侯建波, 謝 文, 錢 艷, 史穎珠, 陸 順, 盛 濤, 陳文彬

(1. 杭州海關(guān)技術(shù)中心, 浙江 杭州 310016; 2. 浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院, 浙江 杭州 310016; 3. 浙江立德產(chǎn)品技術(shù)有限公司, 浙江 杭州 310016; 4. 福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院, 福建 福州 350002)

蜂蜜是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的天然物質(zhì),富含多種維生素、微量元素、氨基酸及人體可直接吸收的單糖、黃酮類、有機(jī)酸類和酶類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。隨著人們生活水平的提高,對(duì)蜂蜜的消費(fèi)需求和質(zhì)量要求也在不斷提升,然而蜂蜜中藥物殘留量超標(biāo)、蜂蜜摻假等事件的發(fā)生,嚴(yán)重影響了蜂蜜的產(chǎn)業(yè)發(fā)展和消費(fèi)者信心。研究人員通過感官評(píng)定、色譜法、質(zhì)譜法、氣體穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜法、核磁共振波譜法等多種方式對(duì)蜂蜜中藥物殘留指標(biāo)、理化指標(biāo)和摻假信號(hào)開展了系列研究[2-5],以保證蜂蜜的品質(zhì)和質(zhì)量。

黃酮類化合物和有機(jī)酸是蜂蜜自身含有的有效成分,其化合物的種類和含量高低對(duì)評(píng)價(jià)蜂蜜的質(zhì)量特別是蜂蜜種類具有重要的輔助作用?？焖佟?zhǔn)確地檢測(cè)蜂蜜中黃酮類化合物的成分和含量,對(duì)提升蜂蜜質(zhì)量、確定蜂蜜品種和產(chǎn)地具有積極的意義。

近些年黃酮類化合物的研究主要集中在總黃酮測(cè)定[6-8]、活性研究[9,10]、黃酮類化合物成分含量分析等方面[11-16]。其中化合物含量的測(cè)定以吸附樹脂凈化-液相色譜法檢測(cè)為主，然而液相色譜法測(cè)定存在定量限高和多組分分離難度大等不足,檢測(cè)主要集中在含量較高的常見化合物(如:槲皮素、柚皮素、橙皮素,山柰酚、木犀草素、白楊素和高良姜素等),吸附樹脂凈化前處理存在蜂蜜取樣量大、樹脂凈化材料和所用試劑多及實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)等情況[17,18]。因此,陸續(xù)有研究人員通過固相萃取凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法開展黃酮類化合物的檢測(cè)分析[19,20]。

本文通過C18固相萃取柱凈化,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定,建立了同時(shí)定量測(cè)定蜂蜜中阿魏酸、蘆丁、楊梅素、桑黃素、槲皮素、柚皮素、橙皮素、木犀草素、染料木素、山柰酚、異鼠李素、芹菜素、松屬素、漢黃芩素、白楊素、高良姜素和芫花素17種化合物(結(jié)構(gòu)式見圖1)含量的方法,并進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)考察研究和實(shí)際樣品分析。該方法具有樣品用量少、所需試劑少、檢測(cè)時(shí)間短等特點(diǎn),可實(shí)現(xiàn)蜂蜜中黃酮類化合物的批量、低能耗、快速和高效準(zhǔn)確測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

API 4000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源,AB公司,美國(guó)), 1100型液相色譜儀(Agilent公司,美國(guó)), Milli-Q Synergy 185型超純水器(Millipore公司,美國(guó)), IKA MS3 Basic型渦旋器(IKA公司,德國(guó)), 24孔固相萃取裝置(Supelco公司,美國(guó)), Heraeus Multifuge X1R型臺(tái)式離心機(jī)(Thermo公司,美國(guó)), G&G JJ500型電子天平(雙杰公司), Mettler AE260(Mettler Toledo公司,瑞士)。

圖1 目標(biāo)化合物的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of the target compounds

甲醇(色譜純,美國(guó)Tedia公司),甲酸(質(zhì)譜級(jí),Scharlau公司), C18固相萃取柱(6 mL, 500 mg, Waters公司)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):阿魏酸(純度98.0%)、蘆丁(純度95.0%)、松屬素(純度98.0%)、白楊素(純度98.0%)、芫花素(純度97.0%)購自TRC公司;楊梅素(純度94.0%)、桑黃素(純度90.9%)、槲皮素(純度96.4%)、柚皮素(純度94.9%)、橙皮素(純度99.0%)、木犀草素(純度96.9%)、異鼠李素(純度92.2%)、漢黃芩素(純度92.9%)、高良姜素(純度99.6%), ChromaDex公司;染料木素(純度99.1%)、山柰酚(純度95.5%)購自中國(guó)藥品生物制品檢定所;芹菜素(純度98.5%)購自Bepure公司。用甲醇將各化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶解,稀釋并定容獲得10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,根據(jù)需要用甲醇將其儲(chǔ)備液稀釋至所需濃度。

1.2 實(shí)驗(yàn)部分

1.2.1樣品前處理

稱取5 g試樣(精確到0.01 g)置于50 mL具塞離心管中,加入20 mL pH 2鹽酸溶液, 2 000 r/min渦旋混合5 min,以8 500 r/min離心5 min,取上清液轉(zhuǎn)移至C18固相萃取柱中(依次用5 mL甲醇、5 mL水和5 mL pH 2鹽酸溶液活化),提取離心管分別用5 mL pH 2鹽酸溶液和5 mL水洗滌并轉(zhuǎn)移至固相萃取柱,抽干,加入5 mL甲醇進(jìn)行洗脫,控制流速1～2 mL/min,收集全部洗脫液于15 mL離心管中,加入水定容至10 mL,搖勻,過0.22 μm有機(jī)濾膜,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.2色譜參數(shù)

色譜柱:Inertsil ODS-3(150 mm×4.6 mm, 3 μm)。流動(dòng)相: A. 甲醇;B. 0.15%(v/v)甲酸溶液。流動(dòng)相線性梯度洗脫程序:0～10.0 min,40%A～75%A; 10.0～15.0 min,75%A～90%A; 15.0～22.0 min, 90%A;22.0～23.0 min,90%A～40%A; 23.0～30.0 min, 40%A。流速0.4 mL/min,進(jìn)樣量20 μL,柱溫25 ℃。

1.2.3質(zhì)譜參數(shù)

離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描模式:負(fù)離子掃描;監(jiān)測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);電噴霧電壓(IS): -4 500 V;霧化氣壓力(GS1): 289 kPa(42 psi);氣簾氣壓力(GS2): 310 kPa(45 psi);輔助氣流速(CUR): 172 kPa(25 psi);離子源溫度(TEM): 540 ℃;其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

蜂蜜樣品中藥物殘留檢測(cè)通常采用水溶液將蜂蜜進(jìn)行稀釋,通過有機(jī)溶劑提取目標(biāo)化合物的同時(shí)去除蜂蜜中糖分的影響。根據(jù)文獻(xiàn)[14,15]的研究及黃酮類化合物和阿魏酸偏酸性的性質(zhì),實(shí)驗(yàn)對(duì)比了pH 2鹽酸溶液、水、pH 8磷酸鹽溶液(13.8 g磷酸二氫鈉溶解于950 mL水中,用0.1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)pH=8,定容至1 000 mL)3種環(huán)境下的提取效果,結(jié)果如圖2所示,蘆丁、柚皮素、橙皮素、染料木素、松屬素、白楊素、芫花素在3種不同pH值環(huán)境下提取回收率均大于70%;楊梅素、桑黃素、槲皮素、木犀草素、山柰酚、異鼠李素和高良姜素在pH 2時(shí)回收率大于65%,在水和pH 8磷酸鹽溶液時(shí)回收率小于60%;阿魏酸在pH 2和水中的提取效率大于85%, pH 8磷酸鹽溶液的提取效果僅22%。因此,實(shí)驗(yàn)最終采用pH 2鹽酸溶液對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行稀釋,凈化過程中采用水淋洗來去除蜂蜜中的糖分。

表 1 目標(biāo)化合物的質(zhì)譜測(cè)定條件

* Quantitative ion.

2.2 凈化條件的選擇

圖2 不同pH條件下各化合物的提取結(jié)果Fig. 2 Extraction results for each compound at different pH levels

圖3 采用不同固相萃取柱的凈化結(jié)果Fig. 3 Purification results with different solid phase extraction columns

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行定量測(cè)定時(shí),通常采用液-液萃取凈化、固相萃取凈化、QuEChERS等凈化方式來降低脂類、蛋白質(zhì)和糖分等物質(zhì)帶來的背景干擾,減少基質(zhì)效應(yīng)的影響,提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)考察了C18(3 mL, 500 mg, Anpel公司;6 mL, 500 mg, Waters公司;6 mL, 500 mg, Agilent公司)、HLB(6 mL, 500 mg, Waters公司)和Strata-X 33u(6 mL, 500 mg, Phenomenex公司)3種類型固相萃取柱的凈化情況。實(shí)驗(yàn)在pH 2鹽酸溶液中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液并轉(zhuǎn)移至活化好的固相萃取柱中,通過5 mL pH 2鹽酸溶液和5 mL水依次淋洗,5 mL甲醇洗脫的方式進(jìn)行凈化。結(jié)果如圖3所示,阿魏酸、蘆丁、柚皮素、橙皮素、染料木素、芹菜素、漢黃芩素在不同固相萃取柱的凈化回收率均大于70%,其他化合物在采用HLB固相萃取柱時(shí)楊梅素、白楊素和芫花素凈化回收率小于65%, Strata-X 33u固相萃取柱時(shí)楊梅素、桑黃素、槲皮素、山柰酚、白楊素、高良姜素和芫花素的凈化回收率小于68%, 3種C18固相萃取柱凈化的回收率均大于80%,最終采用Waters C18固相萃取柱開展方法學(xué)考察。

2.3 色譜條件的考察

試驗(yàn)對(duì)比了Agilent Eclipse SB-C18(150 mm×4.6 mm, 3 μm)和Shimadzu Inertsil ODS-3(150 mm×4.6 mm, 3 μm)兩種色譜柱,以甲醇或乙腈為有機(jī)相,0.15%甲酸溶液為水相對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離。結(jié)果表明,在相同色譜條件(甲醇-0.15%甲酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫)下,楊梅素的信號(hào)響應(yīng)在Inertsil ODS-3色譜柱中高出Agilent Eclipse SB-C18色譜柱8倍,高良姜素在Agilent Eclipse SB-C18色譜柱的分離譜峰存在一定的拖尾現(xiàn)象。以Inertsil ODS-3色譜柱為分析柱對(duì)比甲醇和乙腈的分離效果,其中甲醇為有機(jī)相時(shí),楊梅素的信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度高出乙腈為有機(jī)相時(shí)的25倍,高良姜素的信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度高出乙腈為有機(jī)相時(shí)的4倍。最終采用Inertsil ODS-3色譜柱和甲醇-0.15%甲酸溶液作為分離體系進(jìn)行梯度洗脫。

色譜分離通常以初始流動(dòng)相進(jìn)行定容,對(duì)溶液質(zhì)量濃度為20 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)試發(fā)現(xiàn):以甲醇-0.15%甲酸溶液(4∶6,v/v)稀釋定容時(shí),楊梅素在放置2 h時(shí)信號(hào)下降15%,放置4 h時(shí)信號(hào)下降25%;以甲醇定容時(shí),楊梅素放置4 h時(shí)信號(hào)下降小于10%,阿魏酸、蘆丁色譜峰會(huì)出現(xiàn)一定的伸舌現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)還表明:以蜂蜜基質(zhì)溶液定容時(shí),測(cè)定化合物的穩(wěn)定性有效提高,且各化合物譜峰信號(hào)較好(見圖4);20 h內(nèi)化合物信號(hào)強(qiáng)度下降小于10%。因此選擇蜂蜜基質(zhì)溶液作為線性工作曲線的定容溶液。

圖4 蜂蜜加標(biāo)樣品的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖(加標(biāo)量20 μg/kg)Fig. 4 LC-MS/MS chromatograms of a spiked honey sample (spiked at 20 μg/kg)

2.4 質(zhì)譜條件的考察

實(shí)驗(yàn)對(duì)黃酮類化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行稀釋,采用流動(dòng)注射的方式在負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子全掃描,確定分子離子峰,再分別以待測(cè)化合物的分子離子為母離子,對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描。按照歐盟EC/657指令的要求,進(jìn)行化合物定量確證時(shí)必須滿足4個(gè)識(shí)別點(diǎn)(母離子1點(diǎn),特征子離子1.5點(diǎn)/個(gè)),選擇兩個(gè)特征子離子,其中以信噪比高、峰形好、干擾小的離子對(duì)作為定量離子對(duì)。在負(fù)離子模式下以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式優(yōu)化各種質(zhì)譜參數(shù),獲得的最佳質(zhì)譜條件參見表1。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定藥物殘留時(shí),樣品基質(zhì)對(duì)待測(cè)化合物具有增強(qiáng)或抑制效應(yīng),從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)通過對(duì)比相同濃度的溶劑工作液和蜂蜜基質(zhì)加標(biāo)溶液中各化合物的信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度,計(jì)算離子抑制率(離子抑制率(%)=(蜂蜜基質(zhì)加標(biāo)溶液的響應(yīng)強(qiáng)度-溶劑工作液的響應(yīng)強(qiáng)度)×100%/溶劑工作液的響應(yīng)強(qiáng)度)來考察基質(zhì)效應(yīng)情況[21]。研究表明各化合物在麥盧卡蜂蜜、椴樹蜜、洋槐蜜等不同蜂蜜中的基質(zhì)效應(yīng)趨勢(shì)一致,其中定量離子對(duì)在雜花蜜中的抑制率如表2所示,可以看出,阿魏酸、桑黃素、柚皮素、山柰酚和白楊素存在較為明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)(離子抑制率為-26.7%～-42.7%),楊梅素和槲皮素存在較為明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)(離子抑制率為68.1%和43.1%)。因此,試驗(yàn)采用空白蜂蜜(指不含目標(biāo)化合物的市售蜂蜜)基質(zhì)溶液對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行稀釋獲得線性工作曲線進(jìn)行定量計(jì)算,來降低蜂蜜基質(zhì)效應(yīng)的影響,同時(shí)提高化合物的穩(wěn)定性和檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。

2.6 方法的線性關(guān)系和定量限

在空白蜂蜜基質(zhì)溶液中添加混合標(biāo)準(zhǔn)工作液獲得基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液,目標(biāo)物質(zhì)量濃度為0、10、20、50、100 μg/L(相當(dāng)于樣品中含目標(biāo)化合物0、20、40、100、200 μg/kg)。在確定的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定其峰面積,以標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積Y為縱坐標(biāo),以待測(cè)物的含量X(μg/kg)為橫坐標(biāo),繪制各化合物的工作曲線,結(jié)果表明,各化合物在10～100 μg/L范圍內(nèi),線性方程的相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.997。以信噪比大于10確定方法的定量限為20 μg/kg。

2.7 方法回收率及精密度試驗(yàn)

在蜂蜜樣品中對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行3個(gè)水平20、40、100 μg/kg的添加回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平取6個(gè)平行樣,采用外標(biāo)法定量,結(jié)果如表3所示,方法的回收率為64.5%～113%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～14.5%。符合GB/T 27404-2008的質(zhì)量控制要求。

表 2 蜂蜜基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)(n=3)

Mass concentration: 20 μg/L.

表 3 蜂蜜樣品中3個(gè)加標(biāo)水平下目標(biāo)物的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

表 3 (續(xù))

2.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本方法對(duì)22個(gè)蜂蜜樣品(新西蘭麥盧卡蜂蜜8個(gè),新西蘭其他蜜源蜂蜜5個(gè),俄羅斯蜂蜜3個(gè)(均為椴樹蜜),中國(guó)蜂蜜6個(gè)(椴樹蜜1個(gè),洋槐蜜2個(gè),雜花蜜3個(gè)))進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果(見表4)表明,麥盧卡蜂蜜和新西蘭其他蜜源蜂蜜的槲皮素、柚皮素、木犀草素、異鼠李素、松屬素、白楊素和高良姜素高于在俄羅斯和中國(guó)的椴樹蜜、洋槐蜜或雜花蜜中的含量。因此,對(duì)蜂蜜中黃酮類化合物的含量測(cè)定對(duì)確定新西蘭產(chǎn)地的蜂蜜具有輔助作用。

表 4 蜂蜜樣品中黃酮類化合物的含量

3 結(jié)論

本文通過使用酸性溶液稀釋,C18固相萃取柱凈化,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè),外標(biāo)法定量,實(shí)現(xiàn)了對(duì)蜂蜜中蘆丁、楊梅素、桑黃素、槲皮素、柚皮素、橙皮素、木犀草素、染料木素、山柰酚、異鼠李素、芹菜素、松屬素、漢黃芩素、白楊素、高良姜素、芫花素和阿魏酸17種化合物含量的同時(shí)測(cè)定。該方法具有試驗(yàn)樣品用量少,試劑用量少,實(shí)驗(yàn)用時(shí)短等特點(diǎn)。適合批量、快速檢測(cè)蜂蜜樣品中黃酮類化合物和阿魏酸的含量,對(duì)提升蜂蜜蜜源的識(shí)別具有重要的輔助作用。