劉興龍，趙迎春，陳雪艷，佘欣鑫，SADIA Khatoon，姜 穎，解慧勇，蔣白楠，鄭毅男，劉文叢,，丁傳波,

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林省健維天然生物科技有限公司，吉林 臨江 134300；3.參之道（通化）生物科技有限公司，吉林 通化 134001）

人參（Panax ginseng C. A. Meyer）是五加科（Araliaceae）植物人參干燥根及根莖，也是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有補脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智的功效[1]。近年來，人參常被用作促進健康的藥用和功能性食品，市場上也因此出現(xiàn)了一些新的人參深加工品，如紅參、黑參等。黑參為生曬參在高溫條件下反復(fù)蒸制烘干制成?，F(xiàn)代研究表明，黑參的主要活性成分為皂苷[2]，包括多糖、多酚及多種氨基酸等黑參提取物都具有比生曬參、紅參有更強的生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、降血糖、提高免疫、抗炎等[3-5]，而目前對黑參多糖成分抗疲勞的研究鮮見報道。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對疲勞的治療有限，已有學(xué)者研究具有抗疲勞作用的潛在替代品，包括傳統(tǒng)中草藥及預(yù)防疾病和促進健康的藥用或功能性食品[6-7]。本實驗研究了黑參多糖成分對疲勞小鼠機體的改善作用，測定疲勞小鼠血清中相關(guān)生化指標，并對肝臟組織中白細胞介素（interleukin，IL）-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）促炎因子分析，以及肌肉組織中過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（atherosclerosis peroxisome proliferator activated receptory α，PPARα）等相關(guān)基因mRNA表達的相關(guān)性進行研究，評價黑參多糖對疲勞機體的延緩和改善效果，為黑參作為功能性食品和藥品的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

90 只SPF級ICR雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由吉林省長春市億斯實驗動物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）2018-0023。所有實驗程序經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物倫理委員會批準。

黑參樣品購自吉林省琿春市華瑞參業(yè)有限公司，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)鄭毅男教授鑒定為五加科人參新型深加工產(chǎn)品，烘干后粉碎成粉，過60 目篩。

白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、血尿素氮（serum urea nitrogen，SUN）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、肝糖原測定試劑盒南京建成生物公司研究所；UNIQ-10柱式TRIzol總RNA提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；TB Green Premix Ex Taq（2×）（Tli RNaseH Plus）、ROX Reference Dye（50×） TaKaRa（北京）生物技術(shù)公司；抗兔二抗 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AE224電子天平 上海恒平儀器；BGZ-246電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京東南儀誠實驗室設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、冷凍干燥機 瑞士BUCHI公司；酶標儀美國Thermo Electron公司；StepOnePLUS實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀 ABI（美國）有限公司；TG16-WS高速離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；電泳儀、凝膠成像儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 供試藥液的制備

黑參樣品粉碎，精密稱量100.001 5 g，加入5 倍體積的體積分數(shù)70%乙醇溶液，常溫條件下攪抖提取3 h，8 000 r/min離心。去除上清液，取沉淀，加入8 倍體積的水，90 ℃水浴2 h，間歇攪抖，待冷卻后，于8 000 r/min離心45 min。靜置30 min，收集上清液，同時進行濃縮，濃縮液加入3 倍體積的無水乙醇醇沉，靜置過夜。8 000 r/min離心，取沉淀并凍干，得到黑參多糖（black ginseng polysaccharide，BGP）樣品，經(jīng)此方法所提黑參多糖經(jīng)分析計算多糖質(zhì)量分數(shù)為86.4%。

1.3.2 實驗分組

在專業(yè)動物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，疲勞小鼠模型的建立按如下方式操作：90 只ICR小鼠隨機分為9 組：1）無游泳對照組（NS-cont）；2）負重游泳對照組（SW-C，0 mg/kg mb）；3）負重游泳低劑量組（SW-L，50 mg/kg mb）；4）負重游泳中劑量組（SW-M，100 mg/kg mb）；5）負重游泳高劑量組（SW-H，200 mg/kg mb）；6）不負重游泳對照組（SW-cont，0 mg/kg mb）；7）不負重游泳黑參多糖低劑量組（SW-BGP-L，50 mg/kg mb）；8）不負重游泳黑參多糖中劑量組（SW-BGP-M，100 mg/kg mb）；9）不負重游泳黑參多糖高劑量組（SW-BGP-H，200 mg/kg mb）。對照組每天灌胃生理鹽水，給藥組每天按不同劑量灌胃，連續(xù)28 d。所有動物飼養(yǎng)在具備動物飼養(yǎng)標準許可的專業(yè)動物房內(nèi)，在特定的無病原體條件下（控制溫度18～28 ℃，相對濕度30%～80%），每籠飼養(yǎng)4～5 只，并飼喂標準實驗室食品且保證自由飲水喂食。

1.3.3 負重游泳實驗

通過負重游泳實驗，對小鼠進行肌肉疲勞鍛煉，進而測定小鼠力竭游泳時間。而力竭游泳時間是機體抗應(yīng)激、抗疲勞能力的綜合體現(xiàn)，也是衡量機體運動能力的重要體外指標[8-9]。按照給藥劑量灌胃給藥28 d，末次給藥30 min后，在負重游泳組小鼠尾端系上小鼠體質(zhì)量5%的鉛皮，置于（30±2）℃的水箱（水深度為（50±2）cm，以確保小鼠完全進入水中而不觸碰水底）進行游泳鍛煉，自小鼠入水時開始計時，至其沉入水底超過10 s時作為其力竭時間。

1.3.4 臟器指數(shù)及血清生化指標的檢測

按劑量灌胃給藥28 d，末次給藥30 min后，對非負重游泳組小鼠在安靜狀態(tài)下斷尾取血，用血乳酸儀測定其BLA含量，立即止血，置于同1.3.3節(jié)水箱中游泳30 min，立即吹干并休息10 min后測定其游泳后BLA含量。之后將所有小鼠用異氟烷麻醉以進行采血，血樣靜置15 min然后4 ℃、4 000 r/min離心10 min，分取血清，按照試劑盒說明書方法測定生化指標。然后處死取骨骼肌，液氮保存?zhèn)溆?；同時收集小鼠肝臟、脾和腎，生理鹽水洗去血漬，濾紙吸干稱質(zhì)量，并按照下式計算各臟器指數(shù)。將分取的肝臟用錫紙保存于-80 ℃，用于勻漿制備、蛋白質(zhì)印跡分析。

1.3.5 逆轉(zhuǎn)錄qPCR

稱取小鼠骨骼肌50 mg，置于經(jīng)過高壓滅菌的研缽中，加入液氮進行充分研磨；將研磨好的粉末分取放入1.5 mL離心管中，靜置5 min，加入1 mL的裂解液裂解1 min，再按照提取總RNA試劑盒提取組織中RNA；分取1 μL總RNA加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，合成cDNA模版，并以此為模版利用TB Green Premix Ex Taq（2×）試劑盒進行擴增。qPCR所使用的引物序列如表1，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，退火溫度為55 ℃、30 s，40 個循環(huán)。

表 1 引物序列Table 1 Sequence sequences of primers used in this study

1.3.6 免疫印跡分析

小鼠肝IL-1β、TNF-α蛋白表達水平采用Western blot法測定。稱取部分肝組織，加入蛋白裂解液，勻漿離心，提取總蛋白，并通過蛋白質(zhì)試劑盒測定濃度。蛋白質(zhì)通過質(zhì)量分數(shù)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離，并隨后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（poly(vinylidene fluoride)，PVDF）膜。將PVDF膜在質(zhì)量分數(shù)5%脫脂牛奶中封閉60 min，在4 ℃下一抗孵育過夜，再于二抗中室溫孵育60 min。β-肌動蛋白被用作內(nèi)標，檢測炎癥蛋白因子IL-1β、TNF-α在肝臟中的表達。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析對各組數(shù)據(jù)的差異性進行比較，P＜0.05表示差異顯著，所得數(shù)據(jù)以 ±s表示。結(jié)果數(shù)據(jù)圖表用GraphPad Prism 6.0軟件制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑參多糖對小鼠力竭游泳時間的影響

圖 1 黑參多糖對小鼠負重游泳時間的影響Fig. 1 Effect of BGP on exhaustive swimming time of mice

如圖1所示，3 個劑量組的小鼠負重游泳時間比SM-C的游泳時間極顯著延長，低、中、高劑量組分別延長6.61%、34.92%、8.14%。結(jié)果表明，黑參多糖增強了小鼠的強迫游泳能力，說明黑參多糖具有抗疲勞作用。

2.2 黑參多糖對小鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響

表 2 黑參多糖對小鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響Table 2 Effect of BGP on body mass and organ indices in mice

如表2所示，對小鼠的體質(zhì)量及臟器指數(shù)進行測定。與對照組小鼠相比，黑參多糖中劑量組和高劑量組小鼠體質(zhì)量略有下降，但各給藥組小鼠肝臟、腎臟和脾臟指數(shù)并無顯著差異。結(jié)果表明，在增強小鼠肌肉方面會有部分改善，而對小鼠的臟器并不會造成損傷，并可能形成保護作用。

2.3 黑參多糖對小鼠血清生化指標的影響

圖 2 黑參多糖對小鼠血清中BUN（A）、BLA（B）及IL-6（C）水平的影響Fig. 2 Effect of BGP on the levels of BUN (A), BLA (B) and IL-6 (C) in mice

如圖2A、B所示，與空白對照組相比，強制游泳組小鼠血清中BUN和BLA水平顯著升高，表明通過強制游泳引起的小鼠機體疲勞模型建立成功。然而，通過黑參多糖處理的低、中、高劑量組小鼠血清中BLA和BUN水平極顯著下降（P＜0.01），高劑量組（200 mg/kg）具有更好的效果。如圖2C所示，在強迫游泳的小鼠中，與NS-cont組相比，SW-cont組IL-6水平極顯著增加，而經(jīng)黑參多糖處理后各給藥組抑制了機體血清IL-6水平的升高。這些結(jié)果表明，黑參多糖顯著減少了BUN、BLA因運動疲勞在血清中的堆積，同時又能顯著抑制血清中IL-6水平的升高，因而起到抗疲勞作用。

2.4 黑參多糖對小鼠肝臟中相關(guān)生化指標的影響

圖 3 黑參多糖對小鼠肝臟中MDA（A）、SOD（B）、GSH-Px（C）及肝糖原（D）水平的影響Fig. 3 Effect of BGP on the levels of MDA (A), SOD (B), GSH-Px (C)and glycogen (D) in liver tissues of mice

圖3A顯示了與NS-cont組相比，SW-cont組小鼠肝臟中MDA水平極顯著升高（P＜0.01），而黑參多糖給藥組能夠極顯著降低因運動疲勞引起的小鼠肝臟中MDA水平（P＜0.01）。如圖3C所示，強制游泳的小鼠肝臟中GSH-Px含量與空白組相比略有升高但并無顯著區(qū)別，只有100、200 mg/kg高劑量組處理后有顯著提高（P＜0.05）。圖3B、D則顯示了經(jīng)黑參多糖處理可極顯著提高小鼠運動疲勞后體內(nèi)肝糖原水平（P＜0.01），升高肝臟中SOD的活性。

這些結(jié)果表明，黑參多糖可明顯降低小鼠因運動疲勞導(dǎo)致的肝部脂質(zhì)過氧化水平，加速清除自由基能力，同時又能增強機體肝糖原的儲備，提高運動耐力而緩解機體疲勞。

2.5 黑參多糖對骨骼肌中PGC-1α、PPARα基因表達的影響

2.5.1 提取總RNA的檢測

圖 4 骨骼肌組織總RNA質(zhì)量檢測Fig. 4 Quality detection of total RNA extracted from skeletal muscle tissues

表 3 各組總RNA A260 nm/A280 nm比值Table 3 A260 nm/A280 nm ratio of total RNA in each group

如圖4所示，從疲勞小鼠骨骼肌中提取的總RNA在18S、28S具有清晰的條帶，并且A260nm/A280nm比值均在2.00～2.10之間，如表3所示，證明運用此方法提取的骨骼肌中總RNA具有較高的純度和完整性。

2.5.2 qPCR分析結(jié)果

圖 5 小鼠運動后骨骼肌中PGC-1α（A）、PPARα（B）基因的表達量Fig. 5 Expression of PGC-1α (A) and PPAR-α (B) genes in skeletal muscle of mice after exercise

圖5 A、B顯示了PGC-1α、PPAR-α基因在疲勞小鼠骨骼肌中的表達情況。與SW-cont組相比，黑參多糖各劑量組小鼠骨骼肌中PGC-1α、PPARα基因的表達量相比顯著升高（P＜0.05），表明黑參多糖調(diào)節(jié)與運動相關(guān)的基因，其響應(yīng)于肌肉疲勞而發(fā)生。

2.6 黑參多糖對疲勞小鼠肝臟中IL-1β和TNF-α蛋白表達的影響

圖 6 黑參多糖對疲勞小鼠肝臟中IL-1β、TNF-α蛋白表達的影響Fig. 6 Effect of BGP on IL-1β and TNF-α protein expression in liver of fatigued mice

如圖6所示，疲勞會導(dǎo)致肝臟組織中IL-1β、TNF-α炎癥蛋白表達量極顯著上升（P＜0.01）。而與SW-cont組比較，黑參多糖給藥組可以下調(diào)IL-1β、TNF-α蛋白因子的表達，并具有極顯著差異（P＜0.01）。結(jié)果說明，黑參多糖可以用來改善小鼠機體疲勞是通過減輕疲勞致?lián)p的肝臟組織中炎癥反應(yīng)和提高機體免疫功能而發(fā)揮作用。

3 討 論

目前，隨著生活節(jié)奏的加快，工作和生活的壓力不斷加劇。因此，機體疲勞是常見的，甚至影響了人們的日常生活。一般認為，疲勞是連續(xù)工作或運動后效率下降的復(fù)雜現(xiàn)象，可分為精神疲勞和身體疲勞[10]。疲勞是一種生理性改變，主要表現(xiàn)為代謝產(chǎn)物積累而引起的肌肉張力和運動耐力降低[11-12]。由于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段對于諸如疲勞等一些輕度功能障礙還難以治愈，尤其是目前對于體內(nèi)分子機制的認識還是有限的，人們逐漸關(guān)注功能性食品或傳統(tǒng)藥材潛在替代品，對這些替代物進行生物醫(yī)學(xué)研究，以期解決這些復(fù)雜機體問題并促進健康狀況。圖1的結(jié)果顯示，黑參多糖顯著延長了小鼠力竭游泳時間（P＜0.05），其中以SW-M組效果最佳，比SM-C游泳對照組延長了34.92%，表明其具有強效的抗疲勞作用。

通常來講，運動會引起機體疲勞，加劇血乳酸在體內(nèi)的堆積，積聚越多，疲勞程度就越嚴重。圖2的結(jié)果顯示，與NS-cont組相比，運動后血清中BLA含量顯著升高（P＜0.01），黑參多糖處理后會顯著減少運動中BLA的生成，達到緩解機體疲勞的效果。血清中BUN一般用來評價機體代謝能力和承受負荷能力的指標。研究結(jié)果表明，與SW-cont組相比，黑參多糖可以極顯著降低小鼠血清中BUN含量（P＜0.01），表明黑參多糖可以減少疲勞機體內(nèi)蛋白質(zhì)的分解，提高機體運動負荷能力。而運動導(dǎo)致疲勞機體損傷同樣會引發(fā)炎癥反應(yīng)并產(chǎn)生促炎因子IL-6，其是促炎細胞因子和肌肉疲勞的生物標志物[12]。由于IL-6水平在肌肉疲勞反應(yīng)中增加[13-14]，并且刺激對創(chuàng)傷或組織損傷的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致肌肉炎癥。研究結(jié)果表明，運動后各劑量組IL-6水平均極顯著高于NS-cont組（P＜0.01），但與SW-cont組相比，經(jīng)黑參多糖處理后又可防止肌肉疲勞介導(dǎo)的血清IL-6水平升高，表明黑參多糖可通過調(diào)節(jié)IL-6水平預(yù)防肌肉功能障礙或損傷達到抗疲勞作用目的。

肝臟組織中SOD作為生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，是生物體防御體系重要的抗氧化物酶[15-17]，也是衡量機體自由基代謝的敏感指標；體內(nèi)SOD活性維持一定水平，可反映機體過氧化程度，同時保護機體組織細胞免受損傷[17-21]。GSH-Px是體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑，還能特異性催化谷胱甘肽對過氧化氫的還原反應(yīng)，起到保護細胞膜的作用[22-25]。隨著運動時間的延長，機體血糖水平下降會加劇機體疲勞，為維持正常功能，機體會過度分解儲存在肝臟中的糖原轉(zhuǎn)化成能量。所以，增加肝糖原儲備，是保持血糖濃度穩(wěn)定、延緩機體疲勞和維持正常生命體征的重要方式之一[26]。本研究結(jié)果顯示，黑參多糖各劑量組可提高SOD和GSH-Px的活力，降低MDA含量，升高肝臟中肝糖原含量，這與姚樂輝[27]在評估化橘紅抗疲勞活性和龔頻等[28]研究魔芋多糖抗疲勞作用時得到的結(jié)果相似，表明黑參多糖可能是通過提高機體的抗氧化酶活性起到抗疲勞作用。

機體疲勞受損會在機體內(nèi)會釋放一些炎癥因子，加劇炎癥反應(yīng)。而TNF-α、IL-1β作為重要的促炎因子，在加劇慢性炎癥惡性循環(huán)的同時，對維持和延續(xù)炎癥反應(yīng)起到重要作用[29-31]，而運動造成的疲勞損傷同樣會誘導(dǎo)肝臟組織中的促炎因子IL-1β和TNF-α水平升高[32]。在本研究中，采用Western blotting分析方法，進一步測定黑參多糖對促炎因子IL-1β和TNF-α的影響。如圖6所示，與NS-cont組相比，游泳對照組中IL-1β、TNF-α的表達量明顯升高，導(dǎo)致小鼠炎癥反應(yīng)加劇，而經(jīng)各劑量黑參多糖處理后抑制了肝臟中與炎癥反應(yīng)相關(guān)的IL-1β和TNF-α表達。

PGC-1α是能量代謝途徑中眾多轉(zhuǎn)錄因子的共激活因子和多效調(diào)節(jié)因子，參與到機體調(diào)節(jié)氧化代謝反應(yīng)過程[33]，在能量代謝平衡中起到至關(guān)重要的作用。PPARα是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子核激素受體超家族的成員，主要在脂肪酸代謝水平高的組織中表達，如肝臟、骨骼肌等。同時，PPARα可通過調(diào)控靶基因的表達，提高對脂肪酸的利用，增強機體抗氧化能力，調(diào)節(jié)機體許多生理功能包括能量代謝、生長發(fā)育[34]。qPCR分析結(jié)果顯示，黑參多糖各劑量組小鼠骨骼肌中PGC-1α、PPARα mRNA表達顯著高于游泳對照組，表明黑參多糖可通過上調(diào)與運動相關(guān)的能量代謝調(diào)節(jié)因子來改善機體運動能力，發(fā)揮抗疲勞作用。

本研究成功建立一種由肌肉鍛煉引起的疲勞模型，通過喂飼黑參多糖研究其抗疲勞作用，結(jié)果表明黑參多糖可通過增強機體抗氧化酶系統(tǒng)的活力，調(diào)節(jié)因機體疲勞受損而誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，同時顯著提高PGC-1α、PPARα的表達水平發(fā)揮抗疲勞作用。