趙紫迎，賈雯茹，左小霞，金文淵，金 鵬，鄭永華,

（1.南京農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095；2.蘇州大福外貿(mào)食品有限公司，江蘇 蘇州 215000）

青花菜又名西蘭花、綠菜花，營養(yǎng)成分齊全且含量高，并具有抗氧化、預防癌癥等功效[1-2]，深受各國消費者喜愛。但青花菜水分質(zhì)量分數(shù)達90%以上，采后在常溫下2 d會出現(xiàn)開花黃化的跡象，6 d就會失水萎蔫，失去食用價值[3]，影響青花菜的外觀及內(nèi)在品質(zhì)，從而限制青花菜采后流通和產(chǎn)業(yè)發(fā)展，因此研究青花菜的貯藏保鮮技術有重要的現(xiàn)實意義[4]。

濕度是影響新鮮果蔬貯藏的環(huán)境因素，果蔬采后在低濕環(huán)境下貯藏時由于蒸騰作用極易失水，導致產(chǎn)品的萎蔫而失去商品性。薛彥斌等[5]研究了不同相對濕度（relative humidity，RH）對黃瓜、茄子和青椒等果菜類貯藏期間質(zhì)量損失率和乙烯產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)RH越低，質(zhì)量損失率越高，乙烯生成量越多，貯藏期越短；王劍功[6]發(fā)現(xiàn)高濕（RH 90%～98%）貯藏可抑制大葉菠菜和油菜等蔬菜的質(zhì)量損失，保持較高的感官評分和葉綠素含量。這些研究表明，較高環(huán)境濕度有利于果蔬品質(zhì)的保持。但普通冷庫中常達不到果蔬保鮮要求的濕度條件，采用傳統(tǒng)的超聲波和高壓噴霧等加濕處理，由于其產(chǎn)生的水霧顆粒直徑較大，在低溫環(huán)境中極易產(chǎn)生結露凝水的現(xiàn)象，濕度控制的精度低，并起不到增濕的作用，同時會促進果蔬病原菌生長而增加腐爛的發(fā)生[7-8]。本研究采用的以色列HygroTech公司發(fā)明的干霧控濕高濕冷庫，是通過減小加濕水霧顆粒的直徑（2～10 μm）使水分直接蒸發(fā)到空氣中而達到RH 95%～98%的高濕條件，同時可避免凝水結露，減輕果蔬的腐爛。楊奕辰[9]和孟祥春[10]等已采用該干霧控濕高濕冷庫用于青菜、柑橘和番木瓜等果蔬的保鮮實驗，發(fā)現(xiàn)干霧控濕高濕貯藏可有效抑制這些果蔬產(chǎn)品的蒸騰失水，延長貯藏期，因而在果蔬采后保鮮中具有較好的應用前景。但有關干霧控濕高濕貯藏對青花菜保鮮的作用尚鮮見研究報道。結合青花菜采后易失水萎蔫和黃化的特性，推測高濕貯藏對青花菜保鮮應該具有潛在的作用。為此，本實驗研究了干霧控濕高濕冷庫和普通冷庫貯藏對青花菜貯藏期間質(zhì)量損失、黃化、葉綠素和可溶性糖含量及其代謝相關酶活力變化的影響，以探索高濕貯藏對青花菜保鮮的作用，并從糖代謝的角度闡明其作用機理，以期為高濕貯藏在青花菜保鮮中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

挑選大小均勻、花球緊實、成熟度一致、無病蟲害的‘山水’青花菜為實驗材料，采收后覆冰降溫，2 h內(nèi)運回實驗室。

乙腈（色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司；石英砂、碳酸鈣、鹽酸、氯化鎂（MgCl2）、抗壞血酸、乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na2） 上海麥恪林生化科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（crosslinked polyvinylpyrrolidone，PVPP）、苯甲基磺酰氟（benzenesulfonyl fluoride，PMSF）北京索萊寶科技有限公司；尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose，UDPG）、果糖-6-磷酸（fructose-6-phosphate，F(xiàn)-6-P）、蔗糖、葡萄糖 上海源葉生物科技有限公司；甘油、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）、腺嘌呤核苷三磷酸（adenine nucleoside triphosphate，ATP）、6-磷酸-葡萄糖脫氫酶（6-phosphate-glucose dehydrogenase，G6PDH） 南京都萊生物技術有限公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid，Hepes）、葡萄糖磷酸變位酶（glucose phosphomutase，PGM）、焦磷酸（inorganpyrophosphate，Ppi） 南京建成生物工程研究所；植物葉綠素酶檢測試劑盒、植物脫鎂螯合酶檢測試劑盒 南京邁博生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Hygrote濕度控制系統(tǒng)（配有電腦控制終端、濕度調(diào)節(jié)感應系統(tǒng)和果蔬貯藏庫專用大口徑5 mm干霧霧化器）以色列Hygrotech公司；RS-YS-W-A型GSP無線溫濕度測點、RSWS-ETH-6型以太網(wǎng)溫濕度記錄儀 山東仁科測控技術有限公司；AWH-SA型電子桌秤 上海凡展衡器有限公司；V729型可見分光光度計 青島聚創(chuàng)環(huán)保設備有限公司；2-16R型高速冷凍離心機 湖南恒諾儀器設備有限公司；1100型高效液相色譜 美國安捷倫公司；Shodex Sugar-D糖分析柱（250 mm×4.6 mm） 日本昭和電工集團；電熱恒溫水浴鍋 精中科技有限公司；RT2140型家用防水觸摸式電磁爐 美的集團。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將挑選后的青花菜隨機分為兩組，然后放入720 mm×515 mm×390 mm的塑料轉運筐中，每組12 筐，每筐6 顆，分別置于（4.0±0.5）℃的干霧控濕高濕冷庫（RH 95%～98%）（高濕組）和普通冷庫中（RH 70%～75%）（低濕組）貯藏36 d，每隔6 d取青花菜花蕾用于各項指標分析測定。

1.3.2 指標的測定

1.3.2.1 質(zhì)量損失率的測定

質(zhì)量損失率采用稱質(zhì)量法測定，具體按公式（1）計算。

式中：m1為貯藏前的質(zhì)量/g；m2為貯藏后的質(zhì)量/g。

1.3.2.2 黃化指數(shù)的測定

黃化指數(shù)參考Ku等[11]的方法，并稍加修改，黃化級數(shù)標準見表1，黃化指數(shù)按式（2）計算。

表 1 青花菜黃化分級標準Table 1 Grading standards for the yellowing of postharvest broccoli

1.3.2.3 葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量的測定

稱取青花菜樣品0.5 g，加入少量石英砂、碳酸鈣和3～5 mL體積分數(shù)95%乙醇溶液，在研缽中充分研磨。用少量體積分數(shù)95%乙醇沖洗數(shù)次后，包括殘渣一起倒入離心管中，用高速冷凍離心機12 000×g離心10 min后將上清液轉至25 mL容量瓶中，用體積分數(shù)95%乙醇溶液定容，在649 nm和665 nm波長處測定吸光度。分別根據(jù)式（3）～（5）計算葉綠素a、葉綠素b的質(zhì)量濃度、總葉綠素含量，然后轉換成以干質(zhì)量計的含量。

式中：ρa和ρb分別為葉綠素a和葉綠素b的質(zhì)量濃度/（mg/L）；CChl為總葉綠素含量/（mg/g）；V為樣品提取液總體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.2.4 葉綠素酶和脫鎂螯合酶活力的測定

粗酶液的提取：稱取青花菜樣品1 g，加入8 mL-20 ℃預冷的丙酮，在研缽中充分研磨，用高速冷凍離心機12 000×g離心10 min后去除上清液取沉淀，用-20 ℃預冷的丙酮洗脫，直至沉淀無綠色。取沉淀加入5 mL 5 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液，在30 ℃下抽提30 min，用高速冷凍離心機在10 000×g離心10 min后取上清液用來測葉綠素酶和脫鎂螯合酶活力。

葉綠素酶活力的測定使用植物葉綠素酶檢測試劑盒進行，結果用U/μg表示；脫鎂螯合酶活力的測定使用植物脫鎂螯合酶酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒進行，結果用mmol/g表示。

1.3.2.5 可溶性糖含量的測定

可溶性糖含量的測定使用高效液相色譜法。取2 g青花菜樣品在10 mL、體積分數(shù)80%乙醇溶液中研磨成勻漿，在80 ℃水浴下提取1 h，然后用高速離心機12 000×g離心10 min后取上清液，上清液用0.45 μm纖維膜過濾后進行高效液相色譜分析。分析色譜柱為Sugar-D糖分析柱，檢測器采用蒸發(fā)光散射檢測器，進樣體積為20 μL，柱溫為40 ℃，流速為1 mL/min，流動相為體積分數(shù)75%的乙腈溶液，結果以干質(zhì)量計，單位為mg/g。

1.3.2.6 蔗糖代謝相關酶活力的測定

蔗糖磷酸合酶（sucrose-phosphate synthase，SPS）和蔗糖酸性轉化酶（sucrose acid invertase，SAI）活力的測定分別參照Hubbard[12]和Vargas[13]等的方法，稍加改動。稱取1 g青花菜樣品，加入6 mL提取液（含100 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L VC、2 mmol/L EDTA-Na2、3 g/100 mL PVPP、0.1 mmol/L PMSF），在低溫條件下研磨成勻漿，轉入10 mL離心管中，12 000 r/min離心20 min，取上清液測定酶活力。

SPS活力測定：反應體系為100 μL 0.05 mmol/L pH 7.5 Tris-NaOH、20 μL 50 mmol/L MgCl2、20 μL 100 mmol/L UDPG、20 μL 100 mmol/L F-6-P，酶反應液0.5 mL。在30 ℃條件下水浴30 min，加入2 mol/L NaOH溶液200 μL，沸水浴10 min，迅速冷卻后加入0.1 g/100 mL苯酚0.5 mL和體積分數(shù)30%鹽酸溶液1.5 mL，搖勻后在80 ℃條件下水浴10 min，冷卻后于480 nm波長處測吸光度。

SAI活力測定：反應體系為0.1 mol/L pH 4.8醋酸緩沖液1 mL，0.1 mol/L蔗糖溶液0.5 mL，酶反應液0.5 mL。在37 ℃條件下水浴30 min，加入3.15 g/L 3,5-二硝基水楊酸溶液1.5 mL終止反應，沸水浴5 min，迅速冷卻后于540 nm波長處測吸光度。

各酶活力以每毫克酶每秒內(nèi)催化底物合成糖的質(zhì)量表示。

1.3.2.7 己糖（葡萄糖和果糖）降解相關酶活力的測定

粗酶液的提?。悍Q取1 g青花菜樣品，加入6 mL提取液（50 mmol/L pH 6.8 Tris-HCl、5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EDTA、體積分數(shù)15%甘油），在低溫條件下研磨成勻漿，轉入10 mL離心管中，取上清液測定酶的活力。

葡萄糖激酶（glucokinase，GK）活力的測定參照Mustroph等[14]的方法：反應體系為0.1 mol/L pH 8.5 Tris-HCl 2 mL、5 mmol/L MgCl20.1 mL、0.6 mmol/L NAD 0.1 mL、2 mmol/L ATP 0.1 mL、2 U G6PDH 0.1 mL、酶反應液0.1 mL、10 mmol/L葡萄糖溶液0.1 mL。在30 ℃條件下水浴30 min，之后沸水浴5 min終止反應，冷卻后于340 nm波長處測吸光度。

尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphorylase，UGPase）活力的測定參照Sowokinos等[15]的方法。反應體系為80 mmol/L pH 7.8 Hepes 2 mL、5 mmol/L MgCl20.1 mL、0.6 mmol/L NAD 0.1 mL、1 mmol/L UDPG 0.1 mL、2 U G6PDH 0.1 mL、1 U PGM 0.1 mL、酶反應液0.1 mL、0.5 mmol/L Ppi 0.1 mL。在30 ℃條件下水浴30 min，之后沸水浴5 min終止反應，冷卻后于340 nm波長處測吸光度。

GK與UGPase單位均為U/g。

1.3.2.8 蛋白質(zhì)含量的測定

蛋白質(zhì)含量的測定參照Bradford[16]的方法，以牛血清白蛋白為標準。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

上述指標均取3 個平行樣，作3 次重復測定。運用Microsoft Excel 2010和SAS 9.2軟件對測定數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，OriginPro 8.5.1軟件作圖，用Duncan’s多重比較法進行差異顯著性分析，P＜0.05代表差異顯著。

2 結果與分析

2.1 高濕貯藏對青花菜質(zhì)量損失率和黃化指數(shù)的影響

圖 1 高濕貯藏對青花菜質(zhì)量損失率（A）與黃化指數(shù)（B）的影響Fig. 1 Effect of high RH storage on mass loss rate (A) and yellowing index (B) of postharvest broccoli

如圖1A所示，低濕組青花菜質(zhì)量損失率在貯藏期間迅速上升，貯藏36 d后質(zhì)量損失率達到41.67%；而高濕組青花菜質(zhì)量損失率上升緩慢，在整個貯藏期間質(zhì)量損失率都顯著低于低濕組（P＜0.05），貯藏結束時的質(zhì)量損失率僅為11.20%，因此高濕貯藏能夠顯著抑制采后青花菜水分的損失。與質(zhì)量損失率的變化趨勢相似，低濕組青花菜黃化指數(shù)在貯藏期間迅速上升，貯藏24 d后黃化指數(shù)顯著高于高濕組（P＜0.05），貯藏結束時高濕組青花菜的黃化指數(shù)僅為2.93，而低濕組黃化指數(shù)高達4.53（圖1B），因此高濕貯藏能夠抑制青花菜黃化的發(fā)生。這些結果表明，高濕貯藏能夠保持采后青花菜較高的水分含量，延緩衰老黃化，從而保持其新鮮度和商品性。

2.2 高濕貯藏對青花菜葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量的影響

如圖2所示，在整個貯藏期間，總葉綠素、葉綠素a和葉綠素b的含量均呈一直下降的趨勢，且高濕組葉綠素含量在整個貯藏期間均高于低濕組。貯藏結束時，低濕組青花菜的總葉綠素、葉綠素a和葉綠素b的含量分別比高濕貯藏組低33.31%、32.38%、34.76%，因此，高濕貯藏能夠抑制青花菜葉綠素的降解，從而延緩黃化，保持其感官品質(zhì)。

圖 2 高濕貯藏對青花菜總葉綠素（A）、葉綠素a（B）和葉綠素b（C）含量的影響Fig. 2 Effect of high RH storage on total chlorophyll (A) , chlorophyll a (B)and chlorophyll b (C) contents of postharvest broccoli

2.3 高濕貯藏對青花菜葉綠素酶和脫鎂螯合酶活力的影響

葉綠素酶和脫鎂螯合酶是催化葉綠素降解的兩個重要酶。如圖3所示，青花菜貯藏過程中葉綠素酶活力呈下降趨勢，而脫鎂螯合酶活力呈緩慢上升趨勢，在整個貯藏期間低濕組青花菜葉綠素酶和脫鎂螯合酶活力都高于高濕組，且在貯藏結束時低濕組的葉綠素酶和脫鎂螯合酶活力分別是高濕組的1.34 倍和1.38 倍。因此，高濕貯藏可以使青花菜維持較低的葉綠素酶和脫鎂螯合酶活力，從而抑制葉綠素的降解，保持較高的葉綠素含量。

圖 3 高濕貯藏對青花菜葉綠素酶（A）和脫鎂螯合酶（B）活力的影響Fig. 3 Effect of high RH storage on chlorophyllase (A) and MDCase (B)activities of postharvest broccoli

2.4 高濕貯藏對青花菜可溶性糖含量的影響

圖 4 高濕貯藏對青花菜蔗糖（A）、果糖（B）和葡萄糖（C）含量的影響Fig. 4 Effect of high RH storage on sucrose (A) , fructose (B) and glucose (C) contents of postharvest broccoli

如圖4所示，青花菜貯藏過程中蔗糖、果糖和葡萄糖含量均呈下降趨勢，高濕貯藏可顯著抑制這3 種可溶性糖含量的下降，至貯藏結束時，低濕組青花菜的蔗糖、果糖和葡萄糖含量分別比高濕貯藏組低23.95%、28.73%和25.57%。這些結果表明，高濕貯藏能夠維持青花菜較高的可溶性糖含量。

2.5 高濕貯藏對青花菜SPS和SAI活力的影響

圖 5 高濕貯藏對青花菜SPS（A）和SAI（B）活力的影響Fig. 5 Effect of high RH storage on SPS (A) and SAI (B) activities of postharvest broccoli

如圖5A所示，青花菜貯藏過程中SPS活力呈下降趨勢，高濕貯藏可延緩SPS活力的下降，貯藏18 d后SPS活力顯著高于低濕組（P＜0.05）。如圖5B所示，高濕、低濕組青花菜的SAI活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，最高峰均出現(xiàn)在第24天，分別為14.1 μg/g和15.0 μg/g，并且在貯藏結束時，低濕組青花菜的SAI活力是高濕組的1.2 倍。因此，高濕貯藏能夠保持青花菜較高的SPS活力和較低的SAI活力，即能夠促進青花菜蔗糖的合成而抑制蔗糖的分解作用，從而保持較高的蔗糖含量。

2.6 高濕貯藏對青花菜GK和UGPase活力的影響

圖 6 高濕貯藏對青花菜GK（A）和UGPase（B）活力的影響Fig. 6 Effect of high RH storage on GK (A) and UGPase (B) activities of postharvest broccoli

如圖6A所示，兩組青花菜的GK活力均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，并在第24天出現(xiàn)活力高峰，在整個貯藏期間高濕組青花菜GK活力始終低于低濕組，在貯藏結束時，低濕組青花菜的GK活力是高濕組的1.23 倍。如圖6B所示，青花菜在貯藏期間UGPase活力呈逐漸上升的趨勢，低濕組UGPase活力始終高于高濕組。這些結果表明，高濕貯藏能夠保持青花菜較低的GK和UGPase活力，即能夠抑制葡萄糖的分解，從而保持較高的葡萄糖含量。

3 討 論

黃化是青花菜采后的衰老現(xiàn)象和限制其貯藏的主要問題，而葉綠素的降解是造成青花菜黃化的直接原因。葉綠素降解主要由發(fā)揮脫植基作用的葉綠素酶和催化卟啉環(huán)脫去Mg2+的脫鎂螯合酶調(diào)控。本研究中干霧控濕高濕貯藏可明顯降低葉綠素酶和脫鎂螯合酶的活力，抑制葉綠素的降解，保持較高的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素的含量，從而延緩青花菜的黃化。這與楊奕辰[9]采用干霧控濕高濕貯藏抑制青菜葉綠素降解和關文強等[17]采用RH 85%～96%的高濕冰箱貯藏抑制青菜和西芹葉綠素降解的結果相似。由于干霧控濕高濕貯藏不僅可以解決目前普通冷庫濕度偏低導致果蔬失水萎焉、增濕處理易凝露積水而增加腐爛發(fā)生等問題[10]，同時與塑料薄膜包裝[18]等保濕保鮮手段及1-甲基環(huán)丙烯（1-methylcyclopropen，1-MCP）[19]、6-芐氨基嘌呤[20]、乙醇[21]以及復合型乙烯吸收劑[22]等化學處理相比，具有綠色、環(huán)保等優(yōu)點，因而在青花菜等果蔬采后保鮮中具有較好的應用前景。

可溶性糖不僅是植物的能量來源和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，還可作為信號分子調(diào)節(jié)相關基因的表達和酶活力，從而調(diào)節(jié)果蔬的成熟衰老[23]。Yang Xiaotang等[24]發(fā)現(xiàn)，采用150 mmol/L的外源葡萄糖和果糖處理可抑制香蕉皮中葉綠素降解酶基因的表達和酶活力，從而抑制葉綠素的降解。采用外源蔗糖[25]和葡萄糖[26]處理可延緩青花菜采后衰老黃化，從而延長保鮮期。而一些延緩青花菜采后衰老黃化的保鮮處理也都與其保持較高的可溶性糖含量的作用有關。如Perini等[27]發(fā)現(xiàn)50 ℃熱水3 min浸泡處理可顯著抑制青花菜葉綠素含量的下降，延緩其衰老黃化，同時保持較高的可溶性糖含量；采用2.5 μL/L 1-MCP處理也可保持較高的葉綠素和可溶性糖含量，延緩青花菜的衰老黃化[28]。采用光照處理可抑制葉綠素酶和脫鎂螯合酶的活性，從而抑制葉綠素降解，延緩鮮切西蘭花黃化，這與其誘導的可溶性糖，尤其是葡萄糖累積密切相關[29]。Hasperué等[30]研究發(fā)現(xiàn)，與早上采收的青花菜相比，傍晚采收的在采后貯藏中不易發(fā)生衰老黃化，這是因為白天光合作用使青花菜中積累較多的淀粉，其可以轉化為可溶性糖，從而延緩其衰老黃化。本研究發(fā)現(xiàn)，采用RH 95%～98%的干霧控濕高濕貯藏可保持青花菜較高的蔗糖、果糖和葡萄糖含量，抑制其葉綠素的降解和黃化。這些結果表明，高濕貯藏可能通過維持較高的可溶性糖含量，從而延緩青花菜的黃化，但具體的作用機理有待深入研究。

蔗糖、果糖和葡萄糖是果蔬中可溶性糖存在的主要形式[31]。SPS和SAI是蔗糖代謝的兩個關鍵酶，SPS參與蔗糖的合成，能不可逆地催化尿苷二磷酸葡萄糖和果糖-6-磷酸反應生成蔗糖-6-磷酸，蔗糖-6-磷酸水解后產(chǎn)生蔗糖[32]；SAI是蔗糖轉化酶的一種，其作用為催化細胞液泡中的蔗糖降解為果糖和葡萄糖[33]，因此較高的SPS活力和較低的SAI活力有利于蔗糖的合成積累[32]。GK是4 種己糖激酶之一，能夠催化葡萄糖磷酸化；UGPase可調(diào)節(jié)尿苷二磷酸葡萄糖的合成與降解[34]，因此GK和UGPase的活力與己糖含量密切相關。有研究發(fā)現(xiàn)用蔗糖、葡萄糖[35]和1-MCP[28]處理可保持青花菜較高的SPS活力，降低SAI、GK和UGPase活力，從而保持較高的蔗糖、果糖和葡萄糖等可溶性糖含量，同時抑制葉綠素含量的下降和黃化。本實驗中，高濕貯藏也保持了青花菜中較高SPS活力和較低的SAI、GK和UGPase活力，同時保持了較高的蔗糖、果糖和葡萄糖等可溶性糖含量，抑制了葉綠素的降解和衰老黃化。這些結果表明，高濕貯藏可能通過調(diào)控糖代謝相關酶活力維持較高的可溶性糖含量，從而延緩青花菜的黃化。

4 結 論

與低濕貯藏相比，高濕貯藏可顯著抑制青花菜的蒸騰失水，抑制葉綠素酶和脫鎂螯合酶的活力，維持較高的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量，延緩青花菜的黃化；還可提高SPS的活力，降低SAI、GK和UGPase的活力，維持較高的可溶性糖含量，從而延緩青花菜的衰老黃化。