李 威 張 旭 趙芳園 匡洪影 劉婷婷

近年來(lái)由于人們生活習(xí)慣的變化，糖尿病發(fā)生率逐年增加，已經(jīng)成為危害健康的主要疾病之一[1]。糖尿病患者較高的血糖水平對(duì)肝功能有重要的影響，在2型糖尿病患者中非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)生率高達(dá)34%～74%[2]。較高的血糖水平可能導(dǎo)致肝臟細(xì)胞中活性氧簇水平的升高及炎性因子表達(dá)水平的異常，從而引起肝纖維化的發(fā)生[3]。降低高血糖對(duì)肝細(xì)胞功能的影響對(duì)提高糖尿病患者生活質(zhì)量有重要意義。

中藥黃連是中醫(yī)治療肝病的常用藥,而小檗堿是黃連的主要有效成分之一，臨床和實(shí)驗(yàn)研究均發(fā)現(xiàn)小檗堿具有明確的降糖、調(diào)脂作用[4,5]。因此筆者推測(cè)，小檗堿可能對(duì)由高血糖造成的肝細(xì)胞功能異常有治療作用。本研究采用小檗堿處理經(jīng)高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的HEPG2細(xì)胞，觀察小檗堿作用后細(xì)胞的活力、脂代謝能力、氧化應(yīng)激水平及炎性因子表達(dá)水平的變化，探討小檗堿對(duì)高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)HEPG2細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:實(shí)驗(yàn)用人源肝臟HEPG2細(xì)胞系購(gòu)自上海繼和生物科技有限公司，培養(yǎng)于含10% FBS的1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h換液1次，2～3天傳代1次，待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)后用于后續(xù)研究。

2.藥品及試劑：實(shí)驗(yàn)用小檗堿(上海源葉生物公司，批號(hào)：B21379)、葡萄糖(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：G7021-100G)、油酸鈉(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：Q7501-10G)、尼羅紅(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：72485)、細(xì)胞活性氧檢測(cè)試劑盒(中國(guó)碧云天公司，批號(hào)：S0033)、IL-6檢測(cè)試劑盒[舜冉(上海)生物科技有限公司，批號(hào)：DECO0291]、TNF-α檢測(cè)試劑盒[舜冉(上海)生物科技有限公司，批號(hào)：DECO0038]、PAI-1檢測(cè)試劑盒[舜冉(上海)生物科技有限公司，批號(hào)：DECO1754]、SREBP-1C抗體(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab28481)、FAS(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab22759)、SCD(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab39969)、AMPK(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab 3759)、P-AMPK(美國(guó)Cell signaling公司，批號(hào)：500815)、ACC(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab 72046)、P-ACC(ser79)(美國(guó)Cell signaling公司，批號(hào)：118185)、ACTINβ抗體(美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：sc-70319)。

3.實(shí)驗(yàn)主要儀器：M7000熒光顯微鏡(美國(guó)Evos公司)；LC480實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Roch公司)；ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)；凝GelDoc EZ膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Biored公司)。

4.小檗堿藥物作用濃度的確定:正式實(shí)驗(yàn)前，使用96孔板培養(yǎng)HEPG2細(xì)胞待細(xì)胞鋪滿板底后，按照濃度梯度分別向培養(yǎng)液中加入終濃度為0、10、20、40、80、160μmol/L的小檗堿，采用CCK8法檢測(cè)不同濃度小檗堿作用24h后細(xì)胞活力變化，使用GraphPad Prism 7軟件計(jì)算得到小檗堿培養(yǎng)HEPG2細(xì)胞24h的IC50值為71.21μmol/L。為了在不影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)的情況下研究小檗堿的藥效機(jī)制，在后續(xù)研究中以小檗堿IC50濃度的50%即35μmol/L作為小檗堿的最高作用濃度。

5.實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理:體外培養(yǎng)的HEPG2細(xì)胞隨機(jī)分為5組，即對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組及高劑量組。對(duì)照組為不加葡萄糖及小檗堿的正常細(xì)胞，其余4組參照文獻(xiàn)[6]，均加入終濃度為25mmol/L的葡萄糖。高劑量組細(xì)胞在加入葡萄糖的同時(shí)還加入終濃度為35μmol/L(50% IC50)的小檗堿，并按照小檗堿終濃度50%遞減的原則設(shè)立中劑量組(小檗堿終濃度18μmol/L)及低劑量組(小檗堿終濃度9μmol/L)。各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)檢測(cè)。

6.體外培養(yǎng)HEPG2細(xì)胞脂代謝能力檢測(cè)：各組部分細(xì)胞在培養(yǎng)液中加入終濃度為200μmol/L油酸鈉， 24h培養(yǎng)結(jié)束后，使用終濃度為0.5μg/ml的尼羅紅對(duì)細(xì)胞內(nèi)的脂類物質(zhì)染色30min，部分細(xì)胞經(jīng)Hochest33342復(fù)染，于熒光顯微鏡下對(duì)細(xì)胞590nm熒光強(qiáng)度進(jìn)行拍照比較；剩余細(xì)胞經(jīng)消化收集后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)590nm紅色熒光強(qiáng)度。

7.體外培養(yǎng)HEPG2細(xì)胞活性氧簇水平檢測(cè)：細(xì)胞活性氧檢測(cè)利用DCFH-DA探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)行標(biāo)記。細(xì)胞終止培養(yǎng)后加入0.5ml 10μmol/L的DCFH-DA探針，于37℃下孵育45min，部分細(xì)胞經(jīng)Hochest33342復(fù)染后對(duì)530nm綠色熒光強(qiáng)度進(jìn)行拍照比較；其余細(xì)胞經(jīng)消化收集，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)525nm細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

8.細(xì)胞內(nèi)炎性因子表達(dá)水平檢測(cè)：各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，使用RIPA裂解液冰浴狀態(tài)下裂解細(xì)胞，收集蛋白裂解液，經(jīng)BCA法測(cè)定總蛋白濃度后，采用ELISA試劑盒按照說(shuō)明書(shū)對(duì)樣本中相應(yīng)因子濃度進(jìn)行檢測(cè)，得到的結(jié)果與樣本總蛋白濃度做比值后則為單位質(zhì)量細(xì)胞中炎性相關(guān)因子IL-6、TNF-α及PAI-1的表達(dá)水平。

9.實(shí)時(shí)定量PCR：各組細(xì)胞在培養(yǎng)結(jié)束后使用Trizol法抽提細(xì)胞內(nèi)總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，使用SYBR Green染料法及LC480實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平，各基因引物序列詳見(jiàn)表1。

10.蛋白印跡實(shí)驗(yàn):各組細(xì)胞在藥物處理完成后使用RIPA裂解液冰浴狀態(tài)下裂解，按每組每個(gè)指標(biāo)50μg總蛋白的標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)電泳轉(zhuǎn)印過(guò)程將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，經(jīng)相應(yīng)抗體孵育后加入ECL發(fā)光液，使用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)進(jìn)行放射自顯影檢測(cè)，所獲得的圖像使用軟件分析密度與面積，目標(biāo)蛋白的相對(duì)相對(duì)表達(dá)水平=目標(biāo)基因密度×面積/同組ACTINβ密度×面積。

表1 引物序列

結(jié) 果

1.小檗堿對(duì)HEPG2細(xì)胞脂肪代謝功能的影響:用尼羅紅染色的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì)的殘留水平的結(jié)果表明，葡萄糖誘導(dǎo)后的HEPG2細(xì)胞中脂類物質(zhì)蓄積水平顯著上升。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果也表明，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞紅色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(對(duì)照組3734.33±191.98，模型組27836.00±1716.34，P<0.01)。而小檗堿能以劑量依賴方式降低細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì)水平，隨著小檗堿終濃度的提高細(xì)胞內(nèi)紅色熒光強(qiáng)度逐漸降低(圖1)，且與模型組比較，各濃度小檗堿作用后細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(低劑量組16049.33±907.52，P<0.01；中劑量組11717.00±182.79，P<0.01；高劑量組4922.33±161.57，P<0.01)。

圖1、HEPG2細(xì)胞尼羅紅染色結(jié)果及流式細(xì)胞檢測(cè)直方圖葡萄糖誘導(dǎo)后與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞尼羅紅染色熒光強(qiáng)度增加，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果峰明顯右移；隨著小檗堿濃度的增加尼羅紅染色后的熒光強(qiáng)度逐漸降低，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果峰值與模型組比較逐漸左移

2.小檗堿對(duì)HEPG2細(xì)胞脂肪代謝相關(guān)因子表達(dá)水平的影響:各組細(xì)胞中脂代謝相關(guān)關(guān)鍵因子的mRNA及蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP-1)及脂肪酸合成酶(FAS)mRNA的表達(dá)水平顯著升高而硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)mRNA的表達(dá)水平顯著降低；小檗堿以劑量依賴方式降低模型細(xì)胞中SREBP-1C及FAS mRNA的表達(dá)水平同時(shí)提高了SCD mRNA的表達(dá)水平，在中劑量組及高劑量組中表現(xiàn)的極為顯著(圖2A)。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中SREBP-1C及FAS的蛋白表達(dá)水平顯著升高而SCD蛋白表達(dá)水平顯著降低(圖2B)。小檗堿以劑量依賴的方式顯著降低模型組細(xì)胞中SREBP-1C蛋白表達(dá)水平，同時(shí)顯著提高葡萄糖誘導(dǎo)的HEPG2細(xì)胞中SCD的蛋白表達(dá)水平，但小檗堿對(duì)HEPG2細(xì)胞中FAS蛋白表達(dá)水平的影響未發(fā)現(xiàn)明顯的劑量依賴特征(圖2C)。

圖2 脂代謝相關(guān)因子mRNA及蛋白表達(dá)水平檢測(cè)A.脂代謝關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)水平檢測(cè)；B.關(guān)鍵因子蛋白表達(dá)水平檢測(cè)；C.蛋白表達(dá)水平灰度分析;與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

3.小檗堿對(duì)HEPG2細(xì)胞ROS水平的影響：依據(jù) “二次打擊學(xué)說(shuō)”，肝細(xì)胞脂類物質(zhì)沉積可能影響細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平及活性氧簇(ROS)的代謝平衡。本研究對(duì)各組細(xì)胞ROS的水平的檢測(cè)結(jié)果表明，經(jīng)葡萄糖誘導(dǎo)后，體外培養(yǎng)的HEPG2細(xì)胞活性氧簇水平顯著上升，與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞DCFH-DA染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)(對(duì)照組1071.00±53.00，模型組5609.50±231.51，P<0.01)。小檗堿以計(jì)量依賴的方式降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，隨著小檗堿終濃度的提高細(xì)胞內(nèi)活性氧簇水平逐漸降低，細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度逐漸下降，與模型組比較各濃度小檗堿作用后流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的細(xì)胞熒光強(qiáng)度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(低劑量組4460.53±208.57，P<0.01；中劑量組2708.00±33.12，P<0.01；高劑量組1309.82±170.50，P<0.01)，詳見(jiàn)圖3。

圖3 HEPG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)及流式細(xì)胞直方圖(DCFH-DA染色，×100)葡萄糖誘導(dǎo)后與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度增加，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果峰明顯右移；隨著小檗堿濃度的增加綠色熒光強(qiáng)度逐漸降低，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果峰值與模型組比較逐漸左移

4.小檗堿對(duì)HEPG2細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)因子表達(dá)水平的影響:各組細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)的關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)抗氧化因子超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GSR)及過(guò)氧化氫酶(CAT)的mRNA表達(dá)水平在葡萄糖誘導(dǎo)后均顯著下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而小檗堿作用后SOD、GSR及CAT的mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)，并且隨著小檗堿終濃度的提高上調(diào)的幅度愈加明顯(圖4)。

圖4 細(xì)胞內(nèi)抗氧化因子mRNA表達(dá)水平A.SOD;B.GSR;C.CAT；與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

5.小檗堿對(duì)HEPG2細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平的影響：模型組HEPG2細(xì)胞中白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及纖溶酶原激活劑抑制劑-1(PAI-1)的水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.01)。而小檗堿對(duì)這種高濃度葡萄糖造成的炎性因子表達(dá)的異常有明顯的抑制作用。中劑量及高劑量的小檗堿能夠顯著降低模型組細(xì)胞中IL-6的表達(dá)水平；同時(shí)高中低劑量的小檗堿均能夠顯著降低TNF-α的表達(dá)水平；而對(duì)細(xì)胞內(nèi)PAI-1表達(dá)水平的顯著抑制作用則只在高劑量小檗堿作用時(shí)被觀察到(表2)。

表2 細(xì)胞內(nèi)炎性因子表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05,ΔP<0.01

6.小檗堿對(duì)HEPG2細(xì)胞AMPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié):與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞AMPK因子mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化而ACC因子mRNA的表達(dá)水平則顯著降低。與模型組比較，不同終濃度的小檗堿均能夠顯著提高AMPK及ACC mRNA的表達(dá)水平(圖5A)。蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果表明，模型組細(xì)胞中AMPK、P-AMPK、ACC及P-ACC的表達(dá)水平與空白組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5B)。與模型組比較，高中低濃度的小檗堿均能夠顯著提高AMPK及ACC的蛋白表達(dá)水平及這兩個(gè)關(guān)鍵因子的蛋白磷酸化水平，說(shuō)明小檗堿對(duì)體外培養(yǎng)的HEPG2細(xì)胞內(nèi)的AMPK信號(hào)通路有明確的激活作用(圖5C)。

圖5 AMPK信號(hào)通路因子mRNA及蛋白表達(dá)A.AMPK信號(hào)通路關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)水平檢測(cè)；B.關(guān)鍵因子蛋白表達(dá)水平檢測(cè)；C.蛋白表達(dá)水平灰度分析。與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

討 論

在2型糖尿病的并發(fā)癥中，盡管非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)流行比例達(dá)34%～74%，但由于其癥狀隱蔽，長(zhǎng)期以來(lái)一直為人們所忽視[7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿不僅能改善2型糖尿病患者胰島素抵抗、降低血糖并且對(duì)脂質(zhì)代謝紊亂也具有調(diào)節(jié)作用[8]。而本研究結(jié)果表明，小檗堿能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂代謝相關(guān)因子SREBP-1、SCD及FAS的表達(dá)水平進(jìn)而顯著降低高濃度葡萄糖所引起的細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì)積累。肝細(xì)胞內(nèi)的脂肪沉積不僅有影響肝細(xì)胞的正常代謝功能還會(huì)引起細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的變化，由于脂類物質(zhì)積累所造成的肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平的異常升高可能造成肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿能夠顯著降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)抗氧化因子的表達(dá)水平保護(hù)細(xì)胞免于高濃度葡萄糖造成的氧化應(yīng)激損傷，說(shuō)明小檗堿具有一定的抗氧化功能。

由于高血糖引起的非酒精性肝損傷及肝臟細(xì)胞的脂類物質(zhì)沉積不僅對(duì)肝臟功能產(chǎn)生影響，還可能導(dǎo)致肝臟的纖維化等不可逆的病理性改變，在這一過(guò)程中肝臟自身分泌的炎性因子起到重要的作用[10]。小檗堿能夠降低非酒精性肝損傷模型大鼠炎性因子水平，保護(hù)模型動(dòng)物肝臟免于纖維化損傷[11,12]。同樣在本研究中，小檗堿也能夠顯著降低葡萄糖誘導(dǎo)后HEPG2細(xì)胞內(nèi)源性的炎性因子表達(dá)水平，提示小檗堿很可能通過(guò)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞炎性因子的表達(dá)來(lái)緩解非酒精性肝損傷造成的肝臟纖維化改變。

小檗堿對(duì)AMPK信號(hào)通路有顯著的激活作用，AMPK信號(hào)通路不僅與細(xì)胞的糖脂代謝關(guān)系密切，還參與細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎性因子表達(dá)的調(diào)節(jié)。AMPK通路的激活能夠通過(guò)抑制肝臟細(xì)胞SREBP-1C因子的表達(dá)水平抑制肝臟組織脂肪變性的發(fā)生，同時(shí)在心肌細(xì)胞中二甲雙胍通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路上調(diào)心肌細(xì)胞抗氧化因子的表達(dá)水平抵抗缺血-再灌注對(duì)心臟的損傷[13,14]。本研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿對(duì)體外培養(yǎng)的HEPG2細(xì)胞AMPK信號(hào)通路有顯著的激活作用，隨著小檗堿終濃度的提高，AMPK及ACC的核酸、蛋白及磷酸化蛋白的表達(dá)水平顯著上升。AMPK信號(hào)通路的激活，高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的HEPG2細(xì)胞的脂類物質(zhì)代謝能力、細(xì)胞內(nèi)活性氧簇水平及異常的炎性因子表達(dá)水平的異常現(xiàn)象都有所緩解，并且這種變化與小檗堿終濃度的變化及AMPK信號(hào)通路的活化程度密切相關(guān)。

綜上所述，本研究中體外培養(yǎng)HEPG2細(xì)胞經(jīng)過(guò)高濃度葡萄糖誘導(dǎo)，在脂類物質(zhì)代謝、細(xì)胞氧化應(yīng)激水平及炎性因子分泌水平等方面都出現(xiàn)了類似非酒精性肝損傷的病理表現(xiàn)。小檗堿通過(guò)劑量依賴的方式，激活A(yù)MPK信號(hào)通路緩解了由于體外培養(yǎng)的HEPG2細(xì)胞高濃度葡萄糖誘導(dǎo)造成的功能異常。基于AMPK信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平及脂代謝功能的調(diào)節(jié)作用，推測(cè)AMPK信號(hào)通路很可能是小檗堿緩解非酒精性肝損傷臨床表征的藥理作用機(jī)制，而對(duì)小檗堿治療非酒精性肝損傷藥理機(jī)制的深入研究，對(duì)拓展中醫(yī)藥治療肝臟疾病方面的應(yīng)用具有積極的意義。