宋春穎, 張華蓉, 郭志謀1,, 閆競(jìng)宇1,, 金高娃1,*, 梁鑫淼1,

(1. 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 166023; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 中科院大化所中國(guó)醫(yī)藥城生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院, 江蘇 泰州 225300)

人參為五加科人參屬(Panax ginseng C. A. Mey)的多年生宿根草本植物[1],歷來(lái)被中醫(yī)稱為百草之王,不但是滋陰補(bǔ)生、扶正固本的極品,還有利于調(diào)節(jié)血壓、恢復(fù)心臟機(jī)能、改善神經(jīng)衰弱以及身體虛弱等病癥,甚至有抗腫瘤的作用[2-6]。人參主要活性成分為人參皂苷[7],由皂苷元和糖鏈組成。其中皂苷元是疏水性基團(tuán),一般分為螺甾烷的衍生物(甾族皂苷)、四環(huán)三萜和五環(huán)三萜(三萜皂苷)3類[8]。糖鏈?zhǔn)怯H水性基團(tuán),一般由葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸中的一種或幾種組成。皂苷的皂苷元可以在不同的位置上連接不同的糖,糖鏈也可以由一種糖或者多種糖組成,因此皂苷化合物結(jié)構(gòu)多樣,也帶來(lái)不同的藥用效果。人參中的皂苷大多數(shù)為三萜皂苷,根據(jù)母環(huán)結(jié)構(gòu)主要分為原人參二醇、原人參三醇及其類似物[9]。不同類型的人參皂苷藥理活性亦不相同甚至相反,其中原人參二醇型皂苷具有良好的抗癌活性[10]。

目前人參的分離分析主要存在兩方面的問(wèn)題。一是藥典中人參相關(guān)藥材的前處理過(guò)程較繁瑣,包括加熱回流、過(guò)夜提取等[11],或者采用大孔樹(shù)脂富集皂苷類化合物,整個(gè)過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng),重復(fù)性較差,溶劑的消耗量也較大。二是色譜分析時(shí)采用高效液相色譜所用的分析時(shí)間較長(zhǎng),如中國(guó)藥典2015版中人參的液相色譜分析時(shí)間為100 min[11]。目前已有超高效液相色譜(UPLC)分析人參皂苷的報(bào)道,如姜濤等[12]測(cè)定了西洋參中西洋參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1,所建立方法的分析時(shí)間為30 min。沈小梅等[13]測(cè)定了人參酒中6種人參皂苷的含量,建立的方法分析時(shí)間為20 min。此外,在前處理方面,也有大孔樹(shù)脂及C18萃取小柱的應(yīng)用報(bào)道,如郭建博等[14]利用皂苷專用的反相模式固相萃取(SPE)小柱,測(cè)定了保健食品中人參皂苷類成分。張培旭等[15]利用超聲噴泉替代氣溶膠進(jìn)行傳質(zhì),改進(jìn)了超聲霧化提取-固相萃取法,并用于西洋參葉中的8種常見(jiàn)人參皂苷的提取。

將固相萃取方法引入中藥的前處理可提高分析效率,同時(shí)改善樣品前處理的重復(fù)性,并提高通量[16-18]。反相模式SPE的上樣溶液一般為水[19],若采用有機(jī)溶劑提取的樣品,需揮干有機(jī)溶劑并用水復(fù)溶后再進(jìn)行固相萃取柱的上樣及富集,而親水色譜模式的SPE上樣溶液一般為有機(jī)溶劑[20]。皂苷類化合物既具有親水性又具有疏水性的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),使其在親水、反相模式下均有較好的保留[21]。皂苷化合物多采用水飽和正丁醇等有機(jī)溶劑提取,提取劑與親水色譜模式SPE的上樣溶液兼容。因此本文發(fā)展了用親水色譜模式的固相萃取材料進(jìn)行人參皂苷富集與凈化的方法,結(jié)合超高效液相色譜,實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的快速分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters Acquity超高效液相色譜儀配2996型光電二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Waters); KQ5200DE超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司); Milli-Q超純水制備器(美國(guó)密理博有限公司);固相萃取裝置(VISIPREP 24TMDL);真空離心濃縮儀(美國(guó)LABCONCO);離心機(jī)(Thermo Sorvall Biofugo)。乙腈(色譜純,上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司),正丁醇(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠),乙醇(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠); Click TE Cys親水色譜模式固相萃取柱(1 g/6 mL,自主研發(fā))。

5種原人參二醇型人參皂苷(Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd,純度均≥98%)購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司,結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 5種原人參二醇型人參皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of the five protopanaxadiol ginsenosides

產(chǎn)自吉林省靖宇縣的4批、吉林省集安的1批和黑龍江省的2批人參藥材,均經(jīng)中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所執(zhí)業(yè)藥師楊小平鑒定為人參(Panax ginseng C. A. Mey)的干燥根莖,藥材分別經(jīng)粉碎后過(guò)4號(hào)篩備用。

1.2 對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱取5種原人參二醇型人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd對(duì)照品10 mg,用20%(v/v,下同)乙腈/水溶解,得到質(zhì)量濃度為5 mg/mL的各人參對(duì)照品儲(chǔ)備液。上述各對(duì)照品溶液用20%乙腈/水制備成混合對(duì)照品溶液,質(zhì)量濃度分別為500、100、50、25、10、5 μg/mL。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取人參藥材粉末100 mg,加入1 mL水飽和正丁醇,將混合之后的溶液超聲提取40 min,然后離心(5 000 r/min, 5 min),取上清液,殘?jiān)性偌尤? mL水飽和正丁醇,超聲40 min,離心(5 000 r/min, 5 min)后取上清液,將兩次的上清液合并。合并后的上清液直接上樣至活化后的親水SPE柱(Click TE-Cys),用2 mL正丁醇淋洗后,用3 mL 70%的乙醇/水進(jìn)行洗脫,收集洗脫液。洗脫液離心濃縮后用1 mL 20%的乙腈/水復(fù)溶,備用。

1.4 液相色譜方法

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH Shield RP18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為水。梯度洗脫條件:0～5 min, 29%A～29%A; 5～20 min, 29%A～36%A; 20～21 min, 36%A～95%A; 21～25 min,保持95%A不變。流速為0.3 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm;進(jìn)樣體積為3 μL;柱溫為30 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1SPE條件的優(yōu)化

前處理過(guò)程中最重要的步驟是人參皂苷的富集與凈化,采用固相萃取方法不僅方便快速,而且操作簡(jiǎn)單,重復(fù)性較好。人參皂苷由于結(jié)構(gòu)的特殊性,既有親水性的基團(tuán),又存在疏水性的基團(tuán),在反相和親水色譜模式下都有較好的保留[21],因此除反相色譜材料外,可以選擇親水色譜模式的固相萃取材料,這樣經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑提取之后可以直接上樣至固相萃取柱,不需要再經(jīng)過(guò)濃縮復(fù)溶的步驟,簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程。

圖2 不同SPE洗脫液條件下的人參提取物的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of ginseng extract with different SPE eluents SPE eluent: 2 mL ethanol/water; ethanol volume percentage: (a) 80%, (b) 70%, (c) 60%, (d) 50%. HPLC mobile phase A: ACN; B: H2O; gradient elution time: 0-10 min, 19%A-19%A; 10-16 min, 19%A-29%A; 16-20 min, 29%A-29%A; 20-28 min, 29%A-40%A; 28-34 min, 40%A-90%A; 34-40 min, 90%A-100%A; flow rate: 0.3 mL/min; detection wavelength: 203 nm; column temperature: 30 ℃. Peak identifications: 1. Rb1; 2. Rc; 3. Rb2; 4. Rb3; 5. Rd.

根據(jù)課題組前期研究,選擇了親水性能極好的分離材料Click TE Cys[22]進(jìn)行人參皂苷的富集和凈化,并進(jìn)行了洗脫液和洗脫體積的優(yōu)化。優(yōu)化洗脫液時(shí),配制體積分?jǐn)?shù)為80%、70%、60%、50%的乙醇/水溶液,采用各2 mL進(jìn)行SPE洗脫。結(jié)果如圖2所示,體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇/水溶液(見(jiàn)圖2b)可將大部分目標(biāo)皂苷化合物洗脫下來(lái)。進(jìn)一步優(yōu)化洗脫液體積,結(jié)果如圖3所示。第2個(gè)1 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇/水溶液(見(jiàn)圖3b)可洗脫下較多的目標(biāo)化合物,第3個(gè)1 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇/水洗脫液中還有少量的目標(biāo)化合物。為洗脫完全,最終確定洗脫液為3 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇/水溶液。

圖3 不同SPE洗脫體積條件下的人參提取物的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of ginseng extract with different SPE eluent volumes SPE eluent: 70% (v/v) ethanol/water; volume: (a) 1st 1 mL, (b) 2nd 1 mL, (c) 3rd 1 mL, (d) 4th 1 mL. The chromatographic separation conditions and the peak identifications were the same as those in Fig. 2.

確定固相萃取方法后,對(duì)前處理效果進(jìn)行了對(duì)比。稱量?jī)煞萑藚悠?其中一份參照藥典方法[11]經(jīng)水飽和正丁醇提取定容后直接進(jìn)行UPLC的分析。另外一份樣品在水飽和正丁醇提取后,進(jìn)行親水模式的SPE提取,并接取上樣溢出液、淋洗液以及洗脫液進(jìn)行UPLC分析。結(jié)果如圖4所示,超聲提取液直接色譜分析時(shí),因弱極性物質(zhì)干擾較大,20～30 min流出的目標(biāo)物響應(yīng)不明顯且干擾較多(見(jiàn)圖4a); SPE過(guò)程中的上樣溢出液(見(jiàn)圖4b)以及淋洗液(見(jiàn)圖4c)中沒(méi)有目標(biāo)化合物的損失,而SPE洗脫液中(見(jiàn)圖4d),目標(biāo)化合物得到富集及凈化,30 min之后的弱極性雜質(zhì)被去除。液相色譜分析時(shí),若不及時(shí)沖柱,這些弱極性物質(zhì)會(huì)積累在色譜柱中,影響色譜柱的重復(fù)性和使用壽命。由此可見(jiàn),所建立的親水模式的SPE前處理方法具有較好的效果。與中國(guó)藥典2015版中人參兩次回流提取方法[11]相比,SPE方法具有操作簡(jiǎn)單、通量高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。

圖4 人參提取物經(jīng)SPE處理的效果Fig. 4 Effect of the SPE processes on the ginseng extract a. without SPE; b. loading effluent of SPE; c. cleaning effluent of SPE; d. eluent of SPE. The chromatographic separation conditions and the peak identifications were the same as those in Fig. 2.

2.1.2UPLC條件的優(yōu)化

圖2～4中UPLC的分析條件是在2015版《中國(guó)藥典》人參含量測(cè)定的液相色譜條件[11]基礎(chǔ)上,根據(jù)色譜填料粒徑的改變,改變流速、進(jìn)樣量和洗脫梯度而得到的[23]。由圖2～4可以看出,目標(biāo)化合物主要集中在中間區(qū)域,為進(jìn)一步縮短分析時(shí)間并改善人參皂苷Rd峰的分離度,優(yōu)化了梯度條件。圖5是優(yōu)化流動(dòng)相比例后混合對(duì)照品和實(shí)際樣品的色譜圖?？梢钥闯?目標(biāo)物保留適中,分離度良好。

圖5 (a)人參皂苷對(duì)照品與(b)人參樣品提取物的色譜圖Fig. 5 Chromatograms of (a) reference standards of ginsenosides and (b) ginseng extract Peak identifications: 1. Rb1; 2. Rc; 3. Rb2; 4. Rb3; 5. Rd.

表 1 5種對(duì)照品的線性方程、線性范圍、r2、檢出限和定量限

y: peak area;x: mass concentration of the target compound (μg/mL).

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1線性關(guān)系、檢出限和定量限

在優(yōu)化后的色譜分析條件下,利用UPLC分析對(duì)照品溶液,以人參皂苷的質(zhì)量濃度(x, μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如表1所示,5種人參皂苷在5～500 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.999。以信噪比(S/N)為3確定5種目標(biāo)物的檢出限(LOD)在1.37～2.56 μg/g之間,以S/N為10確定5種化合物的定量限(LOQ)在4.57～8.54 μg/g之間。

2.2.2精密度試驗(yàn)

按1.3節(jié)制備人參供試品溶液,按1.4節(jié)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣、測(cè)定6次,記錄峰面積。結(jié)果見(jiàn)表2。可以看出,5種人參皂苷峰面積的RSD值在0.95%～2.62%之間,說(shuō)明方法精密度良好。

2.2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1.3節(jié)供試品溶液適量,分別于室溫下放置0、2、4、8、12、16、20、22 h,按1.4節(jié)色譜條件進(jìn)樣、測(cè)定。結(jié)果表明見(jiàn)表2, 5種原人參二醇型人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd峰面積的RSD分別為0.96%、0.92%、1.32%、0.90%、2.15%(n=8),表明供試品溶液室溫放置22 h穩(wěn)定性良好。

2.2.4重復(fù)性試驗(yàn)

稱取6份人參藥材,按1.3節(jié)方法平行制備供試樣品溶液,按1.4節(jié)色譜條件測(cè)定,記錄峰面積。結(jié)果見(jiàn)表2, 5種原人參二醇型人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd峰面積的RSD分別為5.35%、6.23%、5.69%、6.47%、5.97%(n=6)。第2天和第3天各稱取1份人參藥材,按1.3節(jié)方法制備供試樣品溶液,按1.4節(jié)色譜條件測(cè)定,記錄峰面積。結(jié)果見(jiàn)表2, Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd峰面積的RSD分別為5.56%、6.34%、5.59%、6.34%、6.06%(n=8)。結(jié)果說(shuō)明方法的日內(nèi)、日間重復(fù)性良好。

表 2 方法的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性、

2.2.5回收率試驗(yàn)

在提取前,對(duì)人參樣品進(jìn)行加標(biāo),加標(biāo)量為Rb1: 5 mg/mL,加入38 μL; Rc: 5 mg/mL,加入24 μL; Rb2: 5 mg/mL,加入22 μL; Rb3: 1 mg/mL,加入15 μL; Rd: 2 mg/mL,加入36 μL。按1.3節(jié)平行處理6份加標(biāo)樣品,按1.4節(jié)色譜條件測(cè)定,記錄峰面積,結(jié)果見(jiàn)表3?？梢钥闯?平均加標(biāo)回收率在87.16%～101.92%范圍內(nèi),Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd峰面積的RSD分別為3.19%、3.76%、4.02%、1.65%、1.54%(n=6),表明該方法適用于人參中5種原人參二醇型人參皂苷的分析。

表 3 5種化合物在實(shí)際樣品中的加標(biāo)回收率(n=6)

2.3 實(shí)際樣品的分析

環(huán)境不同,會(huì)導(dǎo)致不同產(chǎn)地人參的皂苷含量有些許差異。應(yīng)用本方法對(duì)7個(gè)不同產(chǎn)地、批號(hào)的人參樣品(編號(hào)記為A～G)進(jìn)行分析。每個(gè)批號(hào)的樣品按1.3節(jié)方法平行處理3份,按1.4節(jié)方法進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表4?？梢钥闯?黑龍江省樣品(E、F)的Rb1、Rb2、Rb3、Rc含量較高;而吉林集安人參樣品(G)的Rd含量較高。

表 4 不同人參樣品中5種化合物的含量

3 結(jié)論

本文采用親水色譜模式的固相萃取結(jié)合超高效液相色譜對(duì)人參中5種原人參二醇型人參皂苷的含量進(jìn)行了測(cè)定。該方法選擇水飽和正丁醇超聲提取人參藥材,提取液直接上樣至親水色譜模式的固相萃取小柱進(jìn)行人參皂苷成分的富集和凈化,去除了弱極性化合物的干擾,有利于色譜柱的重復(fù)性和使用壽命。此外,該方法快速簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好,適用于人參中原人參二醇型人參皂苷的定量檢測(cè)。