劉興龍,趙迎春,陳雪艷,佘欣鑫,SADIA Khatoon,姜 穎,解慧勇,蔣白楠,鄭毅男,劉文叢,,丁傳波,
(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林 長春 130118;2.吉林省健維天然生物科技有限公司,吉林 臨江 134300;3.參之道(通化)生物科技有限公司,吉林 通化 134001)
人參(Panax ginseng C. A. Meyer)是五加科(Araliaceae)植物人參干燥根及根莖,也是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材,具有補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智的功效[1]。近年來,人參常被用作促進(jìn)健康的藥用和功能性食品,市場上也因此出現(xiàn)了一些新的人參深加工品,如紅參、黑參等。黑參為生曬參在高溫條件下反復(fù)蒸制烘干制成。現(xiàn)代研究表明,黑參的主要活性成分為皂苷[2],包括多糖、多酚及多種氨基酸等黑參提取物都具有比生曬參、紅參有更強(qiáng)的生物活性,如抗氧化、抗腫瘤、降血糖、提高免疫、抗炎等[3-5],而目前對黑參多糖成分抗疲勞的研究鮮見報道。
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對疲勞的治療有限,已有學(xué)者研究具有抗疲勞作用的潛在替代品,包括傳統(tǒng)中草藥及預(yù)防疾病和促進(jìn)健康的藥用或功能性食品[6-7]。本實驗研究了黑參多糖成分對疲勞小鼠機(jī)體的改善作用,測定疲勞小鼠血清中相關(guān)生化指標(biāo),并對肝臟組織中白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)促炎因子分析,以及肌肉組織中過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α,PGC-1α)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(atherosclerosis peroxisome proliferator activated receptory α,PPARα)等相關(guān)基因mRNA表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行研究,評價黑參多糖對疲勞機(jī)體的延緩和改善效果,為黑參作為功能性食品和藥品的開發(fā)提供依據(jù)。
90 只SPF級ICR雄性小鼠,體質(zhì)量18~22 g,由吉林省長春市億斯實驗動物技術(shù)有限公司提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(吉)2018-0023。所有實驗程序經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。
黑參樣品購自吉林省琿春市華瑞參業(yè)有限公司,經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭毅男教授鑒定為五加科人參新型深加工產(chǎn)品,烘干后粉碎成粉,過60 目篩。
白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、血尿素氮(serum urea nitrogen,SUN)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、肝糖原測定試劑盒南京建成生物公司研究所;UNIQ-10柱式TRIzol總RNA提取試劑盒 生工生物工程(上海)股份有限公司;TB Green Premix Ex Taq(2×)(Tli RNaseH Plus)、ROX Reference Dye(50×) TaKaRa(北京)生物技術(shù)公司;抗兔二抗 北京索萊寶科技有限公司。
AE224電子天平 上海恒平儀器;BGZ-246電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京東南儀誠實驗室設(shè)備有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、冷凍干燥機(jī) 瑞士BUCHI公司;酶標(biāo)儀美國Thermo Electron公司;StepOnePLUS實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)儀 ABI(美國)有限公司;TG16-WS高速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;電泳儀、凝膠成像儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。
1.3.1 供試藥液的制備
黑參樣品粉碎,精密稱量100.001 5 g,加入5 倍體積的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液,常溫條件下攪抖提取3 h,8 000 r/min離心。去除上清液,取沉淀,加入8 倍體積的水,90 ℃水浴2 h,間歇攪抖,待冷卻后,于8 000 r/min離心45 min。靜置30 min,收集上清液,同時進(jìn)行濃縮,濃縮液加入3 倍體積的無水乙醇醇沉,靜置過夜。8 000 r/min離心,取沉淀并凍干,得到黑參多糖(black ginseng polysaccharide,BGP)樣品,經(jīng)此方法所提黑參多糖經(jīng)分析計算多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為86.4%。
1.3.2 實驗分組
在專業(yè)動物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,疲勞小鼠模型的建立按如下方式操作:90 只ICR小鼠隨機(jī)分為9 組:1)無游泳對照組(NS-cont);2)負(fù)重游泳對照組(SW-C,0 mg/kg mb);3)負(fù)重游泳低劑量組(SW-L,50 mg/kg mb);4)負(fù)重游泳中劑量組(SW-M,100 mg/kg mb);5)負(fù)重游泳高劑量組(SW-H,200 mg/kg mb);6)不負(fù)重游泳對照組(SW-cont,0 mg/kg mb);7)不負(fù)重游泳黑參多糖低劑量組(SW-BGP-L,50 mg/kg mb);8)不負(fù)重游泳黑參多糖中劑量組(SW-BGP-M,100 mg/kg mb);9)不負(fù)重游泳黑參多糖高劑量組(SW-BGP-H,200 mg/kg mb)。對照組每天灌胃生理鹽水,給藥組每天按不同劑量灌胃,連續(xù)28 d。所有動物飼養(yǎng)在具備動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)許可的專業(yè)動物房內(nèi),在特定的無病原體條件下(控制溫度18~28 ℃,相對濕度30%~80%),每籠飼養(yǎng)4~5 只,并飼喂標(biāo)準(zhǔn)實驗室食品且保證自由飲水喂食。
1.3.3 負(fù)重游泳實驗
通過負(fù)重游泳實驗,對小鼠進(jìn)行肌肉疲勞鍛煉,進(jìn)而測定小鼠力竭游泳時間。而力竭游泳時間是機(jī)體抗應(yīng)激、抗疲勞能力的綜合體現(xiàn),也是衡量機(jī)體運(yùn)動能力的重要體外指標(biāo)[8-9]。按照給藥劑量灌胃給藥28 d,末次給藥30 min后,在負(fù)重游泳組小鼠尾端系上小鼠體質(zhì)量5%的鉛皮,置于(30±2)℃的水箱(水深度為(50±2)cm,以確保小鼠完全進(jìn)入水中而不觸碰水底)進(jìn)行游泳鍛煉,自小鼠入水時開始計時,至其沉入水底超過10 s時作為其力竭時間。
1.3.4 臟器指數(shù)及血清生化指標(biāo)的檢測
按劑量灌胃給藥28 d,末次給藥30 min后,對非負(fù)重游泳組小鼠在安靜狀態(tài)下斷尾取血,用血乳酸儀測定其BLA含量,立即止血,置于同1.3.3節(jié)水箱中游泳30 min,立即吹干并休息10 min后測定其游泳后BLA含量。之后將所有小鼠用異氟烷麻醉以進(jìn)行采血,血樣靜置15 min然后4 ℃、4 000 r/min離心10 min,分取血清,按照試劑盒說明書方法測定生化指標(biāo)。然后處死取骨骼肌,液氮保存?zhèn)溆?;同時收集小鼠肝臟、脾和腎,生理鹽水洗去血漬,濾紙吸干稱質(zhì)量,并按照下式計算各臟器指數(shù)。將分取的肝臟用錫紙保存于-80 ℃,用于勻漿制備、蛋白質(zhì)印跡分析。
1.3.5 逆轉(zhuǎn)錄qPCR
稱取小鼠骨骼肌50 mg,置于經(jīng)過高壓滅菌的研缽中,加入液氮進(jìn)行充分研磨;將研磨好的粉末分取放入1.5 mL離心管中,靜置5 min,加入1 mL的裂解液裂解1 min,再按照提取總RNA試劑盒提取組織中RNA;分取1 μL總RNA加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,合成cDNA模版,并以此為模版利用TB Green Premix Ex Taq(2×)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。qPCR所使用的引物序列如表1,反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s,退火溫度為55 ℃、30 s,40 個循環(huán)。
表 1 引物序列Table 1 Sequence sequences of primers used in this study
1.3.6 免疫印跡分析
小鼠肝IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平采用Western blot法測定。稱取部分肝組織,加入蛋白裂解液,勻漿離心,提取總蛋白,并通過蛋白質(zhì)試劑盒測定濃度。蛋白質(zhì)通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離,并隨后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(poly(vinylidene fluoride),PVDF)膜。將PVDF膜在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶中封閉60 min,在4 ℃下一抗孵育過夜,再于二抗中室溫孵育60 min。β-肌動蛋白被用作內(nèi)標(biāo),檢測炎癥蛋白因子IL-1β、TNF-α在肝臟中的表達(dá)。
使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,采用單因素方差分析對各組數(shù)據(jù)的差異性進(jìn)行比較,P<0.05表示差異顯著,所得數(shù)據(jù)以 ±s表示。結(jié)果數(shù)據(jù)圖表用GraphPad Prism 6.0軟件制作。
圖 1 黑參多糖對小鼠負(fù)重游泳時間的影響Fig. 1 Effect of BGP on exhaustive swimming time of mice
如圖1所示,3 個劑量組的小鼠負(fù)重游泳時間比SM-C的游泳時間極顯著延長,低、中、高劑量組分別延長6.61%、34.92%、8.14%。結(jié)果表明,黑參多糖增強(qiáng)了小鼠的強(qiáng)迫游泳能力,說明黑參多糖具有抗疲勞作用。
表 2 黑參多糖對小鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響Table 2 Effect of BGP on body mass and organ indices in mice
如表2所示,對小鼠的體質(zhì)量及臟器指數(shù)進(jìn)行測定。與對照組小鼠相比,黑參多糖中劑量組和高劑量組小鼠體質(zhì)量略有下降,但各給藥組小鼠肝臟、腎臟和脾臟指數(shù)并無顯著差異。結(jié)果表明,在增強(qiáng)小鼠肌肉方面會有部分改善,而對小鼠的臟器并不會造成損傷,并可能形成保護(hù)作用。
圖 2 黑參多糖對小鼠血清中BUN(A)、BLA(B)及IL-6(C)水平的影響Fig. 2 Effect of BGP on the levels of BUN (A), BLA (B) and IL-6 (C) in mice
如圖2A、B所示,與空白對照組相比,強(qiáng)制游泳組小鼠血清中BUN和BLA水平顯著升高,表明通過強(qiáng)制游泳引起的小鼠機(jī)體疲勞模型建立成功。然而,通過黑參多糖處理的低、中、高劑量組小鼠血清中BLA和BUN水平極顯著下降(P<0.01),高劑量組(200 mg/kg)具有更好的效果。如圖2C所示,在強(qiáng)迫游泳的小鼠中,與NS-cont組相比,SW-cont組IL-6水平極顯著增加,而經(jīng)黑參多糖處理后各給藥組抑制了機(jī)體血清IL-6水平的升高。這些結(jié)果表明,黑參多糖顯著減少了BUN、BLA因運(yùn)動疲勞在血清中的堆積,同時又能顯著抑制血清中IL-6水平的升高,因而起到抗疲勞作用。
圖 3 黑參多糖對小鼠肝臟中MDA(A)、SOD(B)、GSH-Px(C)及肝糖原(D)水平的影響Fig. 3 Effect of BGP on the levels of MDA (A), SOD (B), GSH-Px (C)and glycogen (D) in liver tissues of mice
圖3A顯示了與NS-cont組相比,SW-cont組小鼠肝臟中MDA水平極顯著升高(P<0.01),而黑參多糖給藥組能夠極顯著降低因運(yùn)動疲勞引起的小鼠肝臟中MDA水平(P<0.01)。如圖3C所示,強(qiáng)制游泳的小鼠肝臟中GSH-Px含量與空白組相比略有升高但并無顯著區(qū)別,只有100、200 mg/kg高劑量組處理后有顯著提高(P<0.05)。圖3B、D則顯示了經(jīng)黑參多糖處理可極顯著提高小鼠運(yùn)動疲勞后體內(nèi)肝糖原水平(P<0.01),升高肝臟中SOD的活性。
這些結(jié)果表明,黑參多糖可明顯降低小鼠因運(yùn)動疲勞導(dǎo)致的肝部脂質(zhì)過氧化水平,加速清除自由基能力,同時又能增強(qiáng)機(jī)體肝糖原的儲備,提高運(yùn)動耐力而緩解機(jī)體疲勞。
2.5.1 提取總RNA的檢測
圖 4 骨骼肌組織總RNA質(zhì)量檢測Fig. 4 Quality detection of total RNA extracted from skeletal muscle tissues
表 3 各組總RNA A260 nm/A280 nm比值Table 3 A260 nm/A280 nm ratio of total RNA in each group
如圖4所示,從疲勞小鼠骨骼肌中提取的總RNA在18S、28S具有清晰的條帶,并且A260nm/A280nm比值均在2.00~2.10之間,如表3所示,證明運(yùn)用此方法提取的骨骼肌中總RNA具有較高的純度和完整性。
2.5.2 qPCR分析結(jié)果
圖 5 小鼠運(yùn)動后骨骼肌中PGC-1α(A)、PPARα(B)基因的表達(dá)量Fig. 5 Expression of PGC-1α (A) and PPAR-α (B) genes in skeletal muscle of mice after exercise
圖5 A、B顯示了PGC-1α、PPAR-α基因在疲勞小鼠骨骼肌中的表達(dá)情況。與SW-cont組相比,黑參多糖各劑量組小鼠骨骼肌中PGC-1α、PPARα基因的表達(dá)量相比顯著升高(P<0.05),表明黑參多糖調(diào)節(jié)與運(yùn)動相關(guān)的基因,其響應(yīng)于肌肉疲勞而發(fā)生。
圖 6 黑參多糖對疲勞小鼠肝臟中IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of BGP on IL-1β and TNF-α protein expression in liver of fatigued mice
如圖6所示,疲勞會導(dǎo)致肝臟組織中IL-1β、TNF-α炎癥蛋白表達(dá)量極顯著上升(P<0.01)。而與SW-cont組比較,黑參多糖給藥組可以下調(diào)IL-1β、TNF-α蛋白因子的表達(dá),并具有極顯著差異(P<0.01)。結(jié)果說明,黑參多糖可以用來改善小鼠機(jī)體疲勞是通過減輕疲勞致?lián)p的肝臟組織中炎癥反應(yīng)和提高機(jī)體免疫功能而發(fā)揮作用。
目前,隨著生活節(jié)奏的加快,工作和生活的壓力不斷加劇。因此,機(jī)體疲勞是常見的,甚至影響了人們的日常生活。一般認(rèn)為,疲勞是連續(xù)工作或運(yùn)動后效率下降的復(fù)雜現(xiàn)象,可分為精神疲勞和身體疲勞[10]。疲勞是一種生理性改變,主要表現(xiàn)為代謝產(chǎn)物積累而引起的肌肉張力和運(yùn)動耐力降低[11-12]。由于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段對于諸如疲勞等一些輕度功能障礙還難以治愈,尤其是目前對于體內(nèi)分子機(jī)制的認(rèn)識還是有限的,人們逐漸關(guān)注功能性食品或傳統(tǒng)藥材潛在替代品,對這些替代物進(jìn)行生物醫(yī)學(xué)研究,以期解決這些復(fù)雜機(jī)體問題并促進(jìn)健康狀況。圖1的結(jié)果顯示,黑參多糖顯著延長了小鼠力竭游泳時間(P<0.05),其中以SW-M組效果最佳,比SM-C游泳對照組延長了34.92%,表明其具有強(qiáng)效的抗疲勞作用。
通常來講,運(yùn)動會引起機(jī)體疲勞,加劇血乳酸在體內(nèi)的堆積,積聚越多,疲勞程度就越嚴(yán)重。圖2的結(jié)果顯示,與NS-cont組相比,運(yùn)動后血清中BLA含量顯著升高(P<0.01),黑參多糖處理后會顯著減少運(yùn)動中BLA的生成,達(dá)到緩解機(jī)體疲勞的效果。血清中BUN一般用來評價機(jī)體代謝能力和承受負(fù)荷能力的指標(biāo)。研究結(jié)果表明,與SW-cont組相比,黑參多糖可以極顯著降低小鼠血清中BUN含量(P<0.01),表明黑參多糖可以減少疲勞機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的分解,提高機(jī)體運(yùn)動負(fù)荷能力。而運(yùn)動導(dǎo)致疲勞機(jī)體損傷同樣會引發(fā)炎癥反應(yīng)并產(chǎn)生促炎因子IL-6,其是促炎細(xì)胞因子和肌肉疲勞的生物標(biāo)志物[12]。由于IL-6水平在肌肉疲勞反應(yīng)中增加[13-14],并且刺激對創(chuàng)傷或組織損傷的免疫應(yīng)答,導(dǎo)致肌肉炎癥。研究結(jié)果表明,運(yùn)動后各劑量組IL-6水平均極顯著高于NS-cont組(P<0.01),但與SW-cont組相比,經(jīng)黑參多糖處理后又可防止肌肉疲勞介導(dǎo)的血清IL-6水平升高,表明黑參多糖可通過調(diào)節(jié)IL-6水平預(yù)防肌肉功能障礙或損傷達(dá)到抗疲勞作用目的。
肝臟組織中SOD作為生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì),是生物體防御體系重要的抗氧化物酶[15-17],也是衡量機(jī)體自由基代謝的敏感指標(biāo);體內(nèi)SOD活性維持一定水平,可反映機(jī)體過氧化程度,同時保護(hù)機(jī)體組織細(xì)胞免受損傷[17-21]。GSH-Px是體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑,還能特異性催化谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應(yīng),起到保護(hù)細(xì)胞膜的作用[22-25]。隨著運(yùn)動時間的延長,機(jī)體血糖水平下降會加劇機(jī)體疲勞,為維持正常功能,機(jī)體會過度分解儲存在肝臟中的糖原轉(zhuǎn)化成能量。所以,增加肝糖原儲備,是保持血糖濃度穩(wěn)定、延緩機(jī)體疲勞和維持正常生命體征的重要方式之一[26]。本研究結(jié)果顯示,黑參多糖各劑量組可提高SOD和GSH-Px的活力,降低MDA含量,升高肝臟中肝糖原含量,這與姚樂輝[27]在評估化橘紅抗疲勞活性和龔頻等[28]研究魔芋多糖抗疲勞作用時得到的結(jié)果相似,表明黑參多糖可能是通過提高機(jī)體的抗氧化酶活性起到抗疲勞作用。
機(jī)體疲勞受損會在機(jī)體內(nèi)會釋放一些炎癥因子,加劇炎癥反應(yīng)。而TNF-α、IL-1β作為重要的促炎因子,在加劇慢性炎癥惡性循環(huán)的同時,對維持和延續(xù)炎癥反應(yīng)起到重要作用[29-31],而運(yùn)動造成的疲勞損傷同樣會誘導(dǎo)肝臟組織中的促炎因子IL-1β和TNF-α水平升高[32]。在本研究中,采用Western blotting分析方法,進(jìn)一步測定黑參多糖對促炎因子IL-1β和TNF-α的影響。如圖6所示,與NS-cont組相比,游泳對照組中IL-1β、TNF-α的表達(dá)量明顯升高,導(dǎo)致小鼠炎癥反應(yīng)加劇,而經(jīng)各劑量黑參多糖處理后抑制了肝臟中與炎癥反應(yīng)相關(guān)的IL-1β和TNF-α表達(dá)。
PGC-1α是能量代謝途徑中眾多轉(zhuǎn)錄因子的共激活因子和多效調(diào)節(jié)因子,參與到機(jī)體調(diào)節(jié)氧化代謝反應(yīng)過程[33],在能量代謝平衡中起到至關(guān)重要的作用。PPARα是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子核激素受體超家族的成員,主要在脂肪酸代謝水平高的組織中表達(dá),如肝臟、骨骼肌等。同時,PPARα可通過調(diào)控靶基因的表達(dá),提高對脂肪酸的利用,增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力,調(diào)節(jié)機(jī)體許多生理功能包括能量代謝、生長發(fā)育[34]。qPCR分析結(jié)果顯示,黑參多糖各劑量組小鼠骨骼肌中PGC-1α、PPARα mRNA表達(dá)顯著高于游泳對照組,表明黑參多糖可通過上調(diào)與運(yùn)動相關(guān)的能量代謝調(diào)節(jié)因子來改善機(jī)體運(yùn)動能力,發(fā)揮抗疲勞作用。
本研究成功建立一種由肌肉鍛煉引起的疲勞模型,通過喂飼黑參多糖研究其抗疲勞作用,結(jié)果表明黑參多糖可通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)的活力,調(diào)節(jié)因機(jī)體疲勞受損而誘發(fā)的炎癥反應(yīng),同時顯著提高PGC-1α、PPARα的表達(dá)水平發(fā)揮抗疲勞作用。