胡曉強 趙光輝 馬瑋超 李 峰

（1河南省新鄉(xiāng)市農業(yè)科學院，河南新鄉(xiāng)453000；2福州市農業(yè)科學研究所，福建福州350018）

我國是世界上最早認識和利用食用菌的國家。早在公元前240年就有關于食用食用菌的記載，公元600年開始食用菌的野生馴化和人工栽培，公元14世紀，香菇人工栽培技術研究成功[1]。菌種是香菇生產最重要的基礎生產資料，對香菇產量及質量具有決定性影響。香菇生產中引種頻繁，且隨意冠名，出現了同名異物和同物異名的現象。筆者對來自不同香菇栽培基地的香菇菌株進行區(qū)別性鑒定，并進行栽培對比試驗，以期獲得適合當地栽培的香菇菌株。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

從5個香菇栽培基地分離得到了8個香菇菌株，通過體細胞不親和性鑒定，剔除彼此間不產生拮抗的菌株，初步獲得5個差異性菌株，用于進一步開展ISSR區(qū)別性鑒定（表1）。

表1 供試香菇菌株及來源

1.2 引物及ISSR-PCR反應體系[2-4]

引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

反應體系為 20 μL，其中含有 1×PCR Buffer，1.2 mmol/L Mg2+，0.6 μmol/L引物，200 μmol/L dNTP，模板DNA 50 ng，0.06 U/μL Taq酶。

ISSR-PCR反應程序為：94℃預變性3 min；94℃變性45 s，50℃退火50 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；最后72℃終延伸7 min，停止反應。4℃保存反應液備用。

表2 ISSR引物及其序列

1.3 栽培方法

栽培料配方：雜木屑79%，麩皮20%，石膏1%。料含水量55%～58%，pH自然。

栽培袋選用15 cm×55 cm×0.005 cm的聚乙烯塑料袋，培養(yǎng)料現拌現裝；培養(yǎng)料采用常壓滅菌，溫度達100℃后保持14 h。出鍋冷卻后在接種室常規(guī)方法接種，每袋接種4穴；發(fā)菌期控制發(fā)菌溫度25℃以下，菌絲長滿袋后，加強通風降溫促進菌棒轉色，轉色完成后，通過噴水及加強通風控溫不超過30℃，之后進入越夏管理[5]。

1.4 考察內容及方法

每個菌株接種24 h后開始觀察菌絲萌發(fā)及菌絲生長情況，測量菌絲生長速度，記錄菌絲滿袋時間[6]。出菇試驗采用層架出菇方法，設置三組重復，每個重復50棒。常規(guī)出菇管理，按照鮮銷采收標準，子實體七八分熟時采收并記錄產量。

2 結果與分析

2.1 5個香菇菌株的ISSR標記分析

6條引物分別對5個菌株的總DNA進行擴增，各引物擴增的片段數為3～9條，分子量為0.15～1.9 kb，表現出供試菌株的擴增差異性，圖1、2分別為引物822、引物855的擴增圖譜。

圖1 引物822PCR擴增結果

圖2 引物855PCR擴增結果

2.2 香菇菌株的聚類分析

利用NTSYS軟件對5個香菇菌株的相似性進行（UPMGA）聚類分析，得到5個菌株的遺傳距離樹狀圖（圖3）。由圖3可以看出，供試的5個香菇菌株遺傳距離在0.25～0.57，其中菌株L2與供試的其余4個菌株遺傳距離最大，為0.57；菌株L3與L4遺傳差異最小，遺傳距離為0.25；5個供試菌株遺傳距離較大，具有明顯的遺傳差異。

圖3 5個香菇菌株ISSR遺傳距離樹狀圖

2.3 供試香菇菌株菌絲生長情況

由表3可見，5個供試香菇菌株接種后48 h內均開始萌發(fā)，菌絲滿袋時間為37～40 d。香菇菌株L4菌絲體平均長速最快，為0.34 cm/d，滿袋時間為37 d；香菇菌株L2和L3菌絲平均長速最慢，均為0.31 cm/d，滿袋時間為40 d。供試的5個香菇菌株菌絲形態(tài)均表現為菌絲粗壯、濃白，僅在菌絲平均長速上存在差異。

表3 供試香菇菌株菌絲生長比較

2.4 供試香菇菌株產量

5個供試香菇菌株產量見表4。菌株L4單棒平均產量最高，為1013 g/棒，生物學效率為75.04%，顯著高于其他4個菌株；其次為菌株L5，單棒平均產量為999 g/棒，生物學效率為74.00%；菌株L1、L3生物學效率分別為63.56%、64.67%，產量較低。生物學效率排序：L4＞L5＞L2＞L3＞L1。方差分析結果顯示，5個供試香菇菌株產量之間差異顯著。

表4 供試香菇菌株產量比較

表5 供試香菇菌株子實體性狀比較

2.5 供試香菇菌株子實體主要農藝性狀

5個供試香菇菌株子實體主要農藝性狀見表5，出菇狀態(tài)見圖4。香菇菌株L1、L4鮮菇單朵較大，菌蓋直徑為5.8 cm，菌株L1單朵較重，為18.4 g。菌株L2朵形最小。

圖4 5個供試香菇菌株出菇狀態(tài)

3 小結與討論

食用菌菌種質量直接關系到食用菌產業(yè)能否良性發(fā)展，單純依靠食用菌子實體形態(tài)特征有時難以有效區(qū)分菌株之間的差異，結合分子標記技術，可以更加準確、科學地對食用菌菌種進行鑒定及檢測[8]。簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性（Inter-simple sequence repeat，ISSR）DNA標記技術是根據真核生物中廣泛存在簡單重復序列的特點，利用在真核生物基因組中常出現的簡單重復序列本身設計引物，通常為顯性標記，呈孟德爾式遺傳，具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，已廣泛應用于食用菌遺傳多樣性分析和雜交育種方面的研究[8-10]。

針對示范基地存在的菌種混亂現象，采用體細胞不親和性鑒定方法，可以初步鑒定出菌株的異同，采用ISSR分子標記技術能夠更進一步清晰地鑒定出同物異名及同名異物菌株，并能夠量化出各個菌株之間的遺傳差異，是食用菌菌株遺傳分析及科學鑒定的有效工具。試驗對來自河南省新鄉(xiāng)市5個示范基地的8個香菇菌株，最終鑒定出5個為特異菌株，說明存在同物異名現象。

5個香菇菌株越夏栽培結果表明，其產量及主要農藝性狀存在差異。其中菌株L4菌絲生長速度快，商品性狀優(yōu)，產量高，可作為當地春季栽培香菇優(yōu)選品種；菌株L2出菇較快，但子實體菇形小，菌肉較薄、柄長，總體商品性狀較差。