楊忠敏，王祖文，黃先智，丁曉雯,

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心，重慶 400716；2.西南大學(xué)科技處，重慶 400716）

生物大分子主要包括脂質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)等，是構(gòu)成生命的基礎(chǔ)物質(zhì)，與生命活動息息相關(guān)[1]。自由基是機(jī)體在正常代謝過程中產(chǎn)生的具有高度活性及強(qiáng)氧化性的活性氧簇和活性氮簇。在正常情況下自由基的產(chǎn)生及清除處于動態(tài)平衡，若某些原因?qū)е虑宄淠芰ο陆祷虍a(chǎn)生增加，打破抗氧化防御機(jī)制平衡狀態(tài)，機(jī)體就會發(fā)生氧化應(yīng)激[2]。氧化應(yīng)激狀態(tài)下自由基會攻擊機(jī)體內(nèi)的生物大分子，使之發(fā)生氧化變性、交聯(lián)和斷裂，進(jìn)而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，可能會導(dǎo)致癌癥、心血管疾病、腦功能紊亂等疾病的發(fā)生或發(fā)展[3-4]。而抗氧化劑能中和自由基，清除氧化劑或防止氧化劑轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘愿鼜?qiáng)的化合物，減緩或抑制細(xì)胞損傷，從而達(dá)到抗氧化作用[5]。因此，尋找能阻止生物大分子氧化損傷的有效抗氧化劑，對維護(hù)機(jī)體健康及預(yù)防控制相關(guān)疾病的發(fā)生或發(fā)展具有重要意義。

桑葉中生物堿類化合物是糖環(huán)上的氧原子被氮原子取代的一系列多羥基生物堿，以1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）為代表，為高效的糖苷酶抑制劑，能顯著抑制餐后血糖濃度的上升，具有抗病毒、降糖、降脂等多種生物活性[6-7]。已有研究表明，DNJ能顯著降低羅非魚與糖尿病小鼠血清中丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量[8-9]。本實驗室前期的研究表明，桑葉生物堿粗提液可以有效降低高脂飲食小鼠MDA水平，顯著提高抗氧化酶活力[10]。目前桑葉生物堿對生物大分子氧化應(yīng)激作用影響的研究主要集中在改善脂質(zhì)氧化方面，而其對DNA、蛋白質(zhì)氧化損傷的影響在國內(nèi)外鮮有相關(guān)報道。因此，本研究以D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）誘導(dǎo)昆明種小鼠建立氧化應(yīng)激模型，以目前常用的抗氧化藥物還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）作為陽性對照，通過比較評價各組小鼠基本生理指標(biāo)，脂質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)氧化損傷和抗氧化指標(biāo)的變化，探討桑葉生物堿對氧化應(yīng)激小鼠生物大分子氧化損傷的作用及機(jī)理，以期為桑葉生物堿抗氧化功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性昆明種小鼠60 只（體質(zhì)量18～20 g），4 周齡，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心（生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2018-0003）?；A(chǔ)飼料，購于重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

桑葉粉末 重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院；D-Gal（純度≥99%）、GSH（純度≥98%） 上海阿拉丁有限公司；8-異前列腺素F2α（8-iso-prostaglandin F2α，8-iso-PGF2α）、蛋白羰基（protein carbonyl，PCO）、晚期蛋白氧化產(chǎn)物（advanced oxidation protein products，AOPP）、3-硝基絡(luò)氨酸（3-nitrotyrosine，3-NT）、8-羥基鳥嘌呤（8-hydroxy-2’-desoxyguanosine，8-OH-dG）、5-羥基胞嘧啶（5-hydroxy-2’-deoxycotosine，5-OH-dC）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、金屬硫蛋白（metallothionein，MT）、硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）、總抗氧化能力（total antioxidant capability，TAC）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 廈門慧嘉生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。其他試劑均國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Symergy H1酶標(biāo)儀 基因有限公司；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；811DK高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；KQ5200DB超聲波清洗儀昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葉生物堿制備

稱取桑葉粉，按料液比1∶30（m/V），于60 ℃、功率800 W條件下超聲處理60 min，重復(fù)提取2 次，合并濾液，減壓濃縮；將濃縮液以2.1 BV/h流速過D101大孔樹脂；再將過D101的純化液以2.5 BV/h流速過732型陽離子樹脂，先用蒸餾水洗至中性，再用0.5 mol/L氨水洗以2 倍柱體積洗脫得到氨水洗脫液；再將氨水洗脫液以2.1 BV/h流速過AB-8大孔樹脂，真空冷凍干燥得樣品[11-12]。采用硅鎢酸沉淀法測的本實驗所制桑葉生物堿中總生物堿的含量為93.57%。

1.3.2 桑葉生物堿改善氧化損傷的作用研究

1.3.2.1 小鼠飼養(yǎng)條件

小鼠按照西南大學(xué)實驗動物保護(hù)和使用規(guī)則飼養(yǎng)，室溫（21±2）℃，相對濕度40%～60%，整個實驗期間室內(nèi)通風(fēng)條件良好，12 h明暗交替（9∶00～21∶00），所有小鼠均喂飼普通飼料，自由覓食、飲水。

1.3.2.2 D-Gal誘導(dǎo)小鼠氧化應(yīng)激模型的建立

60 只雄性SPF級昆明種小鼠，適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)7 d后。隨機(jī)分出10 只小鼠為正常對照組，腹腔注射與造模試劑等體積的生理鹽水；其余小鼠腹腔注射D-Gal（1 000 mg/kg mb），連續(xù)注射20 d后，頜下采血，測定造模組、正常對照組小鼠血清中MDA、SOD水平是否存在顯著性差異，若存在顯著性差異即判斷小鼠造模成功，用于后期實驗。

1.3.2.3 分組與給藥

保留10 只正常對照組小鼠，另挑造模成功小鼠50 只，隨機(jī)均分為模型對照組、陽性藥物組（灌胃200 mg/kg mbGSH）以及低、中、高劑量組（分別灌胃50、100、200 mg/kg mb桑葉生物堿，桑葉生物堿劑量根據(jù)前期預(yù)實驗所確定）。實驗期間，小鼠每天稱體質(zhì)量1 次，并根據(jù)體質(zhì)量變化按照0.1 mL/10 g mb每天灌胃1 次，連續(xù)4 周。

1.3.2.4 血漿樣本采集

4 周實驗結(jié)束后，各實驗組小鼠禁食不禁水12 h，摘取小鼠眼球取血，用肝素鈉采血管收集血液，于4 ℃、3 000 r/min離心15 min，即為血漿，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.5 相關(guān)指標(biāo)測定

小鼠每天稱體質(zhì)量1 次，根據(jù)體質(zhì)量以調(diào)整給藥量。實驗期4 周，每隔2 d稱量小鼠的攝食量。按照下式計算食物利用率。

式中：Δm為同期內(nèi)體質(zhì)量的增量/g；m為同期內(nèi)的攝食量/g。

血漿中8-iso-PGF2α、PCO、AOPP、3-NT、8-OH-dG、5-OH-dC的水平，抗氧化酶系統(tǒng)中SOD、GSH-Px活力，非酶抗氧化系統(tǒng)中非酶抗氧化劑MT、Trx含量及TAC的檢測，均按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，用單因素方差分析及多重比較進(jìn)行顯著性差異分析，實驗結(jié)果以±s表示，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉生物堿對小鼠體質(zhì)量、攝食量和食物利用率的影響

小鼠體質(zhì)量的增長情況是反映其生長發(fā)育是否正常的重要指標(biāo)之一，攝食量和食物利用率是影響小鼠體質(zhì)量變化的關(guān)鍵因素。

由圖1A、B可知，在整個實驗期間，各組小鼠體質(zhì)量、攝食量均呈現(xiàn)增加趨勢。在造模成功時（0 周），與正常對照組相比，其余5 組體質(zhì)量、攝食量與其均存在極顯著性差異（P＜0.01），造模組之間小鼠體質(zhì)量、攝食量均無顯著性差異（P＞0.05），表明氧化應(yīng)激會使小鼠體質(zhì)量、攝食量下降。4 周實驗結(jié)束時，模型對照組體質(zhì)量、攝食量較正常對照組減少23.37%、25.30%（P＜0.01），陽性藥物組以及桑葉生物堿中、高劑量組體質(zhì)量是模型對照組的1.71、1.12、1.16 倍（P＜0.05），攝食量是模型對照組的1.25、1.18、1.22 倍（P＜0.05）。結(jié)果表明，桑葉生物堿通過增加小鼠攝食量來有效緩解小鼠體質(zhì)量減輕癥狀。

由圖1C可知，與正常對照組相比，模型對照組小鼠食物利用率下降了44.15%（P＜0.01）。陽性藥物組、桑葉生物堿中、高劑量組分別是模型對照組的1.52、1.45、1.50 倍（P＜0.05）。結(jié)果表明，桑葉生物堿調(diào)節(jié)小鼠食物利用率情況與其體質(zhì)量變化一致。

圖 1 桑葉生物堿對D-Gal誘導(dǎo)小鼠體質(zhì)量（A）、攝食量（B）和食物利用率（C）的影響（n＝10）Fig. 1 Effect of mulberry leaf alkaloids on body mass (A), food intake (B)and food utilization (C) in mice with D-Gal-induced injury (n = 10)

2.2 桑葉生物堿對小鼠生物大分子氧化損傷的影響

2.2.1 桑葉生物堿對小鼠脂質(zhì)氧化損傷的影響

表 1 桑葉生物堿對D-Gal誘導(dǎo)小鼠血漿中8-iso-PGF2α的影響（n＝10）Table 1 Effect of mulberry leaf alkaloids on 8-iso- PGF2α level in plasma of mice with D-Gal-induced injury (n= 10)

8-iso-PGF2α廣泛存在于體液和各種組織中，其合成和釋放持續(xù)穩(wěn)定，含量不受飲食中脂質(zhì)和藥物等因素影響，被認(rèn)為是測定體內(nèi)脂質(zhì)過氧化及氧化應(yīng)激的金指標(biāo)和評價抗氧化療效的最理想的生化指標(biāo)[13-14]。

由表1可知，與正常對照組相比，模型對照組8-iso-PGF2α水平極顯著增加了626.80%（P＜0.01），表明模型對照組小鼠發(fā)生脂質(zhì)氧化損傷。與模型對照組相比，桑葉生物堿低、中劑量組8-iso-PGF2α水平分別顯著減少了23.08%、49.31%；陽性藥物組、桑葉生物堿高劑量組分別極顯著減少了85.06%、83.46%（P＜0.01）。結(jié)果表明，實驗劑量范圍內(nèi)，桑葉生物堿對小鼠8-iso-PGF2α水平有明顯下調(diào)作用，高劑量恢復(fù)至與正常對照組無顯著差異的水平（P＞0.05）。

2.2.2 桑葉生物堿對小鼠蛋白氧化損傷的影響

蛋白質(zhì)是一類重要的生物大分子，是各種自由基攻擊的重要目標(biāo)之一。PCO的生成是蛋白質(zhì)被自由基氧化修飾的重要標(biāo)記，這一特征具有普遍性，因而PCO水平可以判斷蛋白質(zhì)是否氧化損傷[15-16]。Witko-Sarsat等[17]研究表明，AOPP是從中性粒細(xì)胞骨髓過氧化物酶來源的氯氧化劑次氯酸作用于蛋白質(zhì)而形成的蛋白交聯(lián)產(chǎn)物，是蛋白質(zhì)被氧化的特異性標(biāo)志之一。機(jī)體發(fā)生硝化應(yīng)激反應(yīng)時，過氧亞硝基會使得蛋白的絡(luò)氨酸殘基發(fā)生硝化反應(yīng)而產(chǎn)生特異性的3-NT，檢測其在體液中的表達(dá)水平可以反映過氧亞硝基介導(dǎo)的蛋白氧化損傷[18]。

表 2 桑葉生物堿對D-Gal誘導(dǎo)小鼠血漿PCO、AOPP、3-NT水平的影響（n＝10）Table 2 Effect of mulberry leaf alkaloids on PCO, AOPP and 3-NT levels in plasma of mice with D-Gal-induced injury (n= 10)

由表2可知，與正常組對照組相比，模型對照組小鼠PCO、AOPP、3-NT水平分別極顯著增加了55.69%、175.72%、189.21%（P＜0.01），表明模型對照組小鼠蛋白發(fā)生了氧化損傷，其有害產(chǎn)物水平增加。與模型對照組相比，陽性藥物組及桑葉生物堿低、中、高劑量組均下調(diào)了小鼠PCO、AOPP、3-NT水平，陽性藥物組較模型組分別極顯著減少了35.60%、62.43%、64.83%（P＜0.01），桑葉生物堿高劑量組較模型組分別極顯著減少了35.43%、61.70%、63.65%（P＜0.01）。結(jié)果表明，桑葉生物堿明顯改善小鼠的蛋白氧化損傷，且高劑量組恢復(fù)至與正常對照組無顯著性差異的水平（P＞0.05）。

2.2.3 桑葉生物堿對小鼠DNA氧化損傷的影響

研究表明，DNA氧化損傷的主要產(chǎn)物是8-OH-dG、5-OH-dC。在DNA的堿基中，鳥嘌呤的分子軌道具有較高的能級，其8位碳原子容易被氧化損傷而生成修飾堿基8-OH-dG[19]。8-OH-dG的化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，其可作為外源或內(nèi)源因素對DNA氧化損傷的較靈敏和穩(wěn)定指標(biāo)[20]。Wagner等[21]采用酶水解小牛胸腺DNA和反相高效液相色譜-電化學(xué)檢測法技術(shù)證實5-OH-dC是一類DNA氧化損傷的重要產(chǎn)物。因此，測定這兩個指標(biāo)能較好地反映DNA氧化損傷的情況。

表 3 桑葉生物堿對D-Gal誘導(dǎo)小鼠血漿中8-OH-dG、5-OH-dC質(zhì)量濃度的影響（n＝10）Table 3 Effect of mulberry leaf alkaloids on 8-OH-dG and 5-OH-dC contents in plasma of mice with D-Gal-induced injury (n= 10)

由表3可知，與正常對照組相比，模型對照組小鼠8-OH-dG、5-OH-dC含量分別極顯著增加了212.09%、181.85%（P＜0.01），表明模型組小鼠發(fā)生了DNA氧化損傷。與模型對照組相比，陽性藥物組以及桑葉生物堿低、中、高劑量組均下調(diào)了小鼠8-OH-dG、5-OH-dC水平，陽性藥物組較模型組分別極顯著減少了67.47%、63.18%（P＜0.01），桑葉生物堿高劑量組較模型組分別極顯著減少了65.02%、57.90%（P＜0.01）。結(jié)果表明，桑葉生物堿明顯改善小鼠的DNA氧化損傷，且高劑量組恢復(fù)至與正常對照組無顯著性差異的水平（P＞0.05）。

2.3 桑葉生物堿對小鼠血漿TAC的影響

單獨(dú)測定機(jī)體中的某一抗氧化成分含量往往不能全面反映機(jī)體的抗氧化能力，因而采用TAC來評價機(jī)體的總抗氧化能力。

圖 2 桑葉生物堿對D-Gal誘導(dǎo)小鼠血漿TAC的影響（n＝10）Fig. 2 Effect of mulberry leaf alkaloids on plasma TAC in mice with D-Gal-induced injury (n = 10)

由圖2可知，與正常對照組相比，模型對照組小鼠TAC極顯著下降了42.03%（P＜0.01）。與模型對照組相比，陽性藥物組、桑葉生物堿3 個劑量組均能使小鼠TAC增加；陽性藥物組、桑葉生物堿高劑量組TAC分別是模型對照組的1.71、1.63 倍（P＜0.01），結(jié)果表明，桑葉生物堿能有效恢復(fù)氧化應(yīng)激小鼠的總抗氧化能力，且高劑量組恢復(fù)到與正常對照組無顯著性差異的水平（P＞0.05）。

2.4 桑葉生物堿改善小鼠生物大分子氧化損傷的作用機(jī)理

2.4.1 桑葉生物堿對小鼠血漿抗氧化酶的影響

SOD是廣泛存在于動植物體內(nèi)的酸性金屬酶，其作用是清除機(jī)體過剩自由基、抑制脂質(zhì)氧化等，被譽(yù)為機(jī)體的“清道夫”[22]。GSH-Px能催化過氧化物與GSH反應(yīng)，能有效清除氧自由基，防止氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而有效阻斷活性氧自由基對機(jī)體的進(jìn)一步損傷，保護(hù)細(xì)胞膜以及一些生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能，是生物體內(nèi)重要的活性氧清除劑之一。

圖 3 桑葉生物堿對D-Gal誘導(dǎo)小鼠血漿T-SOD（A）、GSH-Px（B）活力的影響（n＝10）Fig. 3 Effect of mulberry leaf alkaloids on T-SOD (A) and GSH-Px (B)activity in plasma of mice with D-Gal-induced injury (n = 10)

由圖3可知，與正常對照組相比，模型對照組小鼠T-SOD、GSH-Px分別極顯著下降了33.65%、66.87%（P＜0.01）。與模型對照組相比，陽性藥物組、桑葉生物堿3 個劑量組均能上調(diào)小鼠T-SOD、GSH-Px活力；陽性藥物組T-SOD、GSH-Px分別是模型對照組的1.51（P＜0.05）、3.00 倍（P＜0.01），桑葉生物堿高劑量組是模型對照組的1.47（P＜0.05）、2.96 倍（P＜0.01）。結(jié)果表明，桑葉生物堿能有效使模型小鼠T-SOD、GSH-Px活力增加，高劑量組能恢復(fù)至與正常對照組無顯著性差異的水平（P＞0.05）。

2.4.2 桑葉生物堿對小鼠血漿非酶抗氧化劑的影響

MT是一類廣泛存在機(jī)體內(nèi)具有獨(dú)特生物學(xué)功能的金屬硫蛋白，其可以通過結(jié)合和釋放金屬離子來調(diào)節(jié)機(jī)體自由基水平[23]。研究表明，MT清除自由基的能力是谷胱甘肽的25 倍，是SOD的10 000 倍，被稱為機(jī)體最佳抗氧化劑[24]。Trx是構(gòu)成硫氧還蛋白系統(tǒng)的重要組成成分，其能與過氧化物還原酶發(fā)生交互作用來清除機(jī)體的活性氧，從而發(fā)揮抗氧化作用，維持細(xì)胞的氧化還原平衡環(huán)境[25]。桑葉生物堿對小鼠血漿中非酶抗氧化劑MT、Trx含量的影響結(jié)果如圖4所示。

圖 4 桑葉生物堿對D-Gal誘導(dǎo)小鼠血漿MT（A）、Trx（B）質(zhì)量濃度的影響（n＝10）Fig. 4 Effect of mulberry leaf alkaloids on MT (A) and Trx (B)contents in plasma of mice with D-Gal-induced injury (n = 10)

由圖4可知，與正常對照組相比，模型對照組小鼠MT、Trx分別極顯著下降了41.37%、26.56%（P＜0.01）。與模型對照組相比，陽性藥物組、桑葉生物堿3 個劑量組均能使小鼠MT、Trx質(zhì)量濃度增加；陽性藥物組MT、Trx分別是模型對照組的1.71、1.37 倍（P＜0.05），桑葉生物堿高劑量組是模型對照組的1.74、1.37 倍（P＜0.05）。結(jié)果表明，桑葉生物堿能有效使模型小鼠非酶抗氧化劑MT、Trx質(zhì)量濃度增加，且高劑量組恢復(fù)到與正常對照組無顯著性差異的水平（P＞0.05）。

3 討 論

生物堿是桑葉中重要的活性成分之一，具有較好的抗氧化潛力[26]。實驗動物注射外源性的D-Gal后，機(jī)體會產(chǎn)生大量活性氧自由基，造成組織器官的氧化應(yīng)激損傷，是目前公認(rèn)的建立動物衰老的模型方法[27]。本研究采用D-Gal對小鼠進(jìn)行造模，灌胃不同劑量（50、100、200 mg/kg mb）的桑葉生物堿。在本研究的實驗劑量與時間范圍內(nèi)，結(jié)果顯示3 個水平的劑量組間呈現(xiàn)J型關(guān)系，而更高劑量是否會產(chǎn)生有害的作用，還需要進(jìn)一步研究。

D-Gal造模后致小鼠血漿MDA、SOD水平顯著下降，表明造模成功。體質(zhì)量是動物實驗中的一個非特異性觀察指標(biāo)，其反映動物機(jī)體的綜合代謝和機(jī)能，進(jìn)而能夠評價動物的生長情況。本研究中，造模成功時，模型對照組小鼠與正常對照組小鼠體質(zhì)量存在極顯著差異（P＜0.01），與文獻(xiàn)[28]報道一致。4 周治療結(jié)束后，桑葉生物堿高劑量組與正常組不存在顯著性差異（P＞0.05）。實驗中小鼠攝食量、食物利用率的變化與體質(zhì)量相一致。

機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的發(fā)生通常是以自由基代謝產(chǎn)物如脂質(zhì)過氧化物8-iso-PGF2α；蛋白質(zhì)過氧化物PCO、AOPP、3-NT；DNA氧化產(chǎn)物8-OH-dG、5-OH-dC等物質(zhì)的含量水平作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。MDA是研究的最早且最為明確的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，但已有研究表明8-iso-F2α比MDA能更好反映機(jī)體氧化應(yīng)激程度[29]。8-iso-F2α是自由基攻擊細(xì)胞膜脂質(zhì)花生四烯酸，使其發(fā)生脂質(zhì)過氧化后而形成的前列腺素衍生物，作為臨床氧化應(yīng)激的標(biāo)準(zhǔn)物[13]。本研究發(fā)現(xiàn)桑葉生物堿高劑量組極顯著降低小鼠血漿8-iso-F2α含量，表明桑葉生物堿對脂質(zhì)過氧化的有較好改善作用，與文獻(xiàn)[10]報道一致。蛋白質(zhì)是組成細(xì)胞的基本物質(zhì)，參與機(jī)體脂類、礦物質(zhì)等的轉(zhuǎn)運(yùn)，其氧化對機(jī)體的生理狀態(tài)具有重要影響。機(jī)體內(nèi)PCO主要是通過金屬離子介導(dǎo)氧化系統(tǒng)完成[30]；此外羥基直接作用于肽鏈，使得蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)被破壞，進(jìn)而在肽鏈的斷裂處也能形成PCO[31]。李竹青[32]研究表明AOPP會加劇機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體中蛋白質(zhì)或氨基酸發(fā)生硝化反應(yīng)時，則會嚴(yán)重影響代謝酶活性的調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，3-NT是硝基化反應(yīng)重要產(chǎn)物[33]。張月等[34]體外研究表明辣椒堿對不同自由基引發(fā)的蛋白羰基化修飾與硝化修飾均有顯著的抑制作用。本研究結(jié)果顯示，桑葉生物堿高劑量組均能顯著降低小鼠PCO、AOPP、3-NT水平（P＜0.01），表明桑葉生物堿能有效改善機(jī)體內(nèi)蛋白氧化損傷。同張月等[34]的研究對比，生物堿類化合物不僅在體外對蛋白質(zhì)大分子的氧化損傷具有改善作用，本研究還進(jìn)一步證實其在機(jī)體內(nèi)也能發(fā)揮有效的活性功能。自由基會引起DNA的氧化與交聯(lián)，使其發(fā)生變性，導(dǎo)致DNA突變，進(jìn)而影響其信息傳遞功能以及轉(zhuǎn)錄復(fù)制的特性，使機(jī)體蛋白質(zhì)的合成能力下降，同時也會引起多種酶的減少或失活[35]。Ullah等[36]研究發(fā)現(xiàn)咖啡因可以通過減少8-OH-dG降低機(jī)體氧化應(yīng)激。本研究結(jié)果也顯示，桑葉生物堿顯著降低DNA氧化產(chǎn)物8-OH-dG、5-OH-dC含量，表明桑葉生物堿能與其他生物堿類化合物一樣對機(jī)體DNA氧化損傷具有改善作用。

研究表明，血漿中的TAC是機(jī)體酶促與非酶促抗氧化能力的綜合表現(xiàn)，其TAC越高，機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)能力越強(qiáng)，當(dāng)TAC降低時，機(jī)體的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方向改變從而使機(jī)體發(fā)生早期防御反應(yīng)[37]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑葉生物堿能極顯著增加小鼠TAC（P＜0.01），表明桑葉生物堿能增強(qiáng)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)防御能力。

機(jī)體自身有一套復(fù)雜且完整由酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)構(gòu)成的抗氧化防御系統(tǒng)，酶系統(tǒng)主要包括SOD、GSH-Px等抗氧化酶類，非酶系統(tǒng)主要包括MT、Trx等抗氧化物質(zhì)。研究表明，SOD、GSH-Px能清除機(jī)體過量自由基，緩減機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，在維持細(xì)胞的氧化與抗氧化平衡的過程中扮演著重要的角色[38]。在機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)下，這兩種酶的活性逐漸降低，與此一致的是本研究中，模型組小鼠中SOD、GSH-Px活力亦是極顯著降低。經(jīng)桑葉生物堿干預(yù)后，小鼠機(jī)體內(nèi)這兩種酶的活性都明顯提高，且隨桑葉生物堿的劑量的增加而增加，高劑量組恢復(fù)到正常水平。非酶抗氧化劑能清除機(jī)體自由基的低分子質(zhì)量物質(zhì)，不同的抗氧化劑都具有特異性，在機(jī)體中清除自由基的作用不能相互代替，但相互間可協(xié)同作用，是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)中不可缺少部分[39]。本研究結(jié)果顯示，桑葉生物堿能顯著增加模型小鼠血漿中MT、Trx含量（P＜0.05）。這些研究結(jié)果綜合表明提高機(jī)體抗氧化酶SOD、GSH-Px的催化活性、非酶抗氧化劑MT、Trx的水平與桑葉生物堿在模型組小鼠體內(nèi)對氧化應(yīng)激的拮抗作用是密切相關(guān)的。

綜上所述，在實驗劑量與時間范圍內(nèi)，桑葉生物堿能顯著改善D-Gal誘導(dǎo)小鼠脂質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)的氧化損傷，具有較好的抗氧化作用，其作用機(jī)理可能與其顯著增加機(jī)體抗氧化酶活力和非酶抗氧化劑含量，使機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)能力增強(qiáng)有關(guān)，但其具體作用機(jī)理還需進(jìn)一步深入探討。