)方法將重疊的譜圖分辨為各個(gè)純的分析物以及干擾物質(zhì)的譜圖,即所謂的“二階優(yōu)勢(shì)”[12,13]。也就是說(shuō),在未知干擾共存的條件下,它可以利用“數(shù)學(xué)色譜”代替“普通色譜或質(zhì)譜方法”,快速準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)感興趣物質(zhì)的定性和定量分析。目前,這種聯(lián)合策略已在食品領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[14-20],本文利用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)結(jié)合基于交替三線性分解算法(alternating trilinear decomposition, ATLD)的二階校正方法,實(shí)現(xiàn)了蜂蜜中10種酚酸類物質(zhì)的同時(shí)、快速定性和定量分析。分析物之間以及分析物與復(fù)雜背景中的干擾物質(zhì)的色譜峰出現(xiàn)了嚴(yán)重的重疊。然而,基于“二階優(yōu)勢(shì)”,使用ATLD算法可以分辨得到各個(gè)分析物的合理的色譜和光譜圖以及準(zhǔn)確的濃度預(yù)測(cè)。結(jié)果表明:利用數(shù)學(xué)方法使得各個(gè)分析物的色譜和光譜圖與背景中的干擾物質(zhì)得到了完全分離,且定量結(jié)果準(zhǔn)確可靠。另外,本文還利用了統(tǒng)計(jì)與品質(zhì)因子,包括靈敏度(SEN)、選擇性(SEL)、預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)、檢出限(LOD)和定量限(LOQ),對(duì)所發(fā)展方法的預(yù)測(cè)性能進(jìn)行了評(píng)估,結(jié)果令人滿意。該方法具有簡(jiǎn)單、快速、精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn),可用于復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)分析物的定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑、材料與樣品

Agilent 1260高效液相色譜儀,配DAD檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫公司); EFAA-DC24-RT防腐型24位氮吹儀(安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司); XW-80A渦旋混勻器;US6180DH數(shù)顯加熱型超聲波(北京優(yōu)晟公司); AE224J電子天平(上海舜宇恒平公司,精密度為十萬(wàn)分之一)。

3,4-二羥基苯甲酸(3,4-dihydroxybenzoic acid, 3,4-DA)、綠原酸(chlorogenic acid, CHA)、對(duì)香豆酸(p-coumaric acid,p-CA)、脫落酸(abscisic acid, AA)、對(duì)羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid,p-HA)、阿魏酸(ferulic acid, FA)、肉桂酸(cinnamic acid, CIA)、咖啡酸(caffeic acid, CA)和丁香酸(syringic acid, SA)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于阿拉丁試劑,沒(méi)食子酸(gallic acid, GA)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于麥克林試劑公司。甲醇(色譜級(jí))購(gòu)于賽默飛世爾公司;甲酸(色譜級(jí))購(gòu)于阿拉丁試劑;果葡糖漿(億倍香,上海好成公司);試驗(yàn)所用的高純水為娃哈哈純凈水。

Poly-Sery HLB固相萃取柱(200 mg, 6 mL), Poly-Sery PSD固相萃取柱(250 mg, 6 mL), Poly-Sery Mixed anion exchange固相萃取柱(MAX, 150 mg, 6 mL), 3種固相萃取柱均購(gòu)自安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

棗花蜂蜜(原味42°蜜,河南卓宇蜂業(yè)有限公司)。

表 1 校正樣與驗(yàn)證樣中酚酸類物質(zhì)的質(zhì)量濃度

GA: gallic acid; 3,4-DA: 3,4-dihydroxybenzoic acid; CHA: chlorogenic acid;p-HA:p-hydroxybenzoic acid; CA: caffeic acid; SA: syringic acid;p-CA:p-coumaric acid; FA: ferulic acid; AA: abscisic acid; CIA: cinnamic acid. C01-C06: calibration sample 1-calibration sample 6. V01-V05: validation sample 1-validation sample 5.

1.2 溶液的配制

母液:將上述10種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品各稱取20.00 mg左右,分別放置于10個(gè)10 mL的棕色容量瓶,用甲醇定容,然后轉(zhuǎn)移到10 mL的棕色樣品瓶中,于4 ℃冰箱中保存。

工作液:根據(jù)各個(gè)分析物DAD響應(yīng)的強(qiáng)弱,取不同體積母液稀釋得到。沒(méi)食子酸母液取1 000 μL, 3,4-二羥基苯甲酸、綠原酸、對(duì)香豆酸、脫落酸、對(duì)羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸和丁香酸母液各取200 μL分別置于10 mL的容量瓶中,用酸化甲醇(含0.1%(v/v)的甲酸,下同)-酸化水(含0.1%(v/v)的甲酸,下同)(6∶4, v/v)混合溶液定容,得到10種酚酸物質(zhì)的工作液,各工作液的濃度分別為:GA 0.28 g/L; 3,4-DA 0.044 g/L; CHA 0.044 g/L;p-CA 0.043 g/L; AA 0.044 g/L;p-HA 0.044 g/L; FA 0.051 g/L; CIA 0.055 g/L; CA 0.044 g/L; SA 0.043 g/L。

校正樣:在每個(gè)10 mL的棕色容量瓶中加入不同體積(0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00 mL)的10種酚酸工作液,再由酸化甲醇-酸化水(6∶4, v/v)溶液定容。雖然本文涉及的目標(biāo)分析物較多,但一方面本實(shí)驗(yàn)是采取分色譜子區(qū)間解析數(shù)據(jù)(每個(gè)區(qū)間最多只含有兩個(gè)物質(zhì)),另一方面化學(xué)計(jì)量學(xué)二階校正可以使用“數(shù)學(xué)分離”方法增強(qiáng)“物理分離”,因此采用簡(jiǎn)單的交叉設(shè)計(jì)即可避免相似結(jié)構(gòu)的分析物之間的相互干擾。另外,我們?cè)O(shè)計(jì)了5個(gè)不同濃度水平的驗(yàn)證樣測(cè)試所發(fā)展方法的準(zhǔn)確性,驗(yàn)證樣的濃度均位于校正樣范圍之內(nèi),只包含10種多酚物質(zhì),不含其他干擾。校正樣和驗(yàn)證樣的具體質(zhì)量濃度見(jiàn)表1。

模擬蜂蜜:采用在果葡糖漿中添加各個(gè)目標(biāo)分析物的方法配制模擬蜂蜜?？Х人?、對(duì)香豆酸、阿魏酸工作液各取2.50 mL,沒(méi)食子酸、3,4-二羥基苯甲酸、綠原酸、脫落酸、對(duì)羥基苯甲酸、肉桂酸和丁香酸工作液各取1.60 mL于100 mL的容量瓶里,用果葡糖漿定容。渦旋混勻后,在40 ℃下超聲20 min,待用。

蜂蜜實(shí)際樣和加標(biāo)樣:稱取2.50 g棗花蜂蜜用10 mL酸化水稀釋,40 ℃下超聲20 min混合均勻后,全部加入到處理好的固相萃取柱中進(jìn)行前處理,共設(shè)置3個(gè)平行樣品進(jìn)行試驗(yàn)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證所提出方法的性能,我們?cè)O(shè)計(jì)了加標(biāo)實(shí)驗(yàn),在各個(gè)蜂蜜樣本中添加不同濃度水平的分析物的標(biāo)準(zhǔn)溶液(添加咖啡酸、對(duì)香豆酸和阿魏酸的工作液各60 μL,添加其余工作液各40 μL)。加標(biāo)蜂蜜樣本中各個(gè)分析物的最終濃度在其濃度的線性范圍內(nèi)。注射到色譜系統(tǒng)之前每個(gè)加標(biāo)樣的處理方式和蜂蜜樣本相同。

1.3 樣品前處理

本實(shí)驗(yàn)使用HLB、PSD和MAX 3種SPE柱對(duì)樣品進(jìn)行前處理。

HLB和PSD的前處理:(1)使用甲醇和酸化水對(duì)SPE柱進(jìn)行活化和平衡處理;(2)用酸化水稀釋樣品,并進(jìn)行上樣;(3)再用酸化水淋洗,抽干;(4)最后用甲醇洗脫,抽干;(5)在40 ℃下氮吹至干燥,然后用流動(dòng)相定容至1 mL。

MAX的前處理:方法同HLB和PSD柱,只是使用高純水替換上述處理過(guò)程中的酸化水。

1.4 色譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)。流動(dòng)相A:高純水(含0.1%甲酸);流動(dòng)相B:甲醇(含0.1%甲酸);梯度洗脫程序:0～2.0 min, 25%B～35%B; 2.0～7.0 min, 35%B～40%B; 7.0～8.0 min, 40%B～55%B; 8.0～9.0 min, 55%B～65%B; 9.0～12.0 min, 65%B～100%B; 12.0～15.0 min, 100%B～25%B。進(jìn)樣量20 μL,柱溫30 ℃,流速1.00 mL/min,分析時(shí)間15 min。檢測(cè)波長(zhǎng)為190～400 nm,每2 nm采集一個(gè)數(shù)據(jù)。

1.5 理論方法

通過(guò)DAD得到各個(gè)分析物的全光譜數(shù)據(jù),每秒進(jìn)行多次掃描,通過(guò)對(duì)多個(gè)樣本的多次HPLC運(yùn)行可以收集得到一個(gè)三維數(shù)陣。每個(gè)樣本的每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都是由兩個(gè)參數(shù)構(gòu)成:對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間和吸收波長(zhǎng)。

每個(gè)樣本經(jīng)HPLC-DAD測(cè)量得到一個(gè)大小為I×J(保留時(shí)間×吸收波長(zhǎng))的矩陣數(shù)據(jù)。當(dāng)將K個(gè)樣本(包括校正樣、蜂蜜樣和蜂蜜加標(biāo)樣)得到的矩陣數(shù)據(jù)堆疊在一起,就得到一個(gè)大小為I×J×K的三維數(shù)據(jù)陣X,三維數(shù)陣的表達(dá)形式可以參考文獻(xiàn)[14]。然后采用ATLD算法,把分析物的濃度與其光譜信號(hào)進(jìn)行關(guān)聯(lián)。ATLD是基于最小二乘原理的迭代算法,具有對(duì)組分?jǐn)?shù)不敏感、收斂快速等優(yōu)點(diǎn)。關(guān)于該算法詳細(xì)的信息請(qǐng)參考文獻(xiàn)[18],其程序由湖南大學(xué)化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室吳海龍教授提供。所有計(jì)算均在MATLAB環(huán)境中,在配有3.50 GHz Intel?Core (TM) i5-4690 CPU 8.00 GB內(nèi)存并裝有Windows 10操作系統(tǒng)的戴爾計(jì)算機(jī)上運(yùn)行。

1.6 品質(zhì)因子

本文還利用了統(tǒng)計(jì)與品質(zhì)因子,包括SEN、SEL、RMSEP、LOD和LOQ,驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)方法的可靠性,相關(guān)統(tǒng)計(jì)與品質(zhì)因子的表達(dá)式見(jiàn)公式(1～5)[21-23]。

(1)

(2)

LOD=3.3s(0)

(3)

LOQ=10s(0)

(4)

(5)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為分析

圖1a和1b是6個(gè)校正樣和5個(gè)驗(yàn)證樣在252 nm處扣除空白樣品背景后得到的色譜圖。從這兩個(gè)圖可以看出:無(wú)論是校正樣還是驗(yàn)證樣,10種酚酸物質(zhì)的出峰位置都幾乎相同,每個(gè)峰的形狀也非常相似,無(wú)明顯的色譜時(shí)間漂移。故本試驗(yàn)中采用的色譜條件是相對(duì)穩(wěn)定的,能夠滿足三線性數(shù)據(jù)的要求。但是,10種分析物的色譜峰存在一定的重疊,尤其是咖啡酸和丁香酸,對(duì)香豆酸和阿魏酸,色譜峰重疊非常嚴(yán)重,無(wú)法直接使用傳統(tǒng)的定量方法(利用峰面積或者峰高)進(jìn)行定性定量分析。

圖1c是校正樣C04、實(shí)際樣T01和加標(biāo)樣S01在252 nm處的色譜圖。從圖1c可以看出,蜂蜜中的干擾物很多,但10種酚酸物質(zhì)的出峰位置基本沒(méi)有變化,峰形也幾乎未改變,未出現(xiàn)明顯的色譜時(shí)間漂移現(xiàn)象。但是,蜂蜜背景復(fù)雜,許多種干擾物質(zhì)和目標(biāo)分析物出現(xiàn)共流出的情況,要實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物與背景中干擾物質(zhì)的完全分離,需要非常長(zhǎng)的分析時(shí)間,或者根本無(wú)法實(shí)現(xiàn)完全分離。然而,我們使用ATLD算法,利用“數(shù)學(xué)分離”的方法,在很短的時(shí)間(t<15.0 min)內(nèi)就完成了10種目標(biāo)物質(zhì)的定量分析。

圖1 (a)校正樣、(b)驗(yàn)證樣、(c)校正樣C04、實(shí)際樣T01和加標(biāo)樣S01在252 nm處的色譜圖Fig. 1 Chromatograms for (a) calibration samples, (b) validation samples, and (c) a calibration sample (C04), a jujube flower honey sample (T01), and a spiked acacia honey sample (S01) at 252 nm Peak identifications: 1. gallic acid; 2. 3,4-dihydroxybenzoic acid; 3. chlorogenic acid; 4. p-hydroxybenzoic acid; 5. caffeic acid; 6. syringic acid; 7. p-coumaric acid; 8. ferulic acid; 9. abscisic acid; 10. cinnamic acid.

2.2 HPLC-DAD-ATLD方法性能的驗(yàn)證

在運(yùn)用HPLC-DAD-ATLD方法進(jìn)行實(shí)際樣本分析之前,我們?cè)O(shè)計(jì)了5個(gè)不同濃度水平的驗(yàn)證樣來(lái)測(cè)試所發(fā)展方法的準(zhǔn)確性。這些驗(yàn)證樣不含任何未知干擾,只含有10種目標(biāo)分析物,其濃度均在校正樣濃度范圍之內(nèi)。為了簡(jiǎn)化分析過(guò)程,依據(jù)分析物的保留時(shí)間和背景干擾的強(qiáng)弱,采取分區(qū)間的方式對(duì)所獲得的色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行解析,共劃分為8個(gè)區(qū)域,每個(gè)區(qū)域包含不同的分析物,r-1區(qū)～r-8區(qū)依次對(duì)應(yīng)沒(méi)食子酸、綠原酸、3, 4對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、兩種共流出組分咖啡酸和丁香酸、兩種共流出組分阿魏酸和對(duì)香豆酸、脫落酸、肉桂酸。

驗(yàn)證樣的分析結(jié)果如表2所示,在所研究的濃度范圍之內(nèi),通過(guò)ATLD方法計(jì)算得到的目標(biāo)分析物的理論質(zhì)量濃度與其實(shí)際質(zhì)量濃度呈現(xiàn)出非常好的線性關(guān)系,其線性相關(guān)系數(shù)范圍為0.998 2～0.999 9,相關(guān)性良好,平均回收率為97.6%～101.1%。相關(guān)數(shù)據(jù)表明上述方法得到了令人滿意的結(jié)果,也驗(yàn)證了ATLD方法在定性定量分析含有重疊峰的HPLC-DAD數(shù)據(jù)的可行性。

表 2 驗(yàn)證樣中每個(gè)分析物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和平均回收率(n=5)

y: the relative concentration values of each analyte in calibration samples;x: the nominal concentrations in calibration samples.

2.3 HPLC-DAD-ATLD方法用于模擬蜂蜜中10種酚酸類物質(zhì)的定量檢測(cè)

蜂蜜的背景基質(zhì)非常復(fù)雜,是糖類的超飽和溶液,主要包括38%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的果糖和31%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的葡萄糖。在進(jìn)行蜂蜜中酚酸類物質(zhì)的定量分析之前,我們?cè)O(shè)計(jì)了模擬蜂蜜考察背景基質(zhì)對(duì)所建立方法穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性的影響。

用HLB、PSD和MAX這3種不同的SPE柱對(duì)模擬蜂蜜進(jìn)行前處理,將經(jīng)過(guò)前處理的模擬蜂蜜溶液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后注入HPLC-DAD系統(tǒng)中進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。每種固相萃取柱做3次平行試驗(yàn),取平均值作為該萃取柱的回收率,其結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3可以看出,HLB柱回收率中沒(méi)食子酸平均回收率最高,對(duì)香豆酸的平均回收率最低;PSD柱回收率中綠原酸平均回收率最高,沒(méi)食子酸的平均回收率最低;MAX柱回收率中沒(méi)食子酸平均回收率最高,綠原酸平均回收率最低?？傮w來(lái)看,HLB柱10種目標(biāo)分析物的平均回收率為70.9%～102.2%; PSD柱10種目標(biāo)分析物的平均回收率為55.7%～85.5%; MAX柱10種目標(biāo)分析物的平均回收率為1.8%～102.1%,其中,綠原酸的平均回收率僅為1.8%。因此,HLB固相萃取柱的萃取效果較好,整體優(yōu)于其他兩種柱子,這是由3種固相萃取柱的組成以及吸附、解吸原理決定的。

表 3 模擬蜂蜜中10種酚酸類物質(zhì)經(jīng)3種固相萃取柱凈化后的回收率(n=3)

2.4 HPLC-DAD-ATLD方法用于棗花蜂蜜中10種酚酸類物質(zhì)的定量檢測(cè)

由模擬蜂蜜的試驗(yàn)結(jié)果得出,3種固相萃取小柱中HLB的萃取效果最佳,因此用HLB固相萃取柱對(duì)棗花蜂蜜中的酚酸類物質(zhì)進(jìn)行提取。經(jīng)固相萃取后由HPLC-DAD進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,對(duì)于每一個(gè)樣本,可以得到保留時(shí)間-光譜二維矩陣數(shù)據(jù)。把不同樣本疊加起來(lái),可以得到一個(gè)三維數(shù)據(jù)陣,進(jìn)而使用ATLD算法進(jìn)行數(shù)據(jù)解析。基于ATLD算法得到棗花蜜中10種酚酸類物質(zhì)的歸一化色譜圖見(jiàn)圖2,光譜圖見(jiàn)圖3。可以看出,這10種分析物都存在一定程度的干擾現(xiàn)象,包括棗花蜜中的共流出干擾物質(zhì)、基線漂移或者儀器噪聲等。其中,沒(méi)食子酸、咖啡酸、丁香酸、脫落酸以及肉桂酸受到的干擾物較多,沒(méi)食子酸的光譜圖中分析物與干擾物有部分重疊,對(duì)羥基苯甲酸的色譜圖中有與分析物相近的干擾物質(zhì)流出,脫落酸的光譜圖中分析物與干擾物在檢測(cè)波長(zhǎng)196 nm左右出現(xiàn)大量重疊,肉桂酸的光譜圖中分析物與部分干擾物幾乎完全重疊。在這樣干擾物種類繁多、干擾強(qiáng)度大的情況下,想使得目標(biāo)分析物與干擾物完全分離需要相當(dāng)長(zhǎng)的分析時(shí)間,或者基本無(wú)法實(shí)現(xiàn)分離,但通過(guò)ATLD算法的數(shù)學(xué)分離功能,可以在15 min內(nèi)對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行定量分析,且結(jié)果基本令人滿意。

圖2 基于HPLC-DAD-ATLD方法得到的棗花蜂蜜中10種分析物的歸一化色譜圖Fig. 2 Elution time profiles of the ten analytes in jujube flower honey samples based on the HPLC-DAD-ATLD methodAll plots were normalized to unit length in their regions (r-1-r-8).

圖3 基于HPLC-DAD-ATLD方法得到的棗花蜂蜜中10種分析物的歸一化光譜圖Fig. 3 Spectral profiles of the ten analytes in jujube flower honey samples based on the HPLC-DAD-ATLD methodAll plots were normalized to unit length in their regions (r-1-r-8).

對(duì)蜂蜜實(shí)際樣品和加標(biāo)樣品分別做3次平行試驗(yàn),取平均值計(jì)算棗花蜜中每種目標(biāo)分析物的實(shí)際含量和加標(biāo)回收率,其結(jié)果見(jiàn)表4。由表4中數(shù)據(jù)可以得出:該棗花蜂蜜中未檢出綠原酸和肉桂酸,其余8種酚酸類物質(zhì)都已檢出,含量從高到低依次為3,4-二羥基苯甲酸13.14 μg/g、脫落酸11.51 μg/g、對(duì)羥基苯甲酸8.72 μg/g、對(duì)香豆酸3.47 μg/g、咖啡酸2.69 μg/g、沒(méi)食子酸1.68 μg/g、阿魏酸1.58 μg/g、丁香酸1.10 μg/g。另外,蜂蜜中酚酸物質(zhì)的加標(biāo)回收率為62.1%～93.8%,其中,對(duì)羥基苯甲酸的加標(biāo)回收率最高,對(duì)香豆酸的加標(biāo)回收率最低,其原因可能有幾個(gè)方面:(1)真蜂蜜成分復(fù)雜,干擾物較多,易受到其他成分的干擾;(2)不同的酚酸類物質(zhì)由于物理、化學(xué)性質(zhì)不同,對(duì)固相萃取柱的作用不同,或者難以吸附,或者難以洗脫;(3)分析物較多,固相萃取柱的容量有限;(4)該分析物本身紫外響應(yīng)強(qiáng)度較低。

表 4 基于HPLC-DAD-ATLD方法得到的棗花蜜中10種分析物的定量結(jié)果及加標(biāo)回收率(n=3)

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2.5 統(tǒng)計(jì)和品質(zhì)因子驗(yàn)證

本文還利用統(tǒng)計(jì)與品質(zhì)因子(包括SEN、SEL、RMSEP、LOD和LOQ)驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)方法的可靠性,結(jié)果見(jiàn)表5。

EN、SEL、RMSEP、LOD和LOQ的值對(duì)于研究的樣品背景以及共存的其他組分(例如:在同一流出時(shí)間區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)的未知干擾物以及其他目標(biāo)分析物)有很強(qiáng)的依賴性。由表5可知,相對(duì)于其他分析物,綠原酸和沒(méi)食子酸的SEN值偏低,最主要的原因是在相同的濃度條件下,其紫外吸收響應(yīng)偏弱。另外,在沒(méi)食子酸和綠原酸的出峰范圍內(nèi),蜂蜜基質(zhì)中共流出干擾物質(zhì)較多對(duì)其SEN也有一定的影響。但是,考慮到所研究樣品目標(biāo)分析物種類較多以及背景干擾物的復(fù)雜性,所得的分析結(jié)果令人滿意。

表 5 基于HPLC-DAD-ATLD方法各個(gè)分析物的品質(zhì)因子計(jì)算結(jié)果

SEN: sensitivity; SEL: selectivity; RMSEP: root mean square error of prediction; LOD: limit of detection; LOQ: limit of quantitation.

3 結(jié)論

本文首先通過(guò)模擬蜂蜜試驗(yàn),確定了固相萃取柱的種類及操作條件。然后在操作條件下,使用HLB固相萃取柱對(duì)蜂蜜進(jìn)行了預(yù)處理,通過(guò)HPLC-DAD的數(shù)據(jù)采集,得到了保留時(shí)間-光譜-濃度三維數(shù)據(jù)陣。利用基于交替三線性分解算法的二階校正方法對(duì)所得到的三維數(shù)陣進(jìn)行解析,進(jìn)而得到蜂蜜中10種酚酸類物質(zhì)的定性定量結(jié)果。另外,本文還利用統(tǒng)計(jì)與品質(zhì)因子(包括SEN、SEL、RMSEP、LOD和LOQ)驗(yàn)證了試驗(yàn)方法的可靠性,結(jié)果令人滿意。該方法具有簡(jiǎn)單、快速、精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn),可用于復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)分析物的定量分析。