時(shí) 佳，劉宛寧，付 余，趙新淮,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

酪蛋白是含量最多的乳蛋白成分，并且是食品工業(yè)廣泛應(yīng)用的蛋白質(zhì)配料。近20 年來(lái)，為進(jìn)一步提高酪蛋白的應(yīng)用效果，科研人員通過(guò)物理、化學(xué)或生物等不同途徑修飾酪蛋白結(jié)構(gòu)、改進(jìn)其功能性質(zhì)，糖基化是其中修飾技術(shù)之一。美拉德反應(yīng)是蛋白質(zhì)（提供氨基）和還原糖（提供羰基）之間的反應(yīng)，可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化。研究發(fā)現(xiàn)，利用美拉德反應(yīng)和蘑菇β-葡聚糖對(duì)燕麥分離蛋白進(jìn)行糖基化修飾，修飾后燕麥分離蛋白的溶解性、乳化性和熱穩(wěn)定性得到改善[1]。葡聚糖和乳清分離蛋白經(jīng)美拉德反應(yīng)糖基化后，蛋白質(zhì)分子間相互作用降低，在較大pH值范圍內(nèi)和較高濃度下有較好的溶解性和熱穩(wěn)定性[2]。利用美拉德反應(yīng)分別和葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、核糖糖基化得到糖基化β-乳球蛋白，其乳化和起泡性質(zhì)均得到改善，并且這些性質(zhì)的改善程度與糖種類有關(guān)[3]。蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)的某些生物活性也有影響。例如，葡萄糖糖基化的豌豆7S球蛋白有更低的抗體親和性和較低的Caco-2單層細(xì)胞毒性[4]；乳糖糖基化的酪蛋白具有較低的免疫活性[5]。作為重要的營(yíng)養(yǎng)素之一，蛋白質(zhì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體的免疫狀況有直接影響，可以促進(jìn)免疫器官發(fā)育、淋巴細(xì)胞增殖，以及降低遲發(fā)性過(guò)敏反應(yīng)[6–8]。然而，在免疫低下小鼠模型中，美拉德糖基化反應(yīng)對(duì)酪蛋白消化物的免疫增強(qiáng)作用是否有影響的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。

環(huán)磷酰胺是一種細(xì)胞毒性化療藥物，屬于烷化劑類免疫抑制劑，因此常被用于建立免疫低下動(dòng)物模型[9–10]。本研究利用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫低下小鼠模型，確定糖基化酪蛋白消化物對(duì)免疫低下小鼠免疫狀況的改善作用，并與酪蛋白消化物對(duì)比，以揭示酪蛋白美拉德糖基化反應(yīng)對(duì)其消化物免疫活性的潛在影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雌性BALB/c小鼠（6～8 周齡；生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001，使用許可證號(hào)SYXK（黑）2016-007）和飼料 北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；小鼠淋巴瘤YAC-1細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)則執(zhí)行。

酪蛋白、乳糖、環(huán)磷酰胺和刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA） 美國(guó)Sigma公司；磷酸鹽緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶（120 000 U/g） 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；臺(tái)盼藍(lán) 美國(guó)Amresco公司；RPMI-1640培養(yǎng)基 美國(guó)HyClone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）加拿大Wisent公司；半乳糖測(cè)試盒 美國(guó)BioAssay Systems公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒 日本Dojindo公司；鼠免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）（IgM、IgA、IgG）檢測(cè)試劑盒 南京建成生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

DELTA 320型精密pH計(jì)、AL204型電子分析天平梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；HF-90型CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)力康公司；Model 680型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳糖糖基化酪蛋白消化物的制備

取一定量乳糖均勻分散于60 g/L酪蛋白溶液中，使乳糖和酪蛋白質(zhì)量比為1.6∶1，調(diào)整酪蛋白終質(zhì)量濃度為50 g/L、溶液pH 6.8。將反應(yīng)物于沸水?。?00 ℃）中反應(yīng)3 h，然后將樣品在冰浴中迅速冷卻至室溫。調(diào)整溶液pH值至4.5，4 000×g離心10 min，收集沉淀，pH 4.5下水洗2 遍，所得沉淀用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7，冷凍干燥后粉碎得到糖基化酪蛋白（乳糖含量（13.2±0.4）g/kg pro）。

質(zhì)量濃度為50 g/L、pH 7.0的酪蛋白溶液和糖基化酪蛋白溶液中分別加入胰蛋白酶（7 000 U/g pro），37 ℃水解4 h，沸水浴滅酶5 min，快速冷卻至20 ℃，再用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)整pH值至7.0，冷凍干燥粉碎后得到酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物（乳糖含量（10.6±0.3）g/kg pro）。

1.3.2 化學(xué)指標(biāo)測(cè)定

蛋白含量：用凱氏定氮法測(cè)定樣品含氮量，轉(zhuǎn)換因子為6.38。

乳糖含量：按照文獻(xiàn)[11]方法測(cè)定乳糖含量。稱取一定量樣品于安瓿瓶，加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，100 ℃水解4 h，冷卻至20 ℃，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)整pH值至7.0，用半乳糖測(cè)試盒測(cè)定水解液半乳糖濃度，然后換算為樣品中的乳糖含量。

1.3.3 小鼠分組及模型建立

雌性BALB/c小鼠80 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，分為8 組：正常組、模型組、6 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組10 只。正常組小鼠每天灌胃生理鹽水28 d；模型組小鼠灌胃80 mg/kg mb環(huán)磷酰胺3 d后，再灌胃生理鹽水25 d；實(shí)驗(yàn)組小鼠先灌胃80 mg/kg mb環(huán)磷酰胺3 d，再分別給予100、200、400 mg/kg mb的酪蛋白消化物或糖基化酪蛋白消化物25 d。

1.3.4 血清生化指標(biāo)和Ig質(zhì)量濃度測(cè)定

小鼠最后1 次灌胃24 h后，稱體質(zhì)量，眼球采血。血液樣品于2 000×g離心10 min，用Beckman DXC 800自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清生化指標(biāo)。按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書操作測(cè)定血清IgM、IgA、IgG質(zhì)量濃度。

1.3.5 脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)測(cè)定

小鼠眼球取血后，脫頸處死，剖取脾臟和胸腺，濾紙吸取表面殘留血液及多余水分，分別稱濕質(zhì)量。脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)分別按式（1）、（2）計(jì)算。

1.3.6 脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

無(wú)菌條件下將各組小鼠剖腹，取脾臟，剪成小塊，置于200 目不銹鋼網(wǎng)篩，篩網(wǎng)中央浸沒(méi)于盛有Hank’s液的平皿中。無(wú)菌注射器芯研磨脾臟組織，用Hank’s液吹洗掉網(wǎng)篩上的剩余組織，收集脾臟組織懸液于無(wú)菌離心管，199×g離心5 min，棄去上清液。用3 mL紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，靜置3 min，199×g離心5 min，棄去上清液；RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)計(jì)算細(xì)胞數(shù)，活細(xì)胞數(shù)不少于95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL。

將脾細(xì)胞懸液接種于96 孔板（200 μL/孔），同時(shí)每孔加20 μL ConA（終質(zhì)量濃度5 μg/mL），置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。每孔加20 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，利用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度。以不添加脾細(xì)胞添加RPMI-1640培養(yǎng)液作空白孔。脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)按式（3）[12]計(jì)算。

1.3.7 NK細(xì)胞活力分析

將YAC-1細(xì)胞（靶細(xì)胞）用RPMI培養(yǎng)液（含10% FBS）調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL。將脾細(xì)胞懸液（5×105個(gè)/mL）和YAC-1細(xì)胞懸液（1×104個(gè)/mL）各100 μL/孔接種于96 孔板，同時(shí)設(shè)定效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞孔。細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h后，每孔加15 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度值。自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞活力按式（4）[13]計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行Duncan’s多重比較，確定各組間數(shù)據(jù)的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 2 種酪蛋白消化物對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響

表 1 酪蛋白消化物及糖基化酪蛋白消化物對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響Table 1 Effect of glycated casein digest and casein digest on serum biochemical indices of mice

動(dòng)物的血清生化指標(biāo)常用于反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康與生理狀況。已有研究表明，膳食咖啡酸通過(guò)影響血清生化指標(biāo)，調(diào)控機(jī)體免疫功能[14]。飼料中添加β-伴大豆球蛋白可影響幼鯉生長(zhǎng)以及其血清生化指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)幼鯉免疫狀態(tài)改善[15]。本研究中2 種酪蛋白消化物對(duì)小鼠17 項(xiàng)生化指標(biāo)的影響如表1所示。與正常組小鼠相比，模型組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)水平均顯著降低（P＜0.05），表明環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠產(chǎn)生不良影響。與模型組小鼠相比，糖基化酪蛋白消化物組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)水平均顯著增加（P＜0.05），表明糖基化酪蛋白消化物可改善小鼠生理狀況。然而，與酪蛋白消化物相比，糖基化酪蛋白消化物對(duì)小鼠生理狀況的改善程度要低一些。糖基化酪蛋白消化物的活性低于酪蛋白消化物，這可能與酪蛋白的糖基化反應(yīng)有關(guān)。美拉德反應(yīng)破壞了蛋白質(zhì)中賴氨酸等必需氨基酸[16]，因此導(dǎo)致糖基化酪蛋白消化物在免疫低下小鼠中活性降低。

血清總蛋白（total protein，TP）主要由血清球蛋白（globulin，GLO）和血清白蛋白（albumin，ALB）構(gòu)成。TP含量高，則動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)狀況良好[17]。谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine amiotransferase，ALT）是檢測(cè)肝功能的重要指標(biāo)。血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）為蛋白質(zhì)代謝后產(chǎn)物，是反映動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝和氨基酸平衡狀況的指標(biāo)[18]。對(duì)于5 項(xiàng)重要生化指標(biāo)（TP、ALB、GLO質(zhì)量濃度，ALT活力及BUN濃度），與模型組小鼠相比，酪蛋白消化物組小鼠5 項(xiàng)指標(biāo)分別從45.8、26.7、18.9 g/L，36 U/L及2.4 mmol/L增加到59.4～67.1、34.1～37.7、24.1～31.6 g/L，40～61 U/L及3.0～3.3 mmol/L，而糖基化酪蛋白消化物處理組小鼠5 項(xiàng)指標(biāo)分別增加到58.5～66.9、33.2～36.4、23.8～27.3 g/L，37～58 U/L及2.9～3.2 mmol/L。這些數(shù)據(jù)表明，酪蛋白消化物比糖基化酪蛋白消化物具有更好的免疫提升效率。

2.2 2 種酪蛋白消化物對(duì)血清中Ig分泌的影響

圖 1 酪蛋白和糖基化酪蛋白消化物對(duì)小鼠血清IgM（A）、IgA（B）和IgG（C）分泌的影響Fig. 1 Effects of glycated casein digest and casein digest on serum IgM (A), IgA (B), and IgG (C) levels of mice

Ig是機(jī)體主要的免疫分子，其含量高低直接反映動(dòng)物機(jī)體免疫應(yīng)答能力[19]。已有研究結(jié)果表明，大豆低聚糖可以增強(qiáng)小鼠IgM、IgA和IgG分泌[20]。酪蛋白肽通過(guò)促進(jìn)Ig產(chǎn)生和免疫分子分泌，調(diào)控機(jī)體的免疫功能[21]。由圖1可知，與正常組小鼠比較，模型組小鼠血清IgM、IgA和IgG質(zhì)量濃度分別從806.4、724.7 μg/mL和13.9 mg/mL降低至726.9、654.1 μg/mL和11.3 mg/mL，表明環(huán)磷酰胺導(dǎo)致小鼠免疫低下。與模型組小鼠比較，酪蛋白消化物組小鼠血清IgM、IgA和IgG質(zhì)量濃度分別增加至821.9～947.9、721.8～927.4 μg/mL和13.1～16.4 mg/mL，而糖基化酪蛋白消化物組小鼠血清IgM、IgA和IgG質(zhì)量濃度分別增加至799.4～937.7、699.7～885.3 μg/mL和12.4～16.0 mg/mL。在同一劑量水平下，酪蛋白消化物顯示出比糖基化酪蛋白消化物更強(qiáng)的提升效果，證明糖基化反應(yīng)降低了酪蛋白消化物提升Ig分泌的能力。Shi Jia等發(fā)現(xiàn)酪蛋白與乳糖的糖基化反應(yīng)降低了酪蛋白消化物的免疫活性[5]；藺海鑫等發(fā)現(xiàn)原肌球蛋白與核糖的糖基化反應(yīng)也降低了其免疫活性[22]；Shi Jia等研究結(jié)果表明，酪蛋白與乳糖的美拉德反應(yīng)減弱了酪蛋白消化物對(duì)丙烯酰胺誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞屏障損傷的保護(hù)作用[23]。

2.3 2 種酪蛋白消化物對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

脾臟是動(dòng)物的外周免疫器官，產(chǎn)生淋巴細(xì)胞，參與體液和細(xì)胞免疫。胸腺是動(dòng)物的一級(jí)免疫器官，對(duì)T細(xì)胞成熟和分化起作用[24]。因此，脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)直接反映機(jī)體免疫狀況。研究表明，毛豆腐提取物可以增加脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，提高動(dòng)物免疫狀況[25]。來(lái)源于κ-酪蛋白的糖巨肽具有免疫抑制活性，雞蛋卵清蛋白源糖肽具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功能[26-27]。甘薯糖蛋白可顯著提高小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，脾淋巴小節(jié)增多增大，胸腺T細(xì)胞線粒體數(shù)量增多，表明甘薯糖蛋白具有明顯的增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用[28]。

圖 2 酪蛋白和糖基化酪蛋白消化物對(duì)小鼠脾臟指數(shù)（A）和胸腺指數(shù)（B）的影響Fig. 2 Effects of glycated casein digest and casein digest on spleen (A)and thymus (B) indices of mice

由圖2可知，與正常組小鼠比較，模型組小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)均顯著降低（P＜0.05），表明環(huán)磷酰胺影響小鼠免疫器官的發(fā)育。與模型組小鼠比較，給予酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物后，小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著增加（P＜0.05），且呈劑量依賴效應(yīng)。酪蛋白消化物導(dǎo)致小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)分別增加至3.24～4.26 mg/g和1.32～1.58 mg/g，而糖基化酪蛋白消化物僅分別增加至3.06～3.89 mg/g和1.26～1.48 mg/g。同一劑量水平下，酪蛋白消化物對(duì)小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的提升作用強(qiáng)于糖基化酪蛋白消化物，證明糖基化反應(yīng)不利于酪蛋白消化物改善小鼠脾臟和胸腺的生長(zhǎng)發(fā)育狀況。

2.4 糖基化酪蛋白消化物對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖和NK細(xì)胞活力的影響

脾淋巴細(xì)胞是體內(nèi)免疫細(xì)胞之一，其增殖和分化是機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程的一個(gè)重要階段。因此，淋巴細(xì)胞增殖水平評(píng)估是研究細(xì)胞免疫的常用方法[29]。NK細(xì)胞是重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，在體內(nèi)抗腫瘤非特異性免疫中發(fā)揮重要作用[30]。已有研究結(jié)果表明，乳蛋白肽可以促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、提高NK細(xì)胞活力[21,31]。胃蛋白酶水解鯉魚卵蛋白后，其水解物顯著提高了脾淋巴細(xì)胞增殖作用和NK細(xì)胞活力[32]。大豆糖肽對(duì)ConA誘導(dǎo)的脾細(xì)胞有增殖抑制作用，而對(duì)正常生長(zhǎng)的脾細(xì)胞有增殖促進(jìn)作用[33]。由圖3可知，與正常組小鼠相比，模型組小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)和NK細(xì)胞活力均顯著下降（P＜0.05），而2 種消化物以劑量依賴方式促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和增強(qiáng)NK細(xì)胞活力。與模型組小鼠相比，酪蛋白消化物處理24 h和48 h后，小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)分別從0.951和0.974增加至1.154～1.342和1.184～1.472，NK細(xì)胞活力分別從30.8%和32.2%增加至35.8%～48.8%和46.1%～61.4%；糖基化酪蛋白消化物處理24 h和48 h后，小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)分別增加至1.147～1.316和1.176～1.379，NK細(xì)胞活力分別增加至33.1%～45.7%和41.5%～58.3%。整體上看，糖基化酪蛋白消化物刺激小鼠脾細(xì)胞的能力仍然低于酪蛋白消化物，再次證明糖基化反應(yīng)降低了酪蛋白消化物提升小鼠免疫細(xì)胞活性的作用。

圖 3 酪蛋白和糖基化酪蛋白消化物對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)和NK細(xì)胞活力的影響Fig. 3 Effects of glycated casein digest and casein digest on lymphocyte proliferation index and NK cell activity of mice

3 結(jié) 論

采用環(huán)磷酰胺處理后，小鼠免疫功能顯著下降，與正常組小鼠相比，模型組小鼠17 項(xiàng)血清生化指標(biāo)水平顯著降低，同時(shí)3 種血清Ig質(zhì)量濃度、脾臟、胸腺、脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)、NK細(xì)胞活力等其他重要免疫指標(biāo)也顯著降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，免疫低下模型小鼠給予酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物后，小鼠免疫狀況均得到改善，各項(xiàng)免疫指標(biāo)水平增加，提示兩種消化物均具有提升免疫作用。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，酪蛋白消化物具有比糖基化酪蛋白消化物更好的免疫提升效率，酪蛋白經(jīng)美拉德糖基化反應(yīng)導(dǎo)致其消化物的免疫活性降低，從而揭示蛋白質(zhì)美拉德糖基化反應(yīng)的潛在不利作用?？紤]到蛋白質(zhì)的美拉德糖基化反應(yīng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)氨基酸被破壞和免疫活性降低，因此，控制乳制品加工處理過(guò)程中的美拉德反應(yīng)具有必要性。