張永杏，唐峰華，郭全友,，李保國(guó)

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

鮐魚（Scomber japonicus），屬鯖科，又名青花魚和鯖魚等，屬多脂魚類，富含蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。鮐魚分布于北太平洋西部，我國(guó)近海主要分布在海洋島、連青石、大沙及沙外等漁場(chǎng)，漁獲期一般為4～7月和9～12月，具有分布廣和捕撈量大等特點(diǎn)[1]，2017年鮐魚捕撈量達(dá)到44萬 t[2]，是我國(guó)重要的遠(yuǎn)洋海捕中上層經(jīng)濟(jì)魚類之一。

目前鮐魚在遠(yuǎn)洋捕獲后，主要以冷凍產(chǎn)品形式運(yùn)輸至國(guó)內(nèi)市場(chǎng)，以冷凍或冰鮮形式銷售，整個(gè)流通過程對(duì)冷鏈運(yùn)輸要求很高。在內(nèi)源酶和微生物的共同作用下，鮐魚自身易氧化變質(zhì)，產(chǎn)生組胺等有害物質(zhì)，改變魚體組織，降低營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味和色澤等品質(zhì)[2-3]。目前，針對(duì)鮐魚的研究主要集中于凍鮮品貯藏、品質(zhì)控制[4-10]和安全性（組胺）控制方面[11-12]。陳晶晶等[10]研究了中性電解水對(duì)鮐魚的保鮮效果，結(jié)果顯示中性電解水保鮮效果優(yōu)于普通貯藏方式，且中性電解水碎冰貯藏效果最顯著（P＜0.05）；Cropotova等[6]通過熒光成像研究了冷藏期間真空烹制大西洋鯖魚的質(zhì)地變化，結(jié)果顯示真空處理的溫度和冷藏時(shí)間對(duì)鯖魚肉的膠原完整性和硬度均有顯著性影響，會(huì)使其膠原組織逐漸降解軟化；Zare等[12]研究了印度鯖魚在不同貯藏溫度下，組胺、腐胺和尸胺的變化，并得出在0、3、10、23 ℃下，這3 種生物胺含量都顯著增加。鮐魚整條冷凍和冰鮮品存在品質(zhì)易下降、安全性低等問題，限制了鮐魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，現(xiàn)有熟制鮐魚制品主要為腌漬品，罐頭和魚丸等[13-16]，開發(fā)輕微加工熟制鮐魚，有助于推動(dòng)其產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

熟制水產(chǎn)品多采用高溫高壓等強(qiáng)殺菌手段達(dá)到常溫貯藏的目的[17]。當(dāng)前輕微熱處理（如即食對(duì)蝦）、冷熏（三文魚等）和低鹽等輕微加工已成為研發(fā)熱點(diǎn)[18-19]。輕微加工水產(chǎn)品通常指低鹽（鹽分質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜6%）、高pH值（＞5.0）、添加少量防腐劑（如乳酸鈉）、真空包裝和低溫流通的一類水產(chǎn)制品[17,20]。此類產(chǎn)品由于殺菌強(qiáng)度和抑菌條件較溫和，貯藏過程中易腐敗變質(zhì)，郭全友等[18]研究了微波殺菌即食南美白對(duì)蝦常溫貯藏的貨架期及殘留菌種類，并分析了貯藏過程中品質(zhì)變化。王云[21]以鯖魚為對(duì)象，研究了微波加工即食鯖魚的加工工藝，比較了殺菌方式和熟化方式對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)的影響。在前期對(duì)熟制鮐魚制品微波殺菌工藝研究基礎(chǔ)上，擬對(duì)輕微加工熟制鮐魚的品質(zhì)特性、貯藏性能、安全性和部分產(chǎn)品脹袋原因進(jìn)行深入探究。

本實(shí)驗(yàn)以輕微加工熟制鮐魚為對(duì)象，對(duì)原料、符合商業(yè)無菌的脹袋樣品進(jìn)行分析，采用感官、微生物、理化等評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較原料鮐魚與熟制鮐魚的品質(zhì)差異，研究符合商業(yè)無菌樣品貯藏前后的品質(zhì)特征，并分析脹袋樣品的殘存菌群，為優(yōu)化加工工藝和靶向抑制殘留菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍鮐魚由浙江某水產(chǎn)公司提供，100～200 g/尾，6 h運(yùn)至上海實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃超低溫冰箱，備用。

氯化鈉、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、30 g/L氫氧化鈉、0.6 mol/L高氯酸、甲基紅、亞甲基藍(lán)、酚酞、10%鉻酸鉀、0.1 mol/L硝酸銀、0.01 mol/L鹽酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DZ400S真空包裝機(jī) 上海帆銘機(jī)械有限公司；YQ2G-03微波殺菌機(jī) 永青集團(tuán)有限公司；ZM-100反壓高溫蒸煮鍋 廣州標(biāo)際包裝設(shè)備有限公司；KDN-103F定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；HI2216pH計(jì)哈納沃德儀器（北京）有限公司；PMB35水分含量測(cè)定儀英國(guó)艾德姆衡器公司；AWLAB-Touch PMB35水分活度儀大昌華嘉商業(yè)（中國(guó)）有限公司；ZHWY-200H恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；微生物半自動(dòng)鑒定儀 美國(guó)Biolog公司；DVB-PDMS 65 μm萃取頭 美國(guó)Supelco公司；1200高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 熟制鮐魚的制備

鮐魚→解凍→“三去”剖片→清洗→瀝水→稱質(zhì)量→鹽和糖等調(diào)料按比例混勻，溶解制成腌制液，浸泡腌制4 h→二次瀝水→調(diào)味→冰箱（-20 ℃）覆膜放置1 d→230 ℃烘烤30～35 min（根據(jù)魚體大小，適當(dāng)調(diào)整烘烤條件）→真空包裝→微波（95 ℃、340 W、12 min）/紅外線（75 ℃、1 min）聯(lián)合殺菌→4 ℃水浴速冷→成品

1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)原料鮐魚、符合商業(yè)無菌的脹袋樣品進(jìn)行分析：對(duì)原料鮐魚和熟制鮐魚進(jìn)行鮮度和品質(zhì)分析；參照GB 4789.26—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 商業(yè)無菌檢驗(yàn)》對(duì)熟制鮐魚進(jìn)行商業(yè)無菌檢驗(yàn)，取樣品20 袋，置于（36±1）℃保溫10 d，每日觀察，出現(xiàn)脹袋即開啟檢查；以初始樣品（A0：第0天）為基準(zhǔn)，同時(shí)與保溫終點(diǎn)未脹袋樣品（A1：第10天）進(jìn)行感官、菌落總數(shù)、pH值、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量和組胺含量差異性比較；并對(duì)菌落分離、純化和鑒定（Biolog法和16S rDNA測(cè)序法）。

1.3.3 鹽分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

鹽分質(zhì)量分?jǐn)?shù)參照SC/T 3011—2001《水產(chǎn)品中鹽分的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水分活度、pH值和TVB-N含量測(cè)定

水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)按照GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》測(cè)定；水分活度（water activity，aw）按照GB 5009.238—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品水分活度的測(cè)定》中的第二法水分活度儀擴(kuò)散法進(jìn)行測(cè)定；pH值按照GB 5009.237—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定；TVB-N含量按照GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 菌落總數(shù)的測(cè)定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》測(cè)定菌落總數(shù)。

1.3.6 感官評(píng)價(jià)

參照劉愛芳等[22]的方法，略作修改，由感官評(píng)定小組參照表1感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)未脹袋熟制鮐魚的外觀、彈性、氣味和滋味等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，單項(xiàng)指標(biāo)均采用5 分制，單個(gè)指標(biāo)權(quán)重相等，綜合評(píng)分5 分為品質(zhì)最好，3 分為感官可接受點(diǎn)，小于3 分為感官拒絕，1 分為最差；脹袋產(chǎn)品，直接剔除，均不合格。

表 1 熟制鮐魚感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of ready-to-eat cooked mackerel

1.3.7 細(xì)菌分離純化

參照GB/T 4789.2—2016，取所有脹袋樣品進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定。每個(gè)樣品稱取10 g脹袋熟制鮐魚置于無菌生理鹽水中，研磨并稀釋3 個(gè)梯度，制成樣品菌液，每個(gè)梯度吸取100 μL樣品菌液至無菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿中，涂布均勻，做2 個(gè)平行，然后放置于（36±1）℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，根據(jù)細(xì)菌表觀特征的不同，將培養(yǎng)平板中的細(xì)菌進(jìn)行分類和編號(hào)，將所分類細(xì)菌進(jìn)行劃線分離和純化，每種細(xì)菌需分離純化2 代及以上。

1.3.8 革蘭氏染色

參照張楚晗等[23]的三步染色法，進(jìn)行染色。

1.3.9 細(xì)菌鑒定

微生物鑒定：將純化好的細(xì)菌接種到BUG培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至細(xì)菌生長(zhǎng)到良好狀態(tài)。IF-A校準(zhǔn)菌懸液透光率是100%，將BUG培養(yǎng)基上的細(xì)菌接種到IF-A中，調(diào)節(jié)透光率至90%～98%為適宜接種量。將接種后的菌懸液倒入V型槽中，用移液槍加入到96 孔GEN-III鑒定板中，每孔加100 μL菌懸液，（33.0±0.5）℃培養(yǎng)48 h后，采用微生物半自動(dòng)鑒定儀，分別在590 nm和750 nm波長(zhǎng)處測(cè)定。

分子鑒定：菌種鑒定過程采用16S rDNA，對(duì)腐敗細(xì)菌進(jìn)行DNA的提取，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增DNA模板，引物為7F（5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’）和1540R（5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）。PCR體系：模板（基因組DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL；10×Buffer（含Mg2+）2.5 μL；dNTP（各2.5 mmol/L）1.0 μL；酶0.2 μL；F（10 μmol/L）0.5 μL，R（10 μmol/L）0.5 μL；加雙蒸水至25.0 μL。PCR條件：預(yù)變性（94 ℃、4 min）；變性（94 ℃、45 s）、退火（55 ℃、45 s）、延伸（72 ℃、1 min），30 個(gè)循環(huán)；延伸（72 ℃，10 min）；終止反應(yīng)（4 ℃，∞）。

1.3.10 組胺含量測(cè)定

參照GB 5009.208—2016中的第一法高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。樣品前處理：每個(gè)樣品采用全部打碎，混合均勻。色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；7 種標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于99.0%；進(jìn)樣量20 μL，柱溫35 ℃，流動(dòng)相A為10%（含體積分?jǐn)?shù)0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液），流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)10%乙腈，流速0.8 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；梯度洗脫程序：0 min、55% B；15～20 min、95% B；21～25 min、55% B。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并結(jié)合Origin 8.0軟件進(jìn)行作圖，同時(shí)采用SPSS 22.0軟件的方差分析法進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

細(xì)菌測(cè)序所得的16S rDNA序列校對(duì)后，與美國(guó)國(guó)家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析，根據(jù)序列同源性，選取不同的模式菌株，采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料鮐魚和熟制鮐魚品質(zhì)分析

鮐魚屬于多脂魚類，內(nèi)源酶活性強(qiáng)，易腐敗變質(zhì)，通過輕微加工手段調(diào)控柵欄因子（如鹽分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、aw和pH值）和魚體內(nèi)源酶的活性，可抑制微生物的增殖，提高產(chǎn)品品質(zhì)和延長(zhǎng)貨架期。

表 2 原料鮐魚與熟制鮐魚制品品質(zhì)特性Table 2 Quality characteristics of raw and cooked mackerel

由表2可知，原料鮐魚與熟制鮐魚的鹽分、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、aw和pH值等有顯著性差異（P＜0.05）。原料鮐魚經(jīng)過腌漬、烘烤和包裝等工序制成熟制品后，鹽分質(zhì)量分?jǐn)?shù)由（0.50±0.05）%上升為（4.13±0.45）%，屬于低鹽制品（鹽分質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜6%），有助于鮐魚制品的貯藏和色澤保持[3]；水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)由（72.47±0.74）%降低為（51.93±1.18）%，魚肉aw由0.973±0.010降至0.939±0.002[24]，但熟制鮐魚的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和aw仍然較高，屬于低鹽高濕制品，其抑菌作用會(huì)減弱[25]。鮐魚原料pH值為5.72±0.09，熟制鮐魚pH值為6.29±0.02，pH值顯著提升，改善了肉質(zhì)酸度低的品質(zhì)特性。

TVB-N含量表征魚的新鮮度和安全性。參照GB 181018—2008的規(guī)定，原料鮐魚的TVB-N含量（14.84±0.84）mg/100 g（≤15 mg/100 g），達(dá)到一級(jí)安全指標(biāo)，熟制鮐魚TVB-N含量為19.51 mg/100 g（≤30 mg/100 g）；熟制鮐魚的菌落總數(shù)小于100 CFU/g；綜上，原料鮐魚經(jīng)熟制后，各項(xiàng)品質(zhì)指標(biāo)得到一定提升，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和aw有所降低。

2.2 熟制鮐魚貯藏前后感官評(píng)分

表 3 熟制鮐魚貯藏前后感官評(píng)分Table 3 Sensory evaluation of A0 and A1

由表3可知，熟制鮐魚商業(yè)無菌貯藏前后，氣味、外觀、彈性和滋味的感官評(píng)分差異均不顯著（P＞0.05）。外觀評(píng)分值相同，氣味評(píng)分略下降，彈性和滋味評(píng)分升高，可能是在食鹽的作用下，肉制品的彈性增加[26]。A0和A1綜合評(píng)分分別為4.40±0.34和4.55±0.19，差異不顯著。說明商業(yè)無菌貯藏后，熟制鮐魚感官并未發(fā)生明顯變化，仍保持良好狀態(tài)。熟制鮐魚貯藏期間有個(gè)別脹袋樣品（B1（2 d）、B2（3 d）、B3（6 d）和B4（7 d），可能是由于原料、加工、包裝和殺菌等過程中殘存微生物作用下產(chǎn)酸產(chǎn)氣所導(dǎo)致。高鵬等[27]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌屬細(xì)菌是引起真空包裝食品變質(zhì)的主要原因。因此，需對(duì)導(dǎo)致熟制鮐魚脹袋的原因進(jìn)行定性定量分析。

2.3 熟制鮐魚殘存菌數(shù)及增殖判定結(jié)果

表 4 貯藏期間熟制鮐魚菌落總數(shù)變化Table 4 Changes in TVC of ready-to-eat cooked mackerel during examination of commercial sterilization

熟制鮐魚在商業(yè)無菌保溫實(shí)驗(yàn)中，其真空包裝袋未出現(xiàn)泄漏情況，16 袋產(chǎn)品符合商業(yè)無菌樣品，至保溫實(shí)驗(yàn)結(jié)束，總計(jì)有4 袋出現(xiàn)脹袋現(xiàn)象。表4為商業(yè)無菌保溫初始（A0）、保溫終點(diǎn)（A1）和保溫實(shí)驗(yàn)過程中所有脹袋樣品殘存菌數(shù)。A0和A1菌落總數(shù)均小于2（lg（CFU/g）），但第2、3、6和7天各出現(xiàn)1 袋膨脹樣品，其殘存菌數(shù)處在4.73～5.18（lg（CFU/g））之間，菌數(shù)增殖明顯，是樣品脹袋的主要原因。由于魚體大小差異，微波殺菌的不均衡[28]，所采用的紅外殺菌，處理溫度低、時(shí)長(zhǎng)短，可能導(dǎo)致包裝袋內(nèi)魚體殘存微生物生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣脹袋[29]；可將每批次鮐魚按大小分離，改善微波殺菌的均勻度，同時(shí)提高紅外線照射溫度，延長(zhǎng)處理時(shí)間，能有效控制熟制鮐魚的菌落總數(shù)，延長(zhǎng)貨架期。

2.4 脹袋鮐魚殘留菌分離與鑒定

熟制鮐魚脹袋與殘存微生物的生長(zhǎng)密切相關(guān)，其生長(zhǎng)代謝活動(dòng)促使產(chǎn)酸產(chǎn)氣，從而引發(fā)脹袋。根據(jù)菌落形態(tài)的不同，從B1～B4中分離出A、B、C、D、E和F 6 株菌均為革蘭氏陽性菌。A：菌落形狀不規(guī)則，表面凸起，邊緣鋸齒狀，質(zhì)地黏稠，中心處略白；B：菌落不規(guī)則，表面干燥，形狀扁平，邊緣細(xì)小鋸齒狀，白色，無光澤，不透明；C：菌落形態(tài)不規(guī)則，表面濕潤(rùn)光滑，邊緣波狀，質(zhì)地黏稠膜狀，無色透明；D、E和F菌落形態(tài)相似，菌落較小，呈圓形，表面光滑，邊緣整齊，淡黃色，不透明。

經(jīng)Biolog鑒定，確定優(yōu)勢(shì)菌A、B、C分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和索諾拉沙漠芽孢桿菌（Bacillus sonorensis），其相似指數(shù)均大于0.550，其余3 株菌（D、E、F）相似指數(shù)均小于0.200。徐世明等[30]研究證明，脹袋烤雞中的主要腐敗菌是生孢梭狀桿菌、枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌。?zdemir等[31]指出芽孢桿菌屬（蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和短小芽孢桿菌等）與食品腐敗密切相關(guān)。

表 5 熟制鮐魚腐敗細(xì)菌16S rDNA基因序列相似性分析Table 5 Sequence similarity analysis of 16S rDNA gene of spoilage bacteria in cooked mackerel

采用16S rDNA測(cè)序法對(duì)6 株菌進(jìn)一步進(jìn)行分子鑒定，將細(xì)菌測(cè)序所得的16S rDNA序列校對(duì)后，與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析（表5），并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），根據(jù)同源性遠(yuǎn)近進(jìn)一步判定細(xì)菌種類。據(jù)親緣性對(duì)比分析可知，A和B分別與Bacillus licheniformis（KY497446.1）和Bacillus subtilis（MF616407.1）具有100%的相似指數(shù)，C、D、E和F分別與Bacillus sonorensis（KF879303.1）、Brevibacterium sp.（AB066340.1）、Brevibacterium sp.（EU442367.1）和Brevibacterium sp.（KT580594.1）具有99%的相似指數(shù)。其中A、B和C測(cè)序結(jié)果與微生物鑒定結(jié)果一致，分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和索諾拉沙漠芽孢桿菌（Bacillus sonorensis），D、E和F經(jīng)過基因測(cè)序，均為短桿菌（Brevibacterium sp.），短桿菌沒有表型或化學(xué)分類的特征，需用核酸技術(shù)完成其相應(yīng)鑒定。

采用16S rDNA測(cè)序法對(duì)6 株菌進(jìn)一步進(jìn)行分子鑒定，將細(xì)菌測(cè)序所得的16S rDNA序列校對(duì)后，與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析（表5），并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），根據(jù)同源性遠(yuǎn)近進(jìn)一步判定細(xì)菌種類。據(jù)親緣性對(duì)比分析可知，A和B分別與Bacillus licheniformis（KY497446.1）和Bacillus subtilis（MF616407.1）具有100%的相似指數(shù)，C、D、E和F分別與Bacillus sonorensis（KF879303.1）、Brevibacterium sp.（AB066340.1）、Brevibacterium sp.（EU442367.1）和Brevibacterium sp.（KT580594.1）具有99%的相似指數(shù)。其中A、B和C測(cè)序結(jié)果與Biolog鑒定結(jié)果一致，分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和索諾拉沙漠芽孢桿菌（Bacillus sonorensis），D、E和F經(jīng)過基因測(cè)序，均為短桿菌（Brevibacterium sp.），短桿菌沒有表型或化學(xué)分類的特征，需用核酸技術(shù)完成其相應(yīng)鑒定。

圖 1 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of spoilage bacteria based on 16S rDNA sequences

2.5 熟制鮐魚中殘存菌群種群分布

表 6 保溫實(shí)驗(yàn)過程中熟制鮐魚脹袋樣品殘存菌菌相變化Table 6 Changes in residual bacterial flora in swollen cooked mackerel during examination of commercial sterilization

由表6可知，熟制鮐魚脹袋樣品脹袋時(shí)間不同，其殘存菌相存在差異。整個(gè)保溫過程中導(dǎo)致脹袋的細(xì)菌分為短桿菌屬和芽孢桿菌屬兩種。且隨著出現(xiàn)脹袋時(shí)間延長(zhǎng)，短桿菌比例逐漸減小，最終減小為0，而耐熱性芽孢桿菌的比例逐漸增大，最終增大為100%。說明當(dāng)短桿菌屬殘存比例較大時(shí)，熟制鮐魚越易脹袋，而隨著短桿菌屬比例的下降，芽孢桿菌屬比例的上升，熟制鮐魚出現(xiàn)脹袋越滯后。芽孢桿菌耐受力強(qiáng)，尤其是耐熱力，在熱殺菌強(qiáng)度不夠，水分活度等柵欄因子適宜的情況下，易殘留生長(zhǎng)，高鵬等[27]推斷芽孢桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬細(xì)菌的存在可能是引起真空包裝肘花脹袋從而使其產(chǎn)品變質(zhì)的主要原因；郭全友等[18]從脹袋即食蝦仁中分離出地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。短桿菌生長(zhǎng)溫度較芽孢桿菌低，為30 ℃[32]，不屬于耐高溫性細(xì)菌，可能是由于殺菌過程中存在殺菌盲點(diǎn)，受熱有效性降低導(dǎo)致。芽孢桿菌和短桿菌的生長(zhǎng)繁殖，說明熟制鮐魚殺菌過程中存在殺菌強(qiáng)度不足及殺菌不均勻現(xiàn)象。

2.6 熟制鮐魚貯藏過程中pH值變化

圖 2 熟制鮐魚貯藏前后及脹袋樣品pH值Fig. 2 Changes in pH of samples during examination of commercial sterilization

pH值可直接反映肉質(zhì)的新鮮度，魚類pH值的高低與蛋白質(zhì)的分解情況密切相關(guān)。由圖2可知，熟制鮐魚脹袋樣品與貯藏初始點(diǎn)和終點(diǎn)樣品差異明顯。A0和A1的pH值均高于B1、B2、B3和B4，即脹袋樣品的pH值均低于未脹袋樣品。魯淑彥等[33]研究顯示，非商業(yè)無菌的軟烤蝦脹袋現(xiàn)象的產(chǎn)生是因?yàn)闅⒕粡氐资贡貙?shí)驗(yàn)后微生物增殖所致。

pHA0＞pHA1＞6.00，熟制鮐魚經(jīng)過調(diào)味、腌制等加工過程，不僅將其產(chǎn)品的pH值顯著提升，且到達(dá)貯藏終點(diǎn)時(shí)，熟制鮐魚的pH值仍保持在6.00以上。B1～B4的pH值隨貯藏時(shí)間的增加呈先下降后升高的趨勢(shì)。貯藏過程中，魚體脂肪氧化分解，會(huì)導(dǎo)致pH值降低，同時(shí)鮐魚富含蛋白質(zhì)，魚肉pH值的降低會(huì)使蛋白質(zhì)分解加快，產(chǎn)生較多的堿性含氮化合物；鐘賽意等[34]證實(shí)，蛋白質(zhì)分解與微生物數(shù)量也存在一定的依賴性，當(dāng)菌落總數(shù)不小于6.33（lg（CFU/g））時(shí)，肌肉蛋白質(zhì)分解作用增強(qiáng)。由表4可知，B4的菌落總數(shù)指標(biāo)最高，達(dá)到了5.18（lg（CFU/g）），產(chǎn)生了較多的堿性物質(zhì)，促使pH值升高，這種現(xiàn)象與Pinter等[35]的研究結(jié)果相吻合。

2.7 熟制鮐魚貯藏過程中TVB-N含量的變化

圖3為熟制鮐魚商業(yè)無菌貯藏實(shí)驗(yàn)前后（第0天和第10 天）及脹袋樣品的TVB-N含量變化。TVB-N是微生物分解蛋白質(zhì)、氨基酸等含氮化合物產(chǎn)生的堿性代謝產(chǎn)物[36]，包括胺類、二甲胺和三甲胺等物質(zhì)，其與鮐魚鮮度有較高的相關(guān)性，TVB-N的限量常定為30 mg/100 g。由圖3可知，在商業(yè)無菌貯藏過程中，熟制鮐魚脹袋樣品（除B2外）與貯藏初始點(diǎn)A0和終點(diǎn)樣品A1的TVB-N含量差異均顯著（P＜0.05），脹袋樣品整體高于初始點(diǎn)和終點(diǎn)樣品。Li Xinfu等[37]研究貯藏期間真空包裝煙熏培根中微生物群落的變化時(shí)指出，TVB-N含量與貯藏期間微生物的生長(zhǎng)繁殖呈正相關(guān)關(guān)系。

圖 3 熟制鮐魚貯藏前后及脹袋樣品TVB-N含量Fig. 3 Changes in TVB-N content of fish samples during examination of commercial sterilization

由于腐敗程度不同，B1、B2、B3和B4差異顯著（P＜0.05）。除B2外，B1、B3和B4的TVB-N含量均高于A0和A1，B3腐敗最嚴(yán)重，達(dá)到33.19 mg/100 g，超出了安全限量。B2雖為脹袋樣品，但其TVB-N含量（17.77 mg/100 g）相對(duì)較低，可能是由于魚體自身腐敗程度及原料新鮮度存在個(gè)體差異。夏秀東等[36]研究表明，腐敗菌接種至無菌白魚塊后，魚塊達(dá)到感官拒絕點(diǎn)時(shí)的TVB-N含量最低為22.64 mg/100 g，最高為29.98 mg/100 g。貯藏結(jié)束時(shí)，A0和A1的TVB-N含量均小于30 mg/100 g，A1略高于A0，為19.52 mg/100 g（＜22.64 mg/100 g），仍處于安全限量之內(nèi)，說明經(jīng)過商業(yè)無菌保溫實(shí)驗(yàn)后，熟制鮐魚能夠較好地保持自身鮮度。這與夏秀東等[36]研究結(jié)果相吻合，除B2外，B1、B3和B4的TVB-N含量整體高于22.64 mg/100 g。

2.8 熟制鮐魚貯藏前后組胺含量變化

組胺是鮐魚等鯖科魚類安全性的重要指標(biāo)，經(jīng)檢測(cè)熟制鮐魚貯藏前后組胺含量均低于檢出限5 mg/100 g。GB/T 18108—2008鮐魚的組胺限量標(biāo)準(zhǔn)為不大于100 mg/100 g，經(jīng)過10 d的保溫貯藏實(shí)驗(yàn)，其組胺含量并未超出檢出限，仍低于安全限量標(biāo)準(zhǔn)。Emborg等[38]指出，貯藏過程中，組胺形成菌（如摩根氏菌）與魚體內(nèi)組氨酸脫羧酶共同作用，可促使組胺形成。熟制鮐魚經(jīng)過加熱和殺菌等工序，破壞了組胺產(chǎn)生的必要條件，增強(qiáng)了其安全性。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了鮐魚熟制前后的鹽分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、aw、pH值、TVB-N含量和菌落總數(shù)等品質(zhì)指標(biāo)，分析了商業(yè)無菌10 d保溫貯藏實(shí)驗(yàn)前后pH值、TVB-N含量、組胺含量和菌落總數(shù)，并檢測(cè)其保溫實(shí)驗(yàn)過程中脹袋樣品的殘留菌種。熟制鮐魚pH值（6.29±0.02）大于原料鮐魚pH值（5.72±0.09），改善了其肉質(zhì)酸的特性，此外抑制微生物生長(zhǎng)鹽分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、aw等柵欄因子都得到了有效的控制。商業(yè)無菌貯藏初始點(diǎn)與終點(diǎn)樣品感官評(píng)價(jià)無顯著差異（P＞0.05），在消費(fèi)者可接受范圍之內(nèi)。未脹袋熟制鮐魚產(chǎn)品的菌落總數(shù)均小于2（lg（CFU/g）），微生物得到了有效控制；脹袋鮐魚樣品中共分離出4 種菌，其中3 種為耐熱的芽孢桿菌，1 種為短桿菌，細(xì)菌的增殖與鮐魚肉質(zhì)pH值改變及其安全性都密切相關(guān)，同時(shí)也驗(yàn)證了微波殺菌具有不均勻性，殺菌工藝需進(jìn)一步改善。整個(gè)商業(yè)無菌貯藏過程中，熟制鮐魚的pH值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但至保溫實(shí)驗(yàn)10 d結(jié)束時(shí)，pH值（6.04±0.01）仍大于6；脹袋樣品（除B2外）的TVB-N含量有升高，與未脹袋樣品相比，差異均顯著（P＜0.05）；且保溫實(shí)驗(yàn)前后熟制鮐魚樣品的組胺含量仍低于安全限值。總之，所研制熟制鮐魚加工工藝能有效提升產(chǎn)品品質(zhì)，達(dá)到了商業(yè)無菌貯藏10 d的標(biāo)準(zhǔn)，為開發(fā)熟制鮐魚新產(chǎn)品，提升鮐魚資源利用價(jià)值提供一定的參考。