趙衛(wèi)松，郭慶港，李社增，王培培，鹿秀云，蘇振賀，張曉云，馬平

（河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071000）

0 引言

【研究意義】棉花黃萎?。╟otton verticillium wilt）是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）侵染引起的真菌性維管束病害，一般造成棉花減產(chǎn)5%—10%，嚴(yán)重的高達(dá)20%—30%，甚至絕收[1]。該病在我國(guó)主要產(chǎn)棉區(qū)均有不同程度的發(fā)生，是導(dǎo)致棉花減產(chǎn)和纖維品質(zhì)下降的主要土傳病害[2-3]。利用抗病品種是防治黃萎病的有效途徑之一。土壤微生物之間具有群體動(dòng)態(tài)效應(yīng)和復(fù)雜的群落結(jié)構(gòu)，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和抗病性之間存在著十分密切的關(guān)系，同時(shí)研究表明作物土傳病害的發(fā)生與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[4-5]。通過(guò)研究不同抗病性品種土壤微生物多樣性，揭示棉花品種抗病性與土壤微生物的相互關(guān)系，可為棉花黃萎病的生物防治和生態(tài)防治提供理論依據(jù)，同時(shí)對(duì)指導(dǎo)其他土傳病害的防治也具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，有關(guān)棉花對(duì)黃萎病抗病的研究主要集中在組織結(jié)構(gòu)[6]、生理生化（毒素、可溶性糖、酶、激素）[7]、抗病基因[8]等方面，而關(guān)于土壤微生物在抗黃萎病中的作用研究相對(duì)較少。微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性是維持土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和可持續(xù)的重要保障，是影響土壤微生態(tài)環(huán)境中生理活性最重要的因子[9-10]。研究表明，植物病害的發(fā)生與植物內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，且植物不同生育時(shí)期的根際微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異并與品種抗病性存在十分密切的關(guān)系[11-13]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，棉花抗/感品種產(chǎn)生的根系分泌物種類(lèi)及濃度存在差異，導(dǎo)致根際微生物種類(lèi)和數(shù)量不同[14]。進(jìn)一步研究表明，根系分泌物并不局限于對(duì)根際微生物的影響，可能對(duì)整個(gè)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物環(huán)境造成影響[15-17]。土壤養(yǎng)分也顯著影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)[18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鄂荊1號(hào)和冀863品種對(duì)黃萎病具有不同的抗性，這種抗性除了自身抗病基因外，是否與抗/感品種外界環(huán)境土壤微生物有關(guān)，以及抗/感品種間土壤微生物是否存在多樣性和種群結(jié)構(gòu)的差異，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。在國(guó)家實(shí)施“化肥、農(nóng)藥雙減”的背景下，針對(duì)目前棉花黃萎病防治困難以及關(guān)于棉花抗/感品種在發(fā)病時(shí)期（主要為花鈴期）不同階段土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成變化及其與黃萎病的相互關(guān)系尚缺乏系統(tǒng)的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以棉花抗/感黃萎病品種為研究材料，通過(guò)高通量測(cè)序（Illumina MiSeq）技術(shù)研究抗/感品種在花鈴期不同階段的土壤細(xì)菌群落組成變化，分析細(xì)菌群落組成與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系，探討細(xì)菌群落組成和品種抗病性的關(guān)系，以期為棉花黃萎病的綠色防控提供新途徑和新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)域概況

河北省曲周縣位于冀南平原，是我國(guó)五大商品棉主要生產(chǎn)基地，年平均氣溫13.1℃，無(wú)霜期平均為210 d，平均降水量為556.2 mm，70%的降水集中在6—9月。棉花是當(dāng)?shù)刂饕姆N植作物[19]。試驗(yàn)在曲周縣槐橋鄉(xiāng)西漳頭村銀絮專(zhuān)業(yè)合作社開(kāi)展。

1.2 試驗(yàn)材料

供試棉花品種鄂荊1號(hào)（感黃萎病品種，EJ）和冀863（抗黃萎病品種，J863）均為晚熟品種，分別由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所和曲周縣銀絮專(zhuān)業(yè)合作社提供。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與土壤樣品采集

2018年4月20日播種棉花，每個(gè)處理3次重復(fù)，每小區(qū)面積為45 m2（長(zhǎng)60 m，寬0.75 m），行距0.75 m，株距0.35 m，為了避免土壤環(huán)境因素導(dǎo)致的誤差，不同品種種植采用小區(qū)間隔排列。在棉花生長(zhǎng)期間，按照當(dāng)?shù)厣a(chǎn)技術(shù)進(jìn)行肥水和蟲(chóng)草害管理。分別在盛花期（7月19日）、開(kāi)花后期（8月22日）和結(jié)鈴期（9月3日），按照“W”形采用多點(diǎn)取樣法，用取土器在棉花行間距離棉花根部10 cm采集0—20 cm耕作層的土壤，每小區(qū)采集約500 g土壤混勻裝于自封袋中，一部分于-80℃冰箱保存，用于后續(xù)土壤微生物群落分析，一部分用于土壤理化性質(zhì)分析。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 黃萎病調(diào)查 在黃萎病發(fā)生時(shí)期（黃河流域主要從7月中旬至9月上旬），按照李社增等[20]分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)于盛花期、開(kāi)花后期和結(jié)鈴期分別調(diào)查不同品種的發(fā)病率和病情指數(shù)，分別用EJ-7、EJ-8、EJ-9和J863-7、J863-8、J863-9表示，并按照如下公式計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。病情調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)如下，0級(jí)：棉株健康，無(wú)病葉，生長(zhǎng)正常；1級(jí)：棉株1/4以下葉片發(fā)病，變黃萎蔫；2級(jí)：棉株1/4以上，1/2以下葉片發(fā)病，變黃萎蔫；3級(jí)：棉株1/2以上，3/4以下葉片發(fā)病，變黃萎蔫；4級(jí)：棉株3/4以上葉片發(fā)病，或葉片全部脫落，棉株枯死。

發(fā)病率（%）=（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100；

病情指數(shù)（DI）=∑（相應(yīng)病級(jí)×各級(jí)病株數(shù)）/（最高病級(jí)×總株數(shù)）×100。

1.4.2 土壤細(xì)菌群落高通量測(cè)序 土壤基因組DNA的提取按照FastDNATMSPIN Kit for Soil（MP Biomedicals，Solon，OH，USA）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，DNA的純度和濃度由NanoDrop 2000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA）進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)采用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[21]進(jìn) 行 擴(kuò)增，通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收。文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.4.3 土壤中大麗輪枝菌ITS基因拷貝數(shù)量的測(cè)定在盛花期、開(kāi)花后期和結(jié)鈴期，按照1.3方法采集耕作層土壤，提取DNA，將其作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：2×Master Mix（德國(guó)DBI Bioscience公司）10 μL，大麗輪枝菌ITS上下游引物[22]（F：CCCGCCGGTCCATCAGTCTCTCTG；R：CGGGACTCCGATGCGAGCTGTAAC）各1 μL，DNA 1 μL，ROX 0.4 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火并延伸30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，得到不同時(shí)間樣本的循環(huán)閾值（Ct），根據(jù)趙衛(wèi)松等[23]前期建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算土壤中大麗輪枝菌ITS基因的拷貝數(shù)量。

1.4.4 土壤理化性質(zhì)測(cè)定 采用酸度計(jì)對(duì)土壤pH進(jìn)行測(cè)定[24]；采用KCl浸提-靛酚藍(lán)比色法分別對(duì)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮進(jìn)行測(cè)定[24-25]；采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法對(duì)速效磷進(jìn)行測(cè)定[24]；以硫酸亞鐵為標(biāo)準(zhǔn)溶液采用分光光度法按照土壤有機(jī)質(zhì)含量測(cè)定說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行測(cè)定[24]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行整理，Origin 8.6進(jìn)行作圖，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)和鄧肯新復(fù)極差法（DMRT）多重比較統(tǒng)計(jì)分析。采用Canoco 4.5軟件對(duì)樣本微生物群落進(jìn)行主成分分析（PCA）和冗余分析（RDA），并利用CanoDraw軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 花鈴期不同階段土壤理化性質(zhì)測(cè)定

棉花抗/感品種在花鈴期不同階段對(duì)土壤理化性質(zhì)存在不同程度的影響。除了土壤中無(wú)機(jī)磷含量外，感病品種EJ土壤的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、pH、速效磷和有機(jī)質(zhì)在盛花期均高于抗病品種J863。由盛花期至結(jié)鈴期，銨態(tài)氮和速效磷含量呈現(xiàn)先顯著下降后上升的趨勢(shì)，硝態(tài)氮和有機(jī)質(zhì)含量呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)，pH在感病品種中變化幅度較大且存在差異，而在抗病品種中差異不顯著，無(wú)機(jī)磷含量均呈現(xiàn)先顯著上升后下降的趨勢(shì)。其中，硝態(tài)氮和無(wú)機(jī)磷含量下降幅度較大，在感病品種EJ和抗病品種J863土壤中硝態(tài)氮含量分別由66.28、45.77 mg·kg-1降至2.70、7.31 mg·kg-1，無(wú)機(jī)磷含量分別由252.37、277.60 μg·g-1降至89.69、100.95 μg·g-1（表1）。

2.2 棉花抗/感品種黃萎病發(fā)生調(diào)查

在棉花盛花期、開(kāi)花后期和結(jié)鈴期調(diào)查抗/感品種黃萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)，由圖1可知，感病品種EJ發(fā)病率在不同時(shí)期均顯著高于抗病品種J863；而病情指數(shù)僅在開(kāi)花后期和結(jié)鈴期顯著高于抗病品種J863。

2.3 棉花抗/感品種土壤中大麗輪枝菌的數(shù)量

由圖2可見(jiàn)，感病品種EJ在開(kāi)花后期和結(jié)鈴期土壤中大麗輪枝菌ITS拷貝數(shù)量顯著高于盛花期，分別提高了8.19%和8.38%；對(duì)于抗病品種J863，在開(kāi)花后期和結(jié)鈴期土壤中病原菌ITS拷貝數(shù)量顯著低于盛花期，且分別降低了6.03%和8.86%；除了在盛花期外，抗病品種土壤中的大麗輪枝菌ITS拷貝數(shù)均低于感病品種。

2.4 土壤細(xì)菌多樣性分析

F檢驗(yàn)結(jié)果表明（表2），EJ和J863在盛花期和開(kāi)花后期土壤細(xì)菌的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)顯著高于結(jié)鈴期，而Shannon和Simpson指數(shù)在花鈴期不同階段差異不顯著；J863在盛花期和結(jié)鈴期的細(xì)菌豐富度Chao1和ACE指數(shù)均高于EJ，而均勻度Shannon和Simpson指數(shù)在花鈴期不同階段差異不顯著。

表1 土壤理化性質(zhì)測(cè)定Table 1 Detection of soil physicochemical properties

圖1 棉花抗/感品種的黃萎病發(fā)生調(diào)查Fig.1 Investigation of verticillium wilt in cotton resistant/susceptible varieties

表2 棉花抗/感品種在花鈴期不同階段的細(xì)菌測(cè)序量和群落多樣性Table 2 Bacterial sequencing and community diversity of cotton resistant/susceptible varieties at different flowering and boll stages

圖2 花鈴期不同階段棉花抗/感品種土壤中大麗輪枝菌ITS拷貝數(shù)量Fig.2 ITS gene copy number of V.dahliae in soil of cotton resistant/susceptible varieties at different flowering and boll stages

2.5 棉花抗/感品種細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較

抗/感品種樣本的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主成分分析表明（圖3），所有樣品在主成分坐標(biāo)中位于不同的象限，說(shuō)明抗/感品種在不同時(shí)期土壤樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，門(mén)水平下第一主成分（PCA1）和第二主成分（PCA2）分別可以解釋所有變量的59.5%和31.0%，2個(gè)主成分方差累積貢獻(xiàn)率達(dá)到90.5%，說(shuō)明其能夠表征微生物群落組成的特征，感病品種EJ位于第三、四象限，抗病品種J863位于第一、二象限；屬水平下第一主成分（PCA1）和第二主成分（PCA2）分別可以解釋所有變量的60.6%和19.3%，2個(gè)主成分方差累積貢獻(xiàn)率達(dá)到79.9%，說(shuō)明其能夠表征微生物群落組成的特征，EJ位于第二、三限，J863位于第一、四象限，同一個(gè)橢圓代表品種在不同時(shí)期的微生物群落組成，品種之間不存在交叉重疊，說(shuō)明抗/感品種的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。

圖3 棉花抗/感品種在門(mén)（A）和屬（B）水平下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of soil bacterial community structure of cotton resistant/susceptible varieties at phylum (A) and genus (B) levels

門(mén)水平下抗/感品種土壤細(xì)菌群落組成的研究結(jié)果表明（圖4），感病品種EJ和抗病品種J863在盛花期（EJ-7/J863-7）、開(kāi)花后期（EJ-8/J863-8）和結(jié)鈴期（EJ-9/J863-9）獲得的前15個(gè)豐度較高的菌群分別為變形菌門(mén)（Proteobacteria）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、Rokubacteria、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）、Latescibacteria、Patescibacteria、裝甲菌門(mén)（Armatimonadetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和Entotheonellaeota，其相對(duì)豐度分別介于29.97%—34.66%、14.77%—20.97%、12.17%—20.37%、10.17%—12.87%、6.97%—8.69%、2.78%—4.04%、2.28%—3.72%、1.83%—2.49%、1.14%—1.64%、0.75%—0.95%、0.38%—1.23%、0.27%—0.69%、0.09%—0.22%、0.11%—0.20%和0.07%—0.18%。其中感病品種EJ的部分菌群平均相對(duì)豐度低于抗病品種J863，如放線(xiàn)菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、硝化螺菌門(mén)、Patescibacteria和裝甲菌門(mén)，平均降低幅度分別為16.38%、4.05%、2.25%、6.58%、7.10%、20.60%和35.78%。

差異顯著性分析表明，在結(jié)鈴期，抗病品種土壤的變形菌門(mén)菌群的相對(duì)豐度顯著下降；在盛花期和開(kāi)花后期，抗/感品種間差異不顯著。由盛花期至結(jié)鈴期，感病品種土壤的酸桿菌門(mén)和芽單胞菌門(mén)的相對(duì)豐度呈顯著下降趨勢(shì)，而抗病品種表現(xiàn)為顯著上升，且抗病品種顯著高于感病品種。由盛花期至結(jié)鈴期，感病品種土壤的放線(xiàn)菌門(mén)、綠彎菌門(mén)和Patescibacteria菌群的相對(duì)豐度分別表現(xiàn)為顯著上升，而抗病品種表現(xiàn)為顯著下降，其中在盛花期，感病品種土壤的放線(xiàn)菌門(mén)菌群相對(duì)豐度顯著低于抗病品種，在結(jié)鈴期品種間差異不顯著；在盛花期，感病品種土壤的綠彎菌門(mén)菌群的相對(duì)豐度顯著低于抗病品種，而在開(kāi)花后期和結(jié)鈴期顯著高于抗病品種。由盛花期至結(jié)鈴期，感病品種土壤的Rokubacteria菌群的相對(duì)豐度表現(xiàn)為顯著下降，而抗病品種差異不顯著。在不同生育時(shí)期，擬桿菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、硝化螺菌門(mén)、疣微菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和Entotheonellaeota菌群的相對(duì)豐度變化抗/感品種間差異均不顯著。

屬水平下抗/感品種菌群的相對(duì)豐度研究結(jié)果表明（圖5），感病品種EJ和抗病品種J863在盛花期（EJ-7/J863-7）、開(kāi)花后期（EJ-8/J863-8）和結(jié)鈴期（EJ-9/J863-9）獲得的前20個(gè)豐度較高的菌群分別為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、溶桿菌屬（Lysobacter）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、Haliangium、硝化螺菌屬（Nitrospira）、Bryobacter、Iamia、Dongia、Pseudarthrobacter、芽球菌屬（Blastococcus）、Luedemannella、紅色桿菌屬（Rubrobacter）、Gaiella、類(lèi)諾卡氏屬（Nocardioides）、Pontibacter、Ilumatobacter、鏈霉菌屬（Streptomyces）、Gemmatirosa、微單孢菌屬（Micromonospora）和Solirubrobacter，其相對(duì)豐度分別介于12.84%—26.80%、5.79%—16.78%、6.07%—10.14%、4.41%—11.38%、6.18%—9.02%、4.71%—8.30%、2.00%—6.45%、3.13%—5.16%、2.81%—4.96%、2.25%—5.51%、2.14%—3.95%、2.01%—5.08%、1.87%—5.16%、1.23%—5.97%、1.19%—4.41%、2.03%—3.67%、0.70%—3.47%、1.13%—3.04%、0.87%—3.82%和0.71%—2.32%。其中，感病品種EJ的平均相對(duì)豐度低于抗病品種J863的菌群包括鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、Bryobacter、Iamia、Pseudarthrobacter、芽球菌屬、紅色桿菌屬、類(lèi)諾卡氏屬、Pontibacter、鏈霉菌屬、Gemmatirosa、微單孢菌屬和Solirubrobacter，與抗病品種J863相比，上述菌群平均相對(duì)豐度下降幅度分別為5.09%、19.41%、13.79%、2.36%、10.78%、34.47%、46.76%、61.84%、52.75%、48.61%、74.79%、9.13%和26.42%。

圖4 棉花抗/感品種在門(mén)水平下細(xì)菌群落組成相對(duì)豐度變化（前15個(gè)）Fig.4 Relative abundance of bacterial community composition of cotton resistant/susceptible varieties at phylum level (top 15)

圖5 棉花抗/感品種在屬水平下細(xì)菌群落組成相對(duì)豐度變化（前20個(gè)）Fig.5 Relative abundance of bacterial community composition of cotton resistant/susceptible varieties at genus level (top 20)

差異顯著性分析結(jié)果表明，由盛花期至結(jié)鈴期，感病品種土壤中鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬和Pontibacter菌群的相對(duì)豐度表現(xiàn)為顯著下降，而抗病品種表現(xiàn)為顯著上升；在盛花期，上述菌群的相對(duì)豐度品種間差異不顯著，而在其他時(shí)期抗病品種顯著高于感病品種。感病品種土壤的溶桿菌屬菌群相對(duì)豐度呈顯著下降趨勢(shì)，而抗病品種呈現(xiàn)先顯著上升后下降的趨勢(shì)；在盛花期，感病品種該菌群的相對(duì)豐度高于抗病品種，在其他生育時(shí)期內(nèi)抗/感品種間差異不顯著。由盛花期至結(jié)鈴期，感病品種Haliangium菌群的相對(duì)豐度呈顯著上升趨勢(shì)，而在抗病品種呈顯著下降趨勢(shì)；在結(jié)鈴期，感病品種該菌群的相對(duì)豐度高于抗病品種，其他時(shí)期品種間差異不顯著。在生育期內(nèi)抗/感品種硝化螺菌屬的相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì)但差異不顯著。在結(jié)鈴期，抗病品種土壤Bryobacter和Iamia菌群的相對(duì)豐度顯著高于感病品種，其他時(shí)期品種間差異不顯著。在結(jié)鈴期，感病品種Dongia和Ilumatobacter菌群的相對(duì)豐度顯著高于抗病品種，其他時(shí)期品種間差異不顯著。在生育期內(nèi)，Pseudarthrobacter和Luedemannella的相對(duì)豐度在品種間差異不顯著。在盛花期，抗病品種土壤的芽球菌屬、微單孢菌屬和Solirubrobacter菌群的相對(duì)豐度均顯著高于感病品種，其他時(shí)期品種間差異不顯著。在結(jié)鈴期，紅色桿菌屬的相對(duì)豐度品種間差異不顯著，其他時(shí)期該菌群抗性品種顯著高于感病品種。在生育期內(nèi)，感病品種土壤Gaiella菌群的相對(duì)豐度呈顯著上升趨勢(shì)，而抗病品種差異不顯著，且感病品種高于抗病品種。在結(jié)鈴期，感病品種土壤類(lèi)諾卡氏屬菌群的相對(duì)豐度顯著低于抗病品種，其他時(shí)期差異不顯著。在開(kāi)花后期，鏈霉菌屬的相對(duì)豐度品種間差異不顯著；在盛花期和結(jié)鈴期，抗病品種的相對(duì)豐度顯著高于感病品種。在生育期內(nèi)，抗病品種土壤Gemmatirosa菌群的相對(duì)豐度高于感病品種，且在抗病品種中呈顯著上升趨勢(shì)。

2.6 細(xì)菌屬水平群落組成與土壤理化性質(zhì)的冗余分析（RDA）

屬水平土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析表明（圖 6），優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落對(duì)土壤理化性質(zhì)的響應(yīng)不同。其中，相對(duì)豐度較高的鞘氨醇單胞菌屬和溶桿菌屬與硝態(tài)氮、無(wú)機(jī)磷、pH和有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)，Bryobacter與無(wú)機(jī)磷、pH和有機(jī)質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，芽單胞菌屬與無(wú)機(jī)磷、pH和有機(jī)質(zhì)相關(guān)性不大，Haliangium和硝化螺菌屬與銨態(tài)氮、速效磷呈正相關(guān)，硝化螺菌屬與硝態(tài)氮、無(wú)機(jī)磷、pH和有機(jī)質(zhì)呈負(fù)相關(guān)。

進(jìn)一步研究表明，抗/感品種在花鈴期不同階段的細(xì)菌群落組成與土壤理化性質(zhì)之間存在相關(guān)性。其中，感病品種EJ在盛花期（EJ-7）和開(kāi)花后期（EJ-8）的細(xì)菌群落組成與硝態(tài)氮、無(wú)機(jī)磷、pH和有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)，結(jié)鈴期（EJ-9）與速效磷、銨態(tài)氮呈正相關(guān)；抗病品種J863在盛花期（J863-7）的細(xì)菌群落組成與硝態(tài)氮、無(wú)機(jī)磷、pH和有機(jī)質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，在開(kāi)花后期（J863-8）的細(xì)菌群落組成與硝態(tài)氮、無(wú)機(jī)磷、pH和有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)，在結(jié)鈴期（J863-9）的細(xì)菌群落組成與上述土壤理化指標(biāo)之間相關(guān)性不大。

3 討論

3.1 不同抗性品種對(duì)土壤微生物群落的影響

雷娟利等[26]研究表明，抗枯萎病西瓜品種根際土壤細(xì)菌的均勻度和多樣性均高于感病品種，并且抗病品種的細(xì)菌數(shù)量高于感病品種，而真菌和放線(xiàn)菌數(shù)量在抗/感品種間不存在相關(guān)性；蔡秋華等[27]通過(guò)比較烤煙抗/感青枯病和黑脛病品種的根際土壤微生物變化，發(fā)現(xiàn)抗病品種與根際土壤細(xì)菌和放線(xiàn)菌呈正相關(guān)，而與真菌呈負(fù)相關(guān)；李洪連等[28]通過(guò)平板涂布法比較了棉花黃萎病不同抗/感品種與根際土壤微生物的關(guān)系，結(jié)果表明抗病品種的真菌種數(shù)多于感病品種，并且前者區(qū)系組成更為復(fù)雜，抗性品種與真菌數(shù)量呈正相關(guān)，而與細(xì)菌數(shù)量無(wú)顯著相關(guān)性。

圖6 土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌屬水平群落組成的冗余分析Fig.6 RDA analysis of soil physicochemical properties and bacterial communities at genus level

本研究結(jié)果表明，棉花黃萎病抗/感品種之間的土壤細(xì)菌群落多樣性、結(jié)構(gòu)和組成方面存在差異。群落組成方面，在門(mén)水平上，抗病品種的放線(xiàn)菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、硝化螺菌門(mén)、Patescibacteria和裝甲菌門(mén)菌群的相對(duì)豐度高于感病品種；在屬水平上，抗病品種的鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、Bryobacter、Iamia、Pseudarthrobacter、芽球菌屬、紅色桿菌屬、類(lèi)諾卡氏屬、Pontibacter、鏈霉菌屬、Gemmatirosa、微單孢菌屬和Solirubrobacter菌群的相對(duì)豐度高于感病品種，進(jìn)一步驗(yàn)證了前人的研究觀點(diǎn)，即抗病品種的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)優(yōu)于感病品種[26,29]，而與李洪連等[28]通過(guò)選擇性平板法表明抗病性不同的棉花品種與根際細(xì)菌數(shù)量無(wú)明顯相關(guān)性的結(jié)論存在區(qū)別，本研究認(rèn)為對(duì)微生物群落的研究方法存在區(qū)別可能是導(dǎo)致研究結(jié)果不同的主要原因之一。此外，抗/感品種的植物根系分泌物種類(lèi)和含量不同[14]，且根系分泌物能夠影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[13,30-31]，推測(cè)根系分泌物是造成抗/感品種根際土壤微生物群落差異的原因之一。關(guān)于作物根系分泌物中的哪些物質(zhì)通過(guò)何種代謝途徑對(duì)微生物造成影響，有待于進(jìn)一步研究。

3.2 作物生育時(shí)期對(duì)土壤微生物群落的影響

已有研究表明，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受作物生育時(shí)期的影響較為明顯[29-30]。BREIDENBACH等[29]比較了水稻不同生育時(shí)期對(duì)根際土壤和非根際土壤微生物群落組成的影響，發(fā)現(xiàn)在水稻生長(zhǎng)早期草螺菌屬（Herbaspirillum）菌群的相對(duì)豐度較高，且根際土壤高于非根際土壤；INCEOGLU等[30]研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯不同品種根際土壤微生物受作物生育時(shí)期的影響，其中幼苗期和開(kāi)花期的根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)顯著不同于衰老期；CHAPARRO等[13]比較了擬南芥苗期、抽薹期和開(kāi)花期根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明幼苗期的土壤微生物群落明顯不同于其他時(shí)期，并且指出植物在不同的生育時(shí)期能夠招募特定的微生物種類(lèi)；李洪連等[28]研究表明，抗/感黃萎病棉花品種在根際微生物區(qū)系組成的差異在苗期和現(xiàn)蕾期比較明顯，而在花鈴期差異則顯著降低，說(shuō)明根際微生物對(duì)棉花抗病性的影響在生長(zhǎng)前期較大，生長(zhǎng)后期則較??；胡元森等[32]對(duì)黃瓜不同生育時(shí)期根際土壤微生物的研究發(fā)現(xiàn)，根際微生物主要類(lèi)群的數(shù)量與其生長(zhǎng)發(fā)育呈正相關(guān)，且根際微生物數(shù)量在花期或盛果期時(shí)達(dá)到最高峰，之后呈下降趨勢(shì)。

本研究結(jié)果表明，在盛花期、開(kāi)花后期和結(jié)鈴期抗/感品種之間的土壤細(xì)菌群落多樣性差異性存在區(qū)別。對(duì)于抗病品種而言，由盛花期至結(jié)鈴期，鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、Pontibacter和Gemmatirosa菌群的相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì)；溶桿菌屬菌群的相對(duì)豐度呈先上升后下降趨勢(shì)，Haliangium菌群的相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)。而對(duì)于感病品種而言，鞘氨醇單胞菌屬、溶桿菌屬、芽單胞菌屬和Pontibacter菌群的相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)，Haliangium和Gaiella菌群的相對(duì)豐度均呈上升趨勢(shì)。此外，由盛花期至結(jié)鈴期，Pseudarthrobacter、硝化螺菌屬和Luedemannella菌群的相對(duì)豐度在品種間差異不顯著。在結(jié)鈴期，Bryobacter、Iamia、Dongia、Ilumatobacter和類(lèi)諾卡氏屬菌群的相對(duì)豐度存在差異，而在盛花期和開(kāi)花后期差異不顯著。在盛花期，芽球菌屬、微單孢菌屬和Solirubrobacter菌群的相對(duì)豐度存在差異，其他時(shí)期品種間差異不顯著。在結(jié)鈴期，紅色桿菌屬菌群的相對(duì)豐度品種間差異不顯著，其他時(shí)期差異顯著；在盛花期和結(jié)鈴期，鏈霉菌屬菌群的相對(duì)豐度在品種間存在顯著差異?？?感品種由盛花期至結(jié)鈴期的病情指數(shù)呈逐步上升趨勢(shì)，本研究?jī)H從對(duì)土壤細(xì)菌的群落組成變化進(jìn)行了研究，而抗/感品種受黃萎病菌侵染后根際微生物和植物內(nèi)生菌的組成及變化情況有待于進(jìn)一步探究。

3.3 病原菌數(shù)量與作物品種抗病性的關(guān)系

許多學(xué)者從土壤和植株組織中的病原菌數(shù)量與作物品種抗病性的關(guān)系角度開(kāi)展研究[33-35]。劉瓊光等[33]研究表明，根際土壤中青枯菌數(shù)量與番茄品種抗性之間相關(guān)性不高，而植物根內(nèi)青枯菌數(shù)量與番茄品種抗性密切相關(guān)；王卉等[34]研究發(fā)現(xiàn)，青枯菌數(shù)量在番茄抗/感品種之間存在明顯差異，而病原菌數(shù)量在不同品種根部的吸附差異不顯著；吳傳德等[35]研究表明，棉花枯萎病抗病品種根際土壤中病原菌數(shù)量明顯少于感病品種。本研究結(jié)果表明，土壤中大麗輪枝菌的數(shù)量與黃萎病發(fā)生的相關(guān)性存在差異，其中土壤中病原菌數(shù)量與感病品種鄂荊1號(hào)的發(fā)病率和病情指數(shù)呈正相關(guān)，而與抗病品種冀863相關(guān)性不強(qiáng)。開(kāi)花后期和結(jié)鈴期抗病品種冀863土壤中的病原菌ITS拷貝數(shù)低于感病品種鄂荊1號(hào)。

3.4 土壤理化性質(zhì)與微生物群落的關(guān)系

土壤養(yǎng)分、pH、有機(jī)質(zhì)等土壤理化性質(zhì)是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素[36-37]。ZHOU等[38]研究表明，連續(xù)多年施氮顯著影響了土壤細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)變化，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)土壤pH、有機(jī)碳和硝態(tài)氮含量是導(dǎo)致東北黑土中氨氧化古菌群落差異的主要因素[39]，SUN等[40]施氮后獲得了相似的研究結(jié)果。

菌群屬水平的研究結(jié)果表明，抗病品種許多優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度高于感病品種，并且在特定時(shí)期微生物菌群的相對(duì)豐度在抗/感品種間存在顯著差異，如在開(kāi)花后期和結(jié)鈴期，抗病品種土壤的鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬和Pontibacter菌群的相對(duì)豐度呈顯著上升趨勢(shì)，而感病品種反呈下降趨勢(shì)，且抗病品種高于感病品種。鞘氨醇單胞菌屬菌群與硝態(tài)氮、無(wú)機(jī)磷、pH和有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)，而與銨態(tài)氮和速效磷呈負(fù)相關(guān)。芽單胞菌屬和Gemmatirosa菌群與硝態(tài)氮呈正相關(guān)，而與其他理化性質(zhì)呈負(fù)相關(guān)。此外，盡管溶桿菌屬菌群與硝態(tài)氮、無(wú)機(jī)磷、pH和有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)，但抗/感品種間的相對(duì)豐度差異不顯著。類(lèi)諾卡氏屬菌群與速效磷呈負(fù)相關(guān)，而紅色桿菌屬和鏈霉菌屬菌群與速效磷呈正相關(guān)；芽球菌屬菌群與土壤理化性質(zhì)不具有相關(guān)性；微單孢菌屬和Solirubrobacter菌群與銨態(tài)氮和速效磷呈負(fù)相關(guān)。

綜合分析抗/感品種在花鈴期不同階段的土壤微生物群落組成與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系，可為合理施肥提高不同生育時(shí)期土壤優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度，進(jìn)而提高植物的抗病性提供科學(xué)依據(jù)。因此，通過(guò)施用不同類(lèi)型的氮肥（銨態(tài)氮型和硝態(tài)氮型）來(lái)改善土壤特定優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度是今后研究的內(nèi)容之一。此外，土壤溫度和濕度亦是重要的環(huán)境因子[41-42]，其如何對(duì)土壤中微生物群落和病原菌數(shù)量產(chǎn)生影響亦有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

土壤中大麗輪枝菌的數(shù)量與棉花抗/感品種黃萎病發(fā)生的相關(guān)性存在差異，其中土壤中病原菌數(shù)量與感病品種鄂荊1號(hào)的發(fā)病率和病情指數(shù)呈正相關(guān)，而與抗病品種冀863相關(guān)性不強(qiáng)?？共∑贩N在盛花期、開(kāi)花后期和結(jié)鈴期土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)優(yōu)于感病品種，并且生育時(shí)期的優(yōu)勢(shì)菌群存在不同程度的差異。土壤中細(xì)菌的多樣性、相對(duì)豐度和組成受有機(jī)質(zhì)、pH、氮素類(lèi)型、速效磷等指標(biāo)影響。同時(shí)，棉花不同生育時(shí)期對(duì)土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯影響。