葉天民 彭鼎佳 高 晶 王 琨 霍 然 肖 佳 楊樹標

隨著現(xiàn)代社會的進步，不孕癥是整個社會面臨的一個問題。1978年英國誕生了首例試管嬰兒，標志著人類擁有了輔助生育技術(shù)以及后續(xù)不斷完善的各種相關(guān)技術(shù)，在很大程度上幫助了不少不孕癥患者，但醫(yī)學(xué)工作者也發(fā)現(xiàn)，移植的優(yōu)質(zhì)胚胎移植入母體子宮后仍然沒有得到成功妊娠。其中的主要問題還是在于胚胎著床尚無法在掌控之中。所以目前輔助生育技術(shù)的治療成功率仍然徘徊在30%左右[1]。胚胎著床是發(fā)生在母體內(nèi)非常重要的生理過程，在哺乳動物的不同物種中，基本的過程及步驟都很相似。大體分為3步，即定位、黏著和侵入。定位是指胚胎在子宮內(nèi)膜表面不穩(wěn)定的黏著。此后，黏著步驟是指囊胚滋養(yǎng)細胞開始具有黏著能力并黏于子宮內(nèi)膜表面。隨后，滋養(yǎng)細胞穿破子宮內(nèi)膜的腔上皮細胞層，進入內(nèi)膜的間質(zhì)，即侵入過程[2]。這個過程需要胚胎和子宮之間非常精密而和諧的對話才能完成[3]。胚胎著床由諸多分子及其所在通路介導(dǎo)，其中包括了性激素、生長因子、細胞因子、黏著分子和脂質(zhì)等[4]。但其中具體的機制如何，仍是一個不解之謎。

annexin A2 是annexin成員之一。 annexin是一組通過鈣離子依賴方式連接于磷脂陰離子上的蛋白質(zhì)。目前在高等脊椎動物中發(fā)現(xiàn)至少有12種[5]。膜結(jié)合annexin A2是一個四聚體結(jié)構(gòu)，包括兩個annexin A2分子和兩個P11 (S100 鈣結(jié)合蛋白A10) 分子。annexin A2是Src (Rous肉瘤基因) 激酶的底物，功能涉及細胞轉(zhuǎn)化、分化、分泌功能調(diào)節(jié)、泌乳素釋放和前列腺素形成[5～7]。研究發(fā)現(xiàn)，在人類子宮內(nèi)膜中，annexin A2在內(nèi)膜接受胚胎著床期高表達而在接受胚胎著床的前期為低表達[8～10]；這些結(jié)果說明了annexin A2在胚胎著床中有相關(guān)的功能作用。研究發(fā)現(xiàn)，鈣離子在胚胎著床中起著非常重要的作用。因為在孕第4天小鼠的宮腔內(nèi)注入鈣通道阻滯劑會導(dǎo)致胚胎著床的失敗[11,12]。另外，鈣離子調(diào)節(jié)蛋白可以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣的平衡，并且它在內(nèi)膜接受胚胎著床期為高表達，而在接受胚胎著床的前期為低表達[13]。因為annexin A2就是鈣通道依賴而發(fā)生功能的，說明它和胚胎著床的關(guān)系和機制是這樣產(chǎn)生的。近年來，annexin A2在生殖領(lǐng)域的研究不斷深入。目前發(fā)現(xiàn)，annexin A2在胚胎著床中的作用是通過RhoA的激活和蛋白的調(diào)節(jié)而產(chǎn)生的[14]。一些體外實驗發(fā)現(xiàn)，在靈長類子宮內(nèi)膜上皮細胞及Ishikawa細胞系中，白介素11可以上調(diào)annexin A2的表達[15]。白介素11也是胚胎著床過程中非常重要的一個因子。

筆者之前的一些小鼠子宮內(nèi)膜表面蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)了annexin A2在內(nèi)膜接受胚胎著床期和接受胚胎著床的前期的表達有明顯差異[16]。本研究通過筆者已有的小鼠體外胚胎著床模型對annexin A2在胚胎著床中的重要功能進行研究[17]。

材料與方法

1.動物模型：小鼠三維體外胚胎著床模型運用ICR小鼠囊胚與子宮內(nèi)膜組織進行研究：本研究所有健康雌性及雄性ICR小鼠由香港大學(xué)實驗動物中心提供。所有實驗均得到香港大學(xué)實驗動物倫理學(xué)委員會批準。按照筆者已經(jīng)建立的小鼠體外著床模型進行實驗研究，將孕第4天ICR小鼠囊胚與子宮內(nèi)膜組織進行體外共培養(yǎng)。觀察各組胚胎黏著率的差異[17]。本實驗共設(shè)4組：第1組將ICR小鼠的內(nèi)膜組織用1.0μg/ml的annexin A2抗體進行預(yù)培養(yǎng)1h(預(yù)處理)；第2組將ICR小鼠的內(nèi)膜組織用0.1μg/ml的annexin A2抗體進行預(yù)培養(yǎng)1h；第3組將ICR小鼠的內(nèi)膜組織用1.0μg/ml的對照IgG抗體進行預(yù)培養(yǎng)1h；第4組的小鼠子宮內(nèi)膜組織未經(jīng)任何抗體預(yù)處理。

2.免疫組化：小鼠子宮內(nèi)膜組織經(jīng)過固定、石蠟包埋之后，常規(guī)石蠟切片制片。切片組織厚度為5μm。切片經(jīng)脫蠟后進行常規(guī)處理。組織切片用傳統(tǒng)免疫組化的抗原修復(fù)、過氧化氫處理，加一抗(1∶500)、二抗(1∶800)后用ABC+DAB法進行顯色。其中一抗為兔抗鼠annexin A2(購自英國Abcam公司)，二抗為羊抗兔IgG(購自美國Dako公司)。

3.統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組之間胚胎黏著率的比較，用χ2檢驗進行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.通過三維體外胚胎著床模型來檢測annexin A2在胚胎著床中的作用：ICR小鼠內(nèi)膜組織用annexin A2抗體及正常IgG抗體對照進行預(yù)培養(yǎng)，然后運用體外3D著床模型進行黏著率檢測。小鼠子宮內(nèi)膜經(jīng)濃度為1.0μg/ml及0.1μg/ml的annexin A2抗體預(yù)處理后小鼠囊胚在其上的黏著率分別為45.6%及53.6%；而抗體濃度為1.0μg/ml的正常IgG對照及未經(jīng)抗體處理的空白對照組的黏著率分別為55.4%及59.0%。經(jīng)過1.0%的annexin A2抗體預(yù)處理組與兩組對照組之間的黏著率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.30，P=0.15)。

表1 經(jīng)過與未經(jīng)過LIF抗體抑制的內(nèi)膜與胚胎在體外共培養(yǎng)模型中的黏著率

2.小鼠子宮內(nèi)膜組織annexin A2的免疫組化染色：孕第1、4天ICR小鼠子宮內(nèi)膜組織及孕4天小鼠內(nèi)膜組織在與小鼠囊胚共培養(yǎng)之前用1.0μg/ml和0.1μg/ml annexin A2抗體預(yù)處理后行免疫組化染色。孕第4天小鼠子宮內(nèi)膜組織的annexin A2表達明顯高于孕第1天小鼠子宮內(nèi)膜組織；但是，經(jīng)過annexin A2抗體預(yù)處理后，未見到annexin A2表達明顯降低(圖1)。

討 論

圖1 GFP小鼠與ICR小鼠子宮內(nèi)膜組織共培養(yǎng)28h后組織學(xué)圖像(免疫組化染色，×400)A.孕第1天小鼠子宮內(nèi)膜組織； B.孕第4天小鼠子宮內(nèi)膜組織；C.經(jīng)過0.1μg/ml annexin A2抗體預(yù)處理后的孕第4天小鼠子宮內(nèi)膜組織；D.經(jīng)過1.0μg/ml annexin A2抗體預(yù)處理后的孕第4天小鼠子宮內(nèi)膜組織；LE.腔上皮；GE.腺上皮；SC.間質(zhì)細胞

胚胎著床過程非常精密，難以全面解開，直到目前，已經(jīng)有很多技術(shù)運用到了研究胚胎著床的研究中。比如在母體方面，對活檢內(nèi)膜組織和宮腔沖洗液的基因組以及蛋白組學(xué)的研究[18～21]。在胚胎方面，研究著床前胚胎代謝產(chǎn)物時發(fā)現(xiàn)了一些可能與胚胎高著床能力相關(guān)的分子。但是，這些研究的缺陷在于，用一些靜態(tài)的方法去觀察一個動態(tài)的體內(nèi)過程，或者說僅在某個單方面去探究母體子宮內(nèi)膜或者胚胎。然而，如果建立一個人體體內(nèi)的著床模型比較困難，首先存在技術(shù)和倫理學(xué)的問題。所以開發(fā)研究胚胎著床的體外模型是一個非常適合的手段及平臺。目前，大體有3種三維體外著床模型建立并已在著床研究中運用。這3類模型中，有一類模型是胚胎和子宮內(nèi)膜組織共培養(yǎng)的三維體外著床模型，報道相對比較少，這一類模型的優(yōu)勢在于運用原代內(nèi)膜組織的培養(yǎng)，相比其他模型，它更加接近體內(nèi)的環(huán)境和狀況。此類模型的首例報道是在1961年,之后1973～1993年也有少數(shù)類似的模型相繼報道，但總的來說，此類模型報道很少。筆者于香港大學(xué)婦產(chǎn)科系建立了一種新型的三維模型。筆者研究發(fā)現(xiàn)，在處理過的人類羊膜上培養(yǎng)內(nèi)膜組織可以維持正常形態(tài)的子宮內(nèi)膜達到72h。于是，筆者再將囊胚置于其上進行共培養(yǎng)，這是之前其他模型均沒有做到的。在此模型中，小鼠囊胚體外的黏附率可以達到50%以上；并且，筆者觀察到了在靠近胚胎黏附位置附近的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)了蛻膜化的改變[17]。之前同類模型尚無這樣的報道。

新型的著床模型建立以后，隨后的相關(guān)功能性實驗也同時開展。很多與胚胎著床相關(guān)的分子均用本模型得到了功能上的證實，如白血病抑制因子(LIF)[17,22]。在筆者實驗室另一項研究中，將小鼠孕第1天和第4天的子宮內(nèi)膜表面蛋白質(zhì)進行標記并純化，進行對比蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，在一系列差異表達蛋白質(zhì)中，筆者發(fā)現(xiàn)annexin A2在孕第4天的表達和孕第1天明顯不同，差異在2倍以上[16]。這提示annexin A2可能和胚胎著床有著密切的關(guān)系。之前也有研究者發(fā)現(xiàn)在人類子宮內(nèi)膜中，annexin A2在內(nèi)膜接受胚胎著床期高表達而在接受胚胎著床的前期為低表達[8～10]。這些結(jié)果說明了annexin A2在胚胎著床中有相關(guān)的功能作用。所以筆者將小鼠孕第1天和第4天的子宮內(nèi)膜組織進行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)在第4天的表達明顯高于第1天，這和之前的研究結(jié)果是相符合的。為了進行功能性研究及證實，筆者將子宮內(nèi)膜組織用annexin A2抗體進行預(yù)處理，實驗步驟和筆者對LIF進行功能性研究是一樣的[17,22]。但是，胚胎黏著率并沒有因為annexin A2抗體預(yù)處理而顯著性降低。雖然從數(shù)值上看，運用1.0μg/ml annexin A2抗體預(yù)處理組的黏著率低于2個對照組，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。這有可能和樣本數(shù)量還不夠大有關(guān)；隨后，筆者又將annexin A2抗體預(yù)處理過的小鼠子宮內(nèi)膜組織進行免疫組化染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)annexin A2的表達并沒有明顯減少(圖1)。從免疫組化染色的圖片中還可以發(fā)現(xiàn)，annexin A2的表達主要集中于細胞膜表面，并且在上皮及間質(zhì)細胞均有表達。annexin A2又是一種鈣離子通道依賴的蛋白質(zhì)[5]。所以研究發(fā)現(xiàn)它是一種分泌性蛋白質(zhì)。所以用抗體阻滯的方式未必能夠抑制它的功能，原因有可能是：①抗體的濃度及量還不夠大；②內(nèi)膜組織不斷分泌annexin A2來維持它的功能；③體外實驗是敞開式環(huán)境，無法使抗體的阻滯作用集中發(fā)揮。

綜上所述，annexin A2在第4天的子宮內(nèi)膜組織表達明顯高于第1天的子宮內(nèi)膜組織。運用抗體進行阻滯實驗時并不能顯著降低體外胚胎在子宮內(nèi)膜組織的黏著率。隨后進行相關(guān)小鼠體內(nèi)研究或者將annexin A2整體表達量進行降調(diào)可能會獲得陽性的結(jié)果。