李 剛 劉江豪 羅璟璐 張新峰

胃癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生率隨著年齡的增加也隨之上升，目前治療胃癌的方法主要包括局部腫瘤切除、化療及胃切除術(shù)等[1,2]。臨床上，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是胃癌治療失敗的重要原因之一，其是一個(gè)多因素參與的過程，尋找胃癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子將其作為靶點(diǎn)，給予相應(yīng)的治療藥物和方案，有利于提高患者的治療率和生存率[3,4]。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是一種能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要酶類，其能夠降解破壞組織屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[5,6]。MMP14作為MMP家族的重要成員，其能夠通過促進(jìn)癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[7]。有研究表明胃癌組織中通常具有高表達(dá)的MMP14，但是MMP14對胃癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制依然是不太清晰[8]。本研究假設(shè)MMP14在體內(nèi)外均能夠影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展，并進(jìn)一步探索了相關(guān)的機(jī)制，為探討MMP14在早期胃癌的診斷和治療過程中提供新的線索。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料：RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司)；青霉素、鏈霉素(加拿大威士特公司)；四氮唑藍(lán)(MTT)(美國Sigma公司)；Transwell小室(美國康寧公司)；VEGF、E-cadherin、Vimentin、c-Myc、cyclinD1、AXIN2、β-catenin、β-actin抗體(英國Abcam公司)；蛋白裂解液(中國碧云天公司)。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：胃黏膜上皮細(xì)胞GSE-1細(xì)胞株、SGC-7901、BGC-823和MKN45胃癌細(xì)胞株均購自ATCC(美國菌種保載中心)，培養(yǎng)于含有10% FBS和100U/ml青霉素、100g/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，貼壁生長，長至80%～90%，用0.25%胰酶消化，傳代或點(diǎn)板進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.RT-PCR檢測：將細(xì)胞(1×105個(gè)/毫升)接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染后，加入0.5ml TRIzol(中國諾唯贊公司)提取總RNA，根據(jù)試劑盒的說明，使用NanoDrop 2000 Spectrophotometer(美國賽默飛公司)檢測總RNA的純度和濃度，使用PrimeScriptTMRT試劑盒和gDNA Eraser(日本寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)將RNA(1μg)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR使用FastStart Universal Probe Master(ROX)(中國諾唯贊公司)定量且根據(jù)制造商的要求使用CFX ConnectTMReal-Time系統(tǒng)(美國BioRad Laboratories公司)分析。采用兩步法擴(kuò)增檢測MMP14及GAPDH的基因水平，RT-PCR引物序列詳見表1。

4.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與細(xì)胞轉(zhuǎn)染：根據(jù)MMP14基因序列及Blast同源搜索，設(shè)計(jì)引物序列，具體序列詳見表1。使用AgeⅠ(ACCGGT)和EcoRⅠ(GAATTC)限制性酶切位點(diǎn)將50ng MMP14-shRNA導(dǎo)入pLKO.1-puro載體(美國Sigma公司)，使用互補(bǔ)配對引物序列作為陰性對照(NC-shRNA)。使用Lipofectamine 2000(美國賽默飛公司)通過腺病毒將重組質(zhì)粒(MMP14-shRNA和NC-shRNA)轉(zhuǎn)入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

表1 引物序列表

5.細(xì)胞活力檢測：采用MTT試驗(yàn)，取對數(shù)期生長的SGC-7901細(xì)胞，用0.25%胰酶消化制成單細(xì)胞懸浮液，稀釋細(xì)胞數(shù)至1×104個(gè)/毫升，接種于96孔板，100微升/孔，分為NC-shRNA組、MMP14-shRNA組，每組5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，共計(jì)10個(gè)組，待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，按上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，加入MTT液，使用酶標(biāo)儀檢測吸光度。

6.細(xì)胞凋亡檢測：采用流式細(xì)胞分析檢測，取對數(shù)期生長的SGC-7901細(xì)胞，用0.25%胰酶消化制成單細(xì)胞懸浮液，稀釋細(xì)胞數(shù)至1×104個(gè)/微升，接種于96孔板，100微升/孔，待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，按上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按時(shí)間點(diǎn)收集懸浮細(xì)胞，加Amiexin-Ⅴ-FITC/PI標(biāo)記后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

7.細(xì)胞黏附檢測：收集不同組處理的單細(xì)胞懸浮液，稀釋細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/毫升，接種至matrigel預(yù)處理的96孔板，100微升/孔，培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后，吸掉未黏附的細(xì)胞，PBS洗滌2～3次，按剩余的貼壁細(xì)胞為黏附細(xì)胞計(jì)數(shù)，求平均值，計(jì)算細(xì)胞黏附率，細(xì)胞黏附率(%)=黏附細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

8.細(xì)胞侵襲檢測：8μm的聚碳酸多孔濾膜將Transwell小室分為上下兩室，在上室鋪滿Matrigel，于37℃風(fēng)干，將收集到的不同組處理的單細(xì)胞懸浮液稀釋至1×106個(gè)/毫升，下室中加入完全細(xì)胞培養(yǎng)基600μl，上室中加入100μl細(xì)胞懸浮液，常規(guī)培養(yǎng)，用結(jié)晶紫染色下室的細(xì)胞，顯微觀察，以平均數(shù)計(jì)算細(xì)胞的侵襲能力。

9.細(xì)胞遷移檢測：方法同細(xì)胞侵襲試驗(yàn)，差異在于遷移試驗(yàn)的Transwell的多孔濾膜未鋪Matrigel，其余步驟和上述侵襲試驗(yàn)相同，顯微觀察，計(jì)算細(xì)胞的遷移能力。

10.蛋白印跡(Western blot)法：使用蛋白印跡檢測VEGF、E-cadherin、Vimentin、c-Myc、cyclinD1、AXIN2、β-catenin的蛋白表達(dá)。根據(jù)制造商說明操作提取細(xì)胞和組織蛋白，采用BCA法(中國碧云天公司)對蛋白進(jìn)行定量，接著加入上樣緩沖液，在100℃煮沸15min，然后利用10%的SDS-PAGE電泳，電泳程序：80V 30min；120V 60min。隨后采用100V 90min將聚丙烯酰胺中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏佛乙烯(PVDF)膜(美國Millipore公司)，用5%的BSA封閉60min，TBST洗滌5分鐘/次，5次，用適當(dāng)濃度的一抗(VEGF、E-cadherin、Vimentin、c-Myc、cyclinD1、AXIN2、β-catenin，按1∶1000稀釋)4℃孵育過夜，接著TBST洗滌5分鐘/次，5次，二抗(HRP標(biāo)記山羊抗兔IG，按1∶10000稀釋)孵育，TBST洗滌5分鐘/次，5次，加化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯影檢測。

11.荷瘤裸鼠模型：所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均通過醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)的批準(zhǔn)，裸鼠右側(cè)背部皮下注射NC-shRNA或MMP14-shRNA轉(zhuǎn)染的SGC-7901細(xì)胞，每只裸鼠皮下注射5 × 105個(gè)細(xì)胞。待背部皮下出現(xiàn)顆粒大小的硬結(jié)節(jié)，即認(rèn)為造模成功。從第7天開始，每3天測量一次腫瘤體積(TV)。用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最大直徑(A)和最小直徑(B)，按公式TV=0.5×A×B2計(jì)算。于末次給藥后24h，脫頸椎處死，分離腫瘤并稱重。

結(jié) 果

1.胃癌細(xì)胞中MMP14的表達(dá)及其敲低對胃癌細(xì)胞活力和凋亡的影響：采用RT-PCR檢測胃癌細(xì)胞和正常細(xì)胞MMP14基因表達(dá)，與GSE-1細(xì)胞比較，胃癌細(xì)胞SGC-7901、BGC-823、MKN45細(xì)胞的MMP14表達(dá)顯著升高(圖1A)，以SGC-7901細(xì)胞尤為顯著，因此接下來使用SGC-7901細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試驗(yàn)下調(diào)MMP14的基因表達(dá)，與NC-shRNA比較，MMP14-shRNA轉(zhuǎn)染能夠顯著下調(diào)MMP14的基因表達(dá)(圖1B)。與NC-shRNA比較，MMP14-shRNA轉(zhuǎn)染顯著降低細(xì)胞的活力(圖1C)，同時(shí)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡(圖1D)。

2.MMP14敲低對胃癌細(xì)胞黏附、侵襲、遷移的影響：用NC-shRNA和MMP14-shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞不同的時(shí)間，與NC-shRNA比較，MMP14-shRNA轉(zhuǎn)染顯著降低SGC-7901細(xì)胞的黏附率(圖2A)，抑制細(xì)胞的侵襲和遷移能力(圖2B、C)。

3.MMP14敲低對VEGF、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的影響：用NC-shRNA和MMP14-shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，蛋白印跡檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，與NC-shRNA比較，MMP14-shRNA轉(zhuǎn)染顯著上調(diào)E-cadherin的蛋白表達(dá)，下調(diào)Vimentin和VEGF的蛋白表達(dá),詳見圖3。

圖1 胃癌細(xì)胞中MMP14的表達(dá)及其敲低對胃癌細(xì)胞活力和凋亡的影響A.MMP14的表達(dá)；B.MMP14敲低；C.細(xì)胞活力；D.細(xì)胞凋亡

圖2 MMP14敲低對胃癌細(xì)胞黏附、侵襲和遷移的影響A.黏附能力；B.侵襲能力；C.遷移能力；與NC-shRNA比較，*P<0.05，**P<0.01

圖3 MMP14敲低對VEGF、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的影響與NC-shRNA比較，*P<0.01

4.MMP14敲低對Wnt/β-catenin信號蛋白的影響：用NC-shRNA和MMP14-shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，蛋白印跡檢測Wnt/β-catenin信號相關(guān)蛋白的表達(dá)，與NC-shRNA比較，MMP14-shRNA轉(zhuǎn)染能夠顯著下調(diào)c-Myc、cyclinD1、AXIN2、β-catenin的蛋白表達(dá)(P<0.01),詳見圖4。

圖4 MMP14敲低對Wnt/β-catenin信號蛋白的影響與NC-shRNA比較，*P<0.01

5.體內(nèi)MMP14敲低對胃癌發(fā)生、發(fā)展的影響：將NC-shRNA和MMP14-shRNA轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞接種于裸鼠體內(nèi)建立荷瘤裸鼠模型，結(jié)果表明MMP14-shRNA組腫瘤的體積和重量均顯著下調(diào)，同時(shí)c-Myc、cyclinD1、AXIN2、β-catenin和VEGF的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，詳見圖5。

圖5 MMP14敲低對體內(nèi)腫瘤發(fā)生、發(fā)展作用的影響A.腫瘤體積；B.腫瘤重量；C、D.信號蛋白表達(dá)；與NC-shRNA比較，*P<0.05

討 論

胃癌起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是最常見的惡性腫瘤之一。在胃癌患者中影響生存和預(yù)后的重要因素是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一種能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要酶類，其幾乎能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分，通過破壞基質(zhì)的降解平衡促進(jìn)腫瘤細(xì)胞突破基膜和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的屏障，從而使腫瘤細(xì)胞易于發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。

基質(zhì)金屬蛋白酶-14(MMP14)，又稱MT1-MMP，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族，主要與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)[7,8]。研究表明MMP14表達(dá)于多種腫瘤組織，包括結(jié)腸癌和乳腺癌等，同時(shí)MMP14也高表達(dá)于胃癌組織[9～11]。但是MMP14在胃癌中的研究較少，因此本研究首先采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明MMP14高表達(dá)于胃癌細(xì)胞。接下來采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染下調(diào)MMP14的基因表達(dá)探索其對于胃癌發(fā)生、發(fā)展的體內(nèi)外作用及相關(guān)分子機(jī)制。

MMP14在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程中具有重要的影響，研究表明MMP14能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和血管生成，除此之外，MMP14過表達(dá)能夠增加食管鱗狀細(xì)胞癌的遷移能力[12]。本研究體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明MMP14敲低能夠直接抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。除此之外，細(xì)胞黏附、侵襲和遷移能力也是腫瘤細(xì)胞的重要生物學(xué)特征，本研究表明MMP14敲低能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的黏附、侵襲和遷移能力，上述表明MMP14對胃癌細(xì)胞的生物學(xué)活性具有重要的調(diào)節(jié)作用，因此接下來探索了MMP14調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞生物學(xué)特征的相關(guān)分子機(jī)制。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與不同類型的癌癥相關(guān)，包括胃癌、食管癌和肝癌等，EMT在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用[13，14]。EMT相關(guān)的蛋白分子主要包括VEGF、E-cadherin、Vimentin等相關(guān)分子， MMP14能夠通過調(diào)節(jié)EMT相關(guān)的蛋白分子參與黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌的EMT過程[9,15，16]。本研究表明MMP14敲低能夠影響EMT相關(guān)蛋白分子包括E-cadherin、Vimentin和VEGF的蛋白表達(dá)。上述表明MMP14可能通過調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展的EMT過程影響胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)活性。

Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤發(fā)展的EMT過程密切相關(guān)，并且Wnt/β-catenin在胃癌的病理發(fā)展過程中具有重要的影響[17，18]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵蛋白，c-Myc、cyclinD1和AXIN2是Wnt/β-catenin信號通路的下游靶點(diǎn)[19，20]。因此，接下來本研究主要集中于Wnt/β-catenin信號通路探討MMP14影響胃癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制。本研究表明MMP14敲低能夠下調(diào)β-catenin蛋白的活化，并且抑制下游蛋白的表達(dá)。接下來，進(jìn)一步評價(jià)了MMP14在體內(nèi)對于胃癌發(fā)生、發(fā)展的影響。將轉(zhuǎn)染后的SGC-7901胃癌細(xì)胞接種于裸鼠建立了體內(nèi)荷瘤裸鼠模型，結(jié)果表明MMP14敲低在體內(nèi)也能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長，下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路的活化及影響EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)。上述體內(nèi)外結(jié)果表明，MMP14敲低可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路影響胃癌細(xì)胞的EMT過程，進(jìn)而影響胃癌的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，本研究表明MMP14可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路活化影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展，其是一種潛在的胃癌治療靶點(diǎn)，為胃癌藥物的開發(fā)提供一定的線索。然而，需要更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提供更多的證據(jù)，以進(jìn)一步探索MMP14在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的相關(guān)分子機(jī)制。