張曉藝, 張秀堯, 蔡欣欣, 李瑞芬

(溫州市疾病預(yù)防控制中心, 浙江 溫州 325001)

人們喜愛(ài)的瓜果類蔬菜,如葫蘆瓜(瓠瓜、蒲瓜)、絲瓜、南瓜、甜瓜、黃瓜、西瓜、香瓜、小胡瓜(zucchini)、冬南瓜(winter squash)等都屬于葫蘆科(Cucurbitaceae)南瓜屬(CucurbitaLinn.)植物的果實(shí),正常時(shí)無(wú)苦味,但有的有苦味,苦味瓜果的外形與正常瓜果無(wú)區(qū)別,只有在食用時(shí)才能發(fā)現(xiàn),食用后會(huì)引起中毒[1-10],中毒時(shí)會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉以及腹痛等癥狀,嚴(yán)重時(shí)可引起脫水、低血壓、嘔血、便血、心跳加速、頭痛以及眩暈,甚至于肺水腫,偶爾還會(huì)引起脫發(fā),國(guó)外稱之為毒性南瓜屬綜合征。引起中毒的物質(zhì),有認(rèn)為是糖甙生物堿[3],也有認(rèn)為是葫蘆素類物質(zhì)[1,4,7-10]。葫蘆素類物質(zhì)屬四環(huán)三萜類化合物,主要有葫蘆素B (CuB)、葫蘆素E(CuE)和葫蘆素I (CuI)等[11],其化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。葫蘆素類味苦,具有一定的生理活性,具有抗氧化、抗腫瘤和護(hù)肝等作用,但也有一定毒性,葫蘆素E會(huì)抑制絲切蛋白(cofilin)磷酸化,顯示細(xì)胞毒性[12]。葫蘆素B小鼠灌胃半數(shù)致死量(LD50)為(14.0±3.0) mg/(kg·bw),皮下給藥的LD50為(1.00±0.07) mg/(kg·bw);葫蘆素E小鼠灌胃的LD50為340 mg/(kg·bw),腹腔注射的LD50為2 mg/(kg·bw)[13]。3H-葫蘆素B灌胃15 min后進(jìn)入血液,4 h達(dá)到峰值,此時(shí)血漿蛋白結(jié)合率為88.7%,在肝、膽、胃內(nèi)優(yōu)勢(shì)分布,在肺中含量高且持久,24 h內(nèi)尿液和糞便中未見(jiàn)原形藥物,膽汁含給藥量的30.62%,并存在肝腸循環(huán)[14]。

圖1 CuB、CuI、CuE和內(nèi)標(biāo)物夾竹桃甙的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of CuB, CuE, CuI and oleandrin (IS)

報(bào)道的葫蘆素類檢測(cè)方法有液相色譜法[15-18]和液相色譜-質(zhì)譜法[19-21]。液相色譜法多用于測(cè)定藥用植物中葫蘆素類成分[15-17],也有用于葫蘆素B注射劑在小鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究[18],但靈敏度低,定性能力差,無(wú)法滿足中毒檢測(cè)的要求。有液相色譜-質(zhì)譜法用于葫蘆素類藥物的動(dòng)力學(xué)研究,Zhao等[19]采用二氯甲烷萃取,反相色譜柱分離,在電噴霧電離、正離子模式下以CuB的[M+Na]+為母離子進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描,檢測(cè)了大鼠血漿中葫蘆素B的濃度;Fiori等[20]則采用乙腈蛋白沉淀法進(jìn)行樣品前處理,反相色譜法分離,在電噴霧電離、負(fù)離子、MRM模式下測(cè)定了大鼠血漿中CuI和CuE的濃度。也有采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定小胡瓜中毒樣品、患者血清和尿液等體液中CuB、CuI、CuE和CuE-葡萄糖甙的報(bào)道[21],樣品采用二氯甲烷萃取,濃縮5倍后進(jìn)樣分析,經(jīng)五氟苯基色譜柱分離,在電噴霧電離、負(fù)離子模式下采用選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)模式檢測(cè)。

為了確定葫蘆科南瓜屬苦味瓜果中引起中毒的化學(xué)成分,本實(shí)驗(yàn)采用固相支持液液萃取法(SLE)提取和凈化樣品,超高效反相液相色譜法分離,建立了大氣壓化學(xué)電離、負(fù)離子模式、MRM方式的檢測(cè)方法,用于引起中毒的苦味瓜果及患者血漿和尿液中CuB、CuE和CuI的測(cè)定,方法快速、靈敏、準(zhǔn)確,用于實(shí)際中毒樣品的測(cè)定,首次從引起中毒的苦味葫蘆瓜及中毒患者的血漿和尿液中檢出CuB。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀由ACQUITY UPLC BSM二元溶劑泵、FTN自動(dòng)進(jìn)樣器和CM-A柱溫箱組成(美國(guó)Waters公司); QTRAP 6500三重四極桿/復(fù)合線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司); Ultra-Turrax T-25型分散機(jī)、MS3旋渦混旋器(德國(guó)IKA公司); 2510超聲波清洗機(jī)(美國(guó)Branson公司); 3-30K高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司); 24孔N-EVAP氮吹儀(美國(guó)Organomation公司); Gradient A10 Mill-Q超純水器(法國(guó)Millipore公司)。

乙腈、甲醇和叔丁基甲醚(色譜純,德國(guó)Merck公司); Cleanert SLE柱(1 000 mg/6 mL,天津博納艾杰爾科技有限公司)。葫蘆素B(純度≥97%)、葫蘆素E(純度≥95%)和葫蘆素I(純度≥95%)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;夾竹桃甙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度≥90%)購(gòu)自加拿大TRC公司,臨用時(shí)分別用甲醇溶解,配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、10.0 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)中間液和1.00 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,于-80 ℃保存。健康人血漿經(jīng)浙江省衛(wèi)生行政部門(mén)審批后由溫州市中心血站提供,尿液由健康志愿者提供。

1.2 樣品前處理方法

1.2.1血漿和尿液

在1.00 mL血漿或尿液中加入20 μL 0.10 μg/mL內(nèi)標(biāo)物夾竹桃甙,混勻,上樣于SLE柱,放置5 min以上,用4.0 mL叔丁基甲醚洗脫,洗脫液于50 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?殘?jiān)苡?00 μL 50%(v/v)甲醇水溶液,過(guò)0.22 μm濾膜,待測(cè)。

1.2.2瓜果類蔬菜

切碎樣品,均質(zhì)后,稱取2.00 g試樣,置于50 mL具塞離心管中,加入10 mL乙腈,均質(zhì)15 s,刀頭用10 mL乙腈清洗,超聲提取10 min,以10 000 r/min離心5 min,吸取上清液,殘?jiān)儆玫额^清洗液重復(fù)提取1次,合并提取液,混勻,定容至20 mL,吸取500 μL提取液,置于5 mL試管中,加入500 μL甲醇和1 000 μL水,混勻,過(guò)0.22 μm濾膜,濾液待測(cè)。高濃度樣品再用50%(v/v)甲醇水溶液稀釋至合適濃度。

1.3 分析條件

1.3.1色譜條件

分析柱為XBridge BEH C18色譜柱(100 mm×3.0 mm, 2.5 μm),保護(hù)柱為Van Guard BEH C18保護(hù)柱(5 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫45 ℃;流動(dòng)相A:甲醇,流動(dòng)相B: 0.025%(v/v)氨水溶液;流速:0.600 mL/min。梯度洗脫程序:0～3.5 min, 40%A～85%A; 3.5～3.6 min, 85%A～95%A; 3.6～5.5 min, 95%A; 5.5～5.6 min, 95%A～40%A; 5.6～7.5 min, 40%A。進(jìn)樣體積10 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源為大氣壓化學(xué)電離(APCI)源,負(fù)離子模式;掃描方式為MRM模式;離子源溫度(TEM): 350 ℃;離子化電壓(IS): -4 500 V;放電電流(NC): 5 μA;氣簾氣(CUR)壓力:277 kPa;噴霧氣(GS1)壓力:414 kPa;碰撞氣(CAD)強(qiáng)度:Medium。3種葫蘆素和內(nèi)標(biāo)物的去簇電壓分別為-60 V和-130 V。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 3種葫蘆素和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantitative ion.

運(yùn)行開(kāi)始時(shí),色譜柱流出液經(jīng)六通切換閥切換至廢液,2.70 min再切換到質(zhì)譜離子源,質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)至3.60 min,六通切換閥又將柱流出液切換至廢液中。

2 結(jié)果和討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CuB、CuE和CuI在電噴霧電離、正離子模式下可以形成較強(qiáng)的[M+Na]+峰,但以這些[M+Na]+峰作為母離子進(jìn)行碰撞,得到的碎片離子強(qiáng)度很低且不穩(wěn)定;而在電噴霧電離、負(fù)離子模式下可以形成[M-H]-、[M+HCOO]-和[M+Cl]-等離子,以這些離子作為母離子進(jìn)行碰撞也無(wú)法得到穩(wěn)定且有足夠強(qiáng)度的碎片離子,若依據(jù)文獻(xiàn)[21]選擇這些離子進(jìn)行SIM方式檢測(cè),對(duì)于實(shí)際樣品,特別是血漿和尿液等基質(zhì)復(fù)雜的樣品,得到質(zhì)譜信號(hào)的基線很高,靈敏度無(wú)法滿足中毒樣品低濃度檢測(cè)的要求。嘗試采用大氣壓化學(xué)電離模式對(duì)待測(cè)物進(jìn)行優(yōu)化,在正離子方式下電離,3種葫蘆素類成分的[M+H]+峰強(qiáng)度較弱,但在負(fù)離子方式下電離,這些化合物的[M-H]-峰強(qiáng)度較強(qiáng),以[M-H]-峰作為母離子進(jìn)行碰撞能夠得到穩(wěn)定的碎片離子,且均有較強(qiáng)的脫水[M-H-H2O]-碎片峰,葫蘆素B和葫蘆素E還有[M-H-CH3COOH]-峰(見(jiàn)圖2)。因此選擇負(fù)離子大氣壓化學(xué)電離模式作為后續(xù)測(cè)定的質(zhì)譜條件,再對(duì)離子化電壓、放電電流、離子源溫度、去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,使得分子離子對(duì)的信號(hào)達(dá)到最強(qiáng),選擇信號(hào)最強(qiáng)的兩對(duì)分子離子對(duì),以響應(yīng)相對(duì)較強(qiáng)的子離子作為定量離子,另一子離子作為定性離子。同時(shí)設(shè)定合適的峰駐留時(shí)間(dwell time)確保色譜峰的采樣點(diǎn)數(shù)在15～20點(diǎn),從而得到較好的定量重復(fù)性。

圖2 CuB、CuE、CuI和內(nèi)標(biāo)物夾竹桃甙的子離子掃描質(zhì)譜圖Fig. 2 Daughter ion scan spectra of CuB, CuE, CuI and oleandrin (IS)

2.2 色譜條件優(yōu)化

采用大氣壓化學(xué)電離源,液相色譜的流動(dòng)相流速需≥0.6 mL/min,實(shí)驗(yàn)選擇XBridge BEH C18色譜柱(100 mm×3.0 mm, 2.5 μm)作為分離柱,分別對(duì)甲醇-水和乙腈-水系統(tǒng)進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,以甲醇-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相時(shí),3種待測(cè)物有更高的響應(yīng)值,因此選擇甲醇-水系統(tǒng)進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。在甲醇-水系統(tǒng)中分別添加不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸(0.05%～0.30%)、氨水(0.010%～0.050%)和不同濃度的乙酸銨(1～5 mmol/L)。結(jié)果表明,流動(dòng)相中加入甲酸和乙酸銨,3種待測(cè)物的質(zhì)譜信號(hào)受到明顯抑制,而加入氨水后質(zhì)譜響應(yīng)則有較大的增強(qiáng),以甲醇-0.025%(v/v)氨水作為流動(dòng)相時(shí)(見(jiàn)圖3), 3種葫蘆素類成分的質(zhì)譜響應(yīng)最強(qiáng),故選作分離的流動(dòng)相。然后再對(duì)流動(dòng)相的流速、梯度洗脫條件、柱溫等條件進(jìn)行優(yōu)化,3種待測(cè)物能夠得到較好的分離(見(jiàn)圖4)。

圖3 流動(dòng)相中氨水的體積分?jǐn)?shù)對(duì)3種葫蘆素質(zhì)譜響應(yīng)的影響Fig. 3 Effect of volume fractions of ammonia in mobile phases on the MS response of the three cucurbitacins

圖4 3種葫蘆素及內(nèi)標(biāo)物夾竹桃甙的UPLC-MS/MS色譜圖Fig. 4 UPLC-MS/MS chromatograms of the three cucurbitacins and oleandrin (IS)

2.3 樣品前處理方法優(yōu)化

葫蘆素類為四環(huán)三萜類化合物,脂溶性較強(qiáng),對(duì)于血漿和尿液中的樣品前處理方法,文獻(xiàn)[20]采用乙腈沉淀法,文獻(xiàn)[19,21]均采用二氯甲烷液液萃取法,考慮到乙腈沉淀法只能去除血漿中蛋白質(zhì)等雜質(zhì),樣品凈化效果不理想,故本實(shí)驗(yàn)采用液液萃取法,考慮到傳統(tǒng)的液液萃取法萃取效率比較低,易乳化,操作較為繁瑣,而基于液液萃取法原理的固相支持液液萃取法具有萃取效率高、影響因素少和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),已應(yīng)用于生物樣品的前處理中[22,23],故選作樣品凈化的方法。

取1.00 mL血漿或尿液加標(biāo)樣品(5.0 μg/L)上SLE柱,然后分別用4.0 mL二氯甲烷、叔丁基甲醚和乙酸乙酯進(jìn)行洗脫。結(jié)果顯示,二氯甲烷和叔丁基甲醚洗脫液中3種待測(cè)物的質(zhì)譜響應(yīng)值均高于乙酸乙酯洗脫液,考慮到二氯甲烷為含氯試劑,不利于環(huán)境保護(hù),且毒性較大,不予選用。因此最終選擇叔丁基甲醚作為固相支持液液萃取法的洗脫溶液。

分別取6份1.00 mL血漿和尿液的加標(biāo)樣品(5.0 μg/L)上SLE柱,分別用2.0、4.0和6.0 mL叔丁基甲醚進(jìn)行洗脫,以6.0 mL的洗脫率為100%計(jì)。結(jié)果顯示,4.0 mL叔丁基甲醚洗脫率約為98%,故選擇4.0 mL叔丁基甲醚作為SLE萃取柱的洗脫劑,洗脫液經(jīng)氮吹后殘?jiān)苡?00 μL 50%(v/v)甲醇水溶液,樣品濃縮了5倍。6份不同來(lái)源的血漿和尿液經(jīng)本法處理后測(cè)定,在相應(yīng)的保留時(shí)間上未見(jiàn)干擾色譜峰。

由于引起中毒的瓜果類蔬菜樣品中毒物濃度相對(duì)較高,故瓜果類蔬菜樣品提取液稀釋后直接測(cè)定。取葫蘆瓜加標(biāo)樣品2.00 g(加標(biāo)水平0.5 mg/kg),分別用20 mL甲醇或乙腈分2次提取,合并提取液,取500 μL提取液加入500 μL水,混勻,過(guò)0.22 μm濾膜后測(cè)定。結(jié)果顯示,甲醇與乙腈的提取效果相近,但離心后甲醇提取液中樣品殘?jiān)鼞腋∮谔崛∫褐?不方便提取液的移取,而乙腈作為提取液則無(wú)此缺點(diǎn),而故選用乙腈作為樣品的提取溶液。

取加標(biāo)葫蘆瓜樣品2.00 g(加標(biāo)水平0.5 mg/kg),分別用10 mL乙腈提取3次,以3次提取率之和為100%計(jì)。結(jié)果顯示,前2次乙腈的提取率約為99%,故最終選擇10 mL乙腈提取2次。此時(shí)樣品稀釋10倍,再用水稀釋1倍,測(cè)定時(shí)約有30%的基質(zhì)抑制效應(yīng),若將測(cè)定液再用50%(v/v)甲醇水溶液稀釋1倍,測(cè)定時(shí)并無(wú)明顯的基質(zhì)效應(yīng)(ME)。

2.4 內(nèi)標(biāo)物的選擇

采用內(nèi)標(biāo)法定量可以校正待測(cè)物在樣品前處理中的損失,可以校正質(zhì)譜測(cè)定過(guò)程中的波動(dòng)和基質(zhì)效應(yīng)等,從而得到更好的準(zhǔn)確度和精密度,最理想的是采用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)法,但目前葫蘆素類成分尚無(wú)商品化的同位素標(biāo)記物,嘗試采用能在大氣壓化學(xué)負(fù)離子模式下電離的氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素和夾竹桃甙作為內(nèi)標(biāo)物,結(jié)果顯示，夾竹桃甙的保留時(shí)間和離子對(duì)的m/z與CuB、CuE和CuI相近,故選用夾竹桃甙作為血漿和尿液樣品的內(nèi)標(biāo)物。

2.5 方法驗(yàn)證

2.5.1線性范圍、檢出限和定量限

血漿或尿液中待測(cè)物用基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量,分別在6份各含1.00 mL空白血漿或尿液中加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,使各待測(cè)物的質(zhì)量濃度分別為0.1、0.3、1.0、2.0、5.0和10.0 μg/L,再分別按1.2.1節(jié)進(jìn)行樣品前處理和測(cè)定,采用MultiQuant定量軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,以目標(biāo)化合物的定量離子對(duì)與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(Y)對(duì)其對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(X, μg/L)進(jìn)行線性回歸(權(quán)重取1/X)。

瓜果類蔬菜樣品采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量,用50%(v/v)甲醇水溶液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,使3種葫蘆素的質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、5.0、20.0、100和500 μg/L,進(jìn)行檢測(cè),以目標(biāo)化合物的定量離子對(duì)的峰面積(Y′)對(duì)其對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(X, μg/L)進(jìn)行線性回歸(權(quán)重取1/X)。

表 2 3種葫蘆素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

Y: the peak area ratio of the quantitative ion of analyte to internal standard (weight 1/X);Y′: the peak area of the quantitative ion of analyte (weight 1/X);X: mass concentration, μg/L; # μg/kg.

表 3 血漿、尿液和葫蘆瓜中3種葫蘆素的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

# μg/kg.

血漿、尿液和瓜果類蔬菜中3種待測(cè)物的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)(r)見(jiàn)表2,相關(guān)系數(shù)均≥0.997 1,線性關(guān)系良好。在空白血漿和尿液樣品中分別加入低濃度的待測(cè)物進(jìn)行測(cè)定,以分子離子對(duì)的信噪比≥3和≥10時(shí)的樣品濃度作為檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果見(jiàn)表2。血漿和尿液中3種待測(cè)物的檢出限均為0.03 μg/L,定量限均為0.1 μg/L,能夠滿足中毒檢測(cè)的要求;瓜果類蔬菜中3種待測(cè)物的檢出限為5～10 μg/kg,定量限為15～ 40 μg/kg。

2.5.2準(zhǔn)確度和精密度

按歐洲藥品管理局(EMEA)的要求在定量限、3倍定量限、中等濃度和高濃度下進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)[24],在血漿和尿液中加標(biāo)3種葫蘆素,使各待測(cè)物濃度分別為0.1、0.3、1.0和8.0 μg/L,葫蘆瓜加標(biāo)一定水平的待測(cè)物代表瓜果類蔬菜進(jìn)行試驗(yàn),加標(biāo)水平為40、100、1 000和15 000 μg/kg,每個(gè)水平平行試驗(yàn)6次,一個(gè)工作日內(nèi)進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算平均加標(biāo)回收率和精密度。

3種待測(cè)物的加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果見(jiàn)表3。血漿和尿液的平均加標(biāo)回收率為89.0%～113%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～12.2%,符合文獻(xiàn)[24]要求;葫蘆瓜樣品的加標(biāo)回收率為87.6%～114%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1%～11.1%。表明本法用于血漿、尿液和瓜果類蔬菜中3種毒物的檢測(cè)具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

2.5.3基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

基質(zhì)效應(yīng)通過(guò)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率×100%進(jìn)行評(píng)估。ME=100%表示無(wú)基質(zhì)效應(yīng),ME>100%表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),ME<100%表示基質(zhì)抑制效應(yīng)[25]。

用50%(v/v)甲醇水溶液稀釋3種葫蘆素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,使其質(zhì)量濃度分別為0.5、1.5、5.0、10.0、25.0和50.0 μg/L,制作溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線；取6份空白血漿和尿液樣品，按1.2.1節(jié)進(jìn)行樣品前處理,加入3種葫蘆素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，使血漿或尿液樣品中3種葫蘆素的質(zhì)量濃度分別為0.1、0.3、1.0、2.0、5.0和10.0 μg/L,制作基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定并計(jì)算ME值。血漿和尿液中3種葫蘆素的ME值分別為147%～211%和133%～174%,顯示有較強(qiáng)的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),降低樣品濃縮倍數(shù)至1或2倍,但基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)并未減少。以葫蘆瓜為代表對(duì)瓜果類蔬菜進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)評(píng)估,3種葫蘆素的ME值為92.4%～98.2%,顯示無(wú)明顯的基質(zhì)效應(yīng)。

圖5 中毒患者血漿和尿液中CuB的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of CuB in the plasma and urine of poisoned patients

提取回收率則通過(guò)計(jì)算基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線與相同濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比值再乘以100%來(lái)確定[25]。在6份空白血漿和尿液中添加3種葫蘆素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,使其質(zhì)量濃度分別為0.1、0.3、1.0、2.0、5.0和10.0 μg/L,按1.2.1節(jié)進(jìn)行樣品前處理,制作基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定并計(jì)算提取回收率,血漿和尿液中3種葫蘆素的提取回收率分別為64.6%～74.8%和66.8%～81.9%。瓜果類蔬菜以葫蘆瓜為代表進(jìn)行提取回收率計(jì)算,3種葫蘆素的提取回收率約為94.3%～99.1%。

雖然經(jīng)過(guò)樣品前處理凈化,血漿和尿液中3種葫蘆素還顯示一定的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),但通過(guò)基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量,校正樣品的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收的不完全,使最終得到滿意結(jié)果,符合中毒樣品快速檢測(cè)的要求。

2.5.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

樣品提取液在自動(dòng)進(jìn)樣器樣品盤(pán)上室溫放置72 h,每間隔24 h測(cè)定1次,3種待測(cè)物的含量變化均≤9.6%,表明沒(méi)有明顯的降解。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

2017年3月24日,廣西某小學(xué)有14名學(xué)生食用苦味葫蘆瓜炒肉片后出現(xiàn)惡心、腹瀉等癥狀。采用本法檢測(cè)苦味葫蘆瓜片(熟)樣品,從中檢出CuB,含量為0.94 mg/kg。

2019年6月21日,浙江省臺(tái)州市某工廠職工在食堂就餐時(shí)食用了苦味葫蘆瓜炒肉片,有30多人發(fā)病,出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉以及腹痛等癥狀。次日收到樣品,采用本法從葫蘆瓜片(熟)樣品中檢出CuB,含量為2.15 mg/kg,從瓜皮中也檢出CuB,含量為0.068 mg/kg; 24份血漿樣品中有4份檢出CuB,含量為0.05～0.07 μg/L; 21份尿液樣品中有20份檢出CuB,含量為0.15～1.20 μg/L,中位數(shù)為0.35 μg/L,所有樣品均未檢出CuE和CuI。血漿和尿液陽(yáng)性樣品的MRM色譜圖見(jiàn)圖5。

檢測(cè)了18份市售瓜果類蔬菜樣品,其中葫蘆瓜5份、絲瓜3份、黃瓜3份、南瓜3份、冬瓜3份和苦瓜1份,有1份葫蘆瓜樣品檢出葫蘆素B,含量為0.10 mg/kg,其余均未檢出。

3 結(jié)論

本文結(jié)合食物中毒檢測(cè)的特點(diǎn)以及3種葫蘆素的化學(xué)性質(zhì),采用固相支持液液萃取法作為血漿和尿液的樣品前處理方法進(jìn)行開(kāi)發(fā),瓜果類蔬菜采用乙腈提取,再用溶劑稀釋,通過(guò)對(duì)超高效液相色譜與質(zhì)譜檢測(cè)條件的優(yōu)化,得到了較高的檢測(cè)靈敏度。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明,該法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn),滿足食物中毒檢測(cè)的要求,應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)取得了滿意結(jié)果。本法適用于血漿、尿液和瓜果類蔬菜中3種葫蘆素類成分的同時(shí)快速檢測(cè)。