王家旺,鄧利廷,孫 健,葛菁萍
(1.黑龍江大學 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心,黑龍江 哈爾濱 150500;2.黑龍江大學 生命科學學院微生物省高校重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150080)
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一種單細胞真菌,作為重要的生產(chǎn)用微生物,在醫(yī)藥、食品和生物能源等方面被廣泛應用[1-2]。釀酒酵母具有易于培養(yǎng)、繁殖迅速、代謝產(chǎn)物少、碳源利用率高以及可存活于較低pH環(huán)境的特點[3-4];并且,釀酒酵母被認為是安全的微生物,遺傳背景清晰,基因操作技術(shù)成熟,是一種模式微生物,便于進行基因改造[5]。2,3-丁二醇(2,3-butanediol,2,3-BD)作為一種平臺化合物,被廣泛應用于食品、醫(yī)藥以及航空航天等領(lǐng)域。目前,2,3-BD的生產(chǎn)方法主要有化學合成法和生物轉(zhuǎn)化法兩種[6]。前者生產(chǎn)成本高、工藝繁瑣、不易操作以及對環(huán)境污染嚴重等缺點而很難得到廣泛應用[7]。而生物轉(zhuǎn)化法是利用微生物發(fā)酵來生產(chǎn)2,3-BD,其生產(chǎn)成本低、條件溫和以及易于操作,同時符合低碳、環(huán)保和經(jīng)濟的發(fā)展目標,受到越來越多的關(guān)注[8]。因此,以釀酒酵母作為出發(fā)菌株生產(chǎn)2,3-BD具有一定優(yōu)勢。
釀酒酵母在以葡萄糖為底物產(chǎn)2,3-BD的過程中,丙酮酸通過乙酰乳酸合成酶合成a-乙酰乳酸,其在微氧條件下能夠自發(fā)脫羧生成雙乙酰,在雙乙酰還原酶的作用下生成乙偶姻并通過BDH轉(zhuǎn)化為2,3-BD[9-10]。因此,生成2,3-BD的主要酶為2,3-丁二醇脫氫酶(2,3-butanediol dehydrogenase,BDH),乙偶姻作為2,3-BD的前體物質(zhì),可直接轉(zhuǎn)化產(chǎn)生2,3-BD。因此,可通過研究乙偶姻的產(chǎn)生情況,來篩選出具有2,3-BD產(chǎn)生能力的菌株。GONZALEZ E等[11]通過減少2,3-BD的產(chǎn)生,發(fā)現(xiàn)其增加了乙偶姻的積累。MOES J等[12]研究發(fā)現(xiàn),改變?nèi)苎跛娇墒挂遗家雠c2,3-BD進行相互轉(zhuǎn)化。LI L等[13]將陰溝腸桿菌的BDH基因表達在了大腸桿菌中,使2,3-BD的產(chǎn)量大幅提高。檢測2,3-BD的方法主要有色譜法,雖然可較直接測定其含量,但對設備要求較高,費時費力[14]。而由于2,3-BD可直接由乙偶姻轉(zhuǎn)化產(chǎn)生,兩者之間有著密不可分的關(guān)系。因此,利用一種快速簡單的方法去檢測乙偶姻的含量,以達到篩選2,3-BD生產(chǎn)菌株的目的。
本研究將39株W系列菌株(W4、W22、W23、W25、W27、W39、W41、W55、W57、W58、W61、W63、W65、W66、W67、W68、W70、W74、W82、W87、W96、W108、W109、W117、W119、W120、W121、W124、W130、W132、W135、W139、W140、W141、W143、W144、W148以及W149)、土壤樣品中分離出的5株菌株(Y1、C1、Y2、Z1和E1),以及酒糟中分離出的1株菌株(J1)作為候選菌株,進行可產(chǎn)2,3-BD菌株的篩選。并使用形態(tài)學和分子生物學手段對高產(chǎn)2,3-BD的菌株進行鑒定,之后搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)進行菌株發(fā)酵性能(OD600nm、pH、葡萄糖剩余量以及2,3-BD產(chǎn)量)的檢測。其研究結(jié)果為釀酒酵母(S.cerevisiae)菌株的利用提供了理論基礎與指導,并有助于深入了解2,3-BD產(chǎn)生的作用機制。
1.1.1 菌株與質(zhì)粒
菌株W4、W22、W23、W25、W27、W39、W41、W55、W57、W58、W61、W63、W65、W66、W67、W68、W70、W74、W82、W87、W96、W108、W109、W117、W119、W120、W121、W124、W130、W132、W135、W139、W140、W141、W143、W144、W148以及W149等:黑龍江大學微生物重點實驗室提供;菌株Y1分離于魚塘、菌株C1分離于菜園、菌株Y2分離于玉米場、菌株Z1分離于豬舍、菌株E1分離于鵝棚、菌株J1分離于酒糟;大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α:黑龍江大學微生物重點實驗室提供;pMDTM18-T(產(chǎn)品號6011):大連寶生物有限公司。
1.1.2 化學試劑
蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉、酵母基礎氮源培養(yǎng)基(yeast nitrogen base,YNB)(均為生化試劑)、氯化鈉、葡萄糖、(NH4)2SO4、KH2PO4、無水CaCl2、K2HPO4、MgSO4·7H2O、(NH4)2HPO4(均為分析純):天津市科密歐化學試劑有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒(目錄號DP103)、酵母基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取試劑盒(目錄號DP307-02)、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(目錄號DP209):天根生化科技有限公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法蛋白含量測定試劑盒(目錄號YW3-1):蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。
1.1.3 培養(yǎng)基
LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L,pH 7.0。121 ℃高壓滅菌15 min。
LB固體培養(yǎng)基:于LB液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。121 ℃高壓滅菌15 min。
酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)液體培養(yǎng)基:蛋白胨20 g/L,酵母提取物10 g/L,葡萄糖20 g/L,pH值自然。108 ℃高壓滅菌20 min。
YPD固體培養(yǎng)基:于YPD液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。108 ℃高壓滅菌20 min。
發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖80 g/L,無氨基酵母氮源(yeast nitrogen base without amino acids,YNB)3.4 g/L,蛋白胨20 g/L,K2HPO43 g/L,KH2PO411.8 g/L,(NH4)2SO410 g/L,pH值自然。108 ℃高壓滅菌20 min。
LC20A高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀:島津國際貿(mào)易(上海)有限公司;JY92-2D超聲波細胞粉碎機:寧波新芝有限公司;Alphalmager HP凝膠成像系統(tǒng):美國Protein Simple公司;A560紫外可見分光光度計:翱藝儀器(上海)有限公司;ABI9700聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀:美國Life Technologies公司;PB-21 pH計:賽多利斯科學儀器有限公司。
1.3.1 肌酸顯色法篩選2,3-丁二醇產(chǎn)生菌
在堿性介質(zhì)中,乙偶姻與含胍基的化合物反應生成紅色物質(zhì),并且在α-萘酚存在的情況下可以促進并加速紅色物質(zhì)生成,利用這一化學特性對菌株進行篩選,篩選出具有明顯顯色的菌株用于后續(xù)試驗。由于該紅色絡合物在波長520 nm處有光吸收,其吸光度值與乙偶姻濃度成正比,依此對發(fā)酵液中的乙偶姻同時進行了定量檢測[15-16]。
乙偶姻標準曲線繪制:分別取質(zhì)量濃度分別為0、0.1g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L的乙偶姻標準品溶液25 μL,加入5%α-萘酚1 mL,0.5%肌酸1 mL,10%NaOH 1 mL和ddH2O 7 mL,30 ℃、140 r/min培養(yǎng)30 min后在波長520 nm條件下測其吸光度值。
將活化至對數(shù)期的菌株,分別按5%的接種量接種到以80g/L葡萄糖為單碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中,裝液量100mL/250mL,30 ℃、140 r/min發(fā)酵72 h。每隔12 h取樣,按繪制標準曲線回歸方程計算乙偶姻含量。
1.3.2 菌株的鑒定
根據(jù)《酵母菌分類學研究》第四版中的酵母菌鑒定標準方法,利用光學顯微鏡和體視鏡進行觀察,觀察細胞的大小及形態(tài)、菌落質(zhì)地、菌落顏色、菌落表面特征、菌落邊緣和生殖特征等,進行形態(tài)學鑒定。
根據(jù)18S rDNA序列的保守性,采用真菌18S rDNA通用引物NS1(5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3')和NS8(5'-TCCGCAGCTTCACCTACGGA-3')進行PCR擴增,PCR擴增體系:模板DNA 2μL,上下游引物(1 pmol/μL)各1 μL,Prime STAR Max Premix(2X)12.5 μL,ddH2O 8.5 μL。PCR擴增條件:94 ℃預變性5 min;98 ℃變性10 s,55 ℃退火10 s,72 ℃延伸60 s,共30個循環(huán);72 ℃再延伸5 min。將利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收得到的PCR產(chǎn)物與pMDTM18-T載體連接,利用熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細胞中,并涂布于含有氨芐青霉素(終質(zhì)量濃度為100 μg/mL)的LB平板上,挑取長勢較好的白色單菌落進行菌落PCR鑒定(使用引物NS1和NS8),將驗證正確的菌落接種至LB培養(yǎng)基中進行過夜培養(yǎng),送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。將測序結(jié)果提交至美國國家生物信息中心(national center for biological information,NCBI)利用BLAST程序分析比對測序結(jié)果,尋找與目的序列相似性最高的已知分類地位的酵母菌,利用MEGA 6.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹,判斷種屬分類地位。
1.3.3 菌株發(fā)酵性能探究
將活化至對數(shù)期的菌株,按5%的接種量和100mL/250mL的裝液量,接種到底物質(zhì)量濃度為80 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)72 h,每隔12 h取樣一次,測定發(fā)酵液在波長600 nm條件下的吸光度值(OD600nm)和發(fā)酵液的pH值變化,用HPLC檢測菌株底物消耗與產(chǎn)物生成情況,包括葡萄糖剩余量以及2,3-BD的產(chǎn)量。
1.3.4 BDH酶活檢測
將活化至對數(shù)期的出發(fā)菌株按5%的接種量,接種到裝液量為150mL/500 mL,底物質(zhì)量濃度為80g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)72 h,每隔12 h取樣,13 000 r/min常溫離心8 min收集菌體,加入1 mL pH 6.5磷酸鹽緩沖液后再次離心棄上清,加入1.5 mL pH 6.5磷酸鹽緩沖液,超聲波破碎菌體(功率20%,超聲3 s,間隔10 s,重復30次),4 ℃,8 000 r/min,離心10 min,收集上清并進行2,3-丁二醇脫氫酶(BDH)酶活測定[17]。2,3-丁二醇脫氫酶酶活定義:是指在最適條件下,在1 min內(nèi)能轉(zhuǎn)化1 μmol底物的酶量為1個酶活力單位(U/mg)。
從釀酒酵母代謝葡萄糖產(chǎn)2,3-BD的路徑可以看出,乙偶姻是2,3-BD產(chǎn)生的最直接前體物質(zhì),菌株對乙偶姻的積累和轉(zhuǎn)化間接反映出其生產(chǎn)2,3-BD的能力。因此,利用肌酸顯色法對菌株進行篩選,W5、W25、W27、W39、W41、W58、W61、W87、W96、W108、W119、W135、W141、J1、Z1、Y2、C1和E1等18株菌株具有明顯地顯色效果。乙偶姻產(chǎn)量測定結(jié)果見圖1。
圖1 乙偶姻產(chǎn)量測定結(jié)果Fig.1 Detection results of acetoin content
由圖1可知,乙偶姻的積累量呈現(xiàn)先增高后降低再增高的趨勢,并且大部分菌株在發(fā)酵12 h時出現(xiàn)第一個積累點,這可能是由于在發(fā)酵之初菌株大量利用葡萄糖促進自身生長繁殖,使得乙偶姻得以積累。24 h到60 h的乙偶姻積累量逐漸降低,但在72 h時升高。12 h和72 h這兩個時間點也成為了影響2,3-BD產(chǎn)量的關(guān)鍵點[18]。菌株W141乙偶姻產(chǎn)量最大為0.225 g/L(12 h),其次是W96,產(chǎn)量為0.223 g/L(48 h)。因此,選擇菌株W141進行下一步實驗。
2.2.1 形態(tài)學鑒定
取稀釋適當倍數(shù)的菌株W141的菌懸液于光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)(圖2A),細胞呈卵圓形、5~7 μm左右、繁殖方式為出芽繁殖;在體視鏡下觀察菌落形態(tài)(圖2B),菌落為乳白色、濕潤、隆起、菌落整體黏稠、表面較光滑、容易挑起、質(zhì)地較均勻、直徑在0.5~0.6 cm、正反面與邊緣以及中心部位的顏色都很均一。
圖2 菌株W141菌落形態(tài)(A)和細胞形態(tài)(B)Fig.2 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of strain W141
2.2.2 分子生物學鑒定
18S rDNA序列系統(tǒng)進化樹分為多個簇,每簇之上又分出若干亞簇,表明酵母之間的遺傳多樣性。以菌株DNA為模板,PCR擴增菌株的18SrDNA基因,得到堿基長度為1702bp,結(jié)果見圖3。
圖3 菌株W141基于18S rDNA序列系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain W141 based on 18S rDNA sequences
由圖3可知,在此進化樹中,菌株W141處于進化樹的上部亞簇中,與釀酒酵母(S.cerevisiae)strainFJU-YS5(EF153845.1)的親緣關(guān)系最近,序列的相似度達到99%。結(jié)合形態(tài)學觀察結(jié)果,菌株W141被鑒定為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
將菌株活化至對數(shù)期,按5%的接種量接種到裝液量為100 mL/250 mL,葡萄糖質(zhì)量濃度為80 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中,30 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)72 h,每12 h取樣一次,測定pH、OD600nm、葡萄糖剩余量以及2,3-BD產(chǎn)量,結(jié)果見圖4。
圖4 發(fā)酵過程中pH(A)、OD600nm值(B)、葡萄糖剩余量(C)和2,3-丁二醇產(chǎn)量(D)的變化Fig.4 Changes of pH (A),OD600nmvalue (B),glucose content (C) and 2,3-butanediol production (D) during fermentation
由圖4A可知,在發(fā)酵之初發(fā)酵液的pH值為5.59,但在發(fā)酵時間為12~24 h,由4.75逐漸下降至3.96,之后在4.00左右逐漸趨于穩(wěn)定,由于在以葡萄糖為底物發(fā)酵產(chǎn)2,3-BD的過程中,也產(chǎn)生了乳酸以及乙酸等酸性物質(zhì),使得發(fā)酵液中的pH有所下降,但是在發(fā)酵后期,發(fā)酵液中菌體生長也開始穩(wěn)定,所以pH也變化不大。
由圖4B可知,OD600nm值在前24 h內(nèi)迅速增加至1.4,這可能是由于在前24 h處于菌株生長的對數(shù)生長期,所以OD600nm值增加明顯。而后增長的并不明顯,到了60 h小幅上升至1.5。OD600nm值的總體變化情況是,隨發(fā)酵時間的延長不斷增加,在24 h時達到最大并保持大致穩(wěn)定。
由圖4C可知,對于添加的80 g/L葡萄糖,在前12 h內(nèi)的葡萄糖含量迅速消耗至16 g/L,并在第24 小時被消耗掉,這可能是由于在發(fā)酵前期菌株生長速度較快,需要吸收大量的葡萄糖來維持自身的生長,而后期菌株生長速度較平穩(wěn),所以葡萄糖的利用速度也較慢。
由圖4D可知,而對于2,3-BD的生成情況來說,在第36 小時開始逐漸產(chǎn)生2,3-BD,并逐漸增加至最大值1.6 g/L(72 h),并且在60h至72h內(nèi)產(chǎn)生的最多。由于發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)2,3-BD的代謝較復雜,也會產(chǎn)生其他物質(zhì),所以轉(zhuǎn)化成2,3-BD也需要逐步進行,所以一開始并沒有產(chǎn)生2,3-BD。NG C Y等[19]對釀酒酵母中的adh基因進行敲除后,2,3-BD的產(chǎn)量達到2.29 g/L,本研究結(jié)果與其尚有一定差距。
BDH活性隨發(fā)酵時間的變化情況見表1。
表1 發(fā)酵過程中2,3-丁二醇脫氫酶活性的變化Table 1 Change of 2,3-butanediol dehydrogenase activity during fermentation
由表1可知,在整個72 h的發(fā)酵期間內(nèi),釀酒酵母(S.cerevisiae)W141的BDH活力呈逐漸增大的趨勢,并從第36 小時增加明顯,并在第72小時達到最高值0.025 7 U/mg。由于生成2,3-BD的主要酶為BDH,因此,釀酒酵母(S.cerevisiae)W141具有較好的2,3-BD生產(chǎn)能力。結(jié)合相關(guān)文獻[20]可知,如果要進一步地增加2,3-BD的產(chǎn)量,可以過表達bdh基因,從而使BDH酶活增加,以達到增加2,3-BD產(chǎn)量的目的。
本研究通過顯色方法對可產(chǎn)2,3-BD菌株的篩選,通過形態(tài)學鑒定以及分子生物學鑒定對高產(chǎn)2,3-BD菌株進行分析,最后進行發(fā)酵檢測。結(jié)果表明,菌株W141被鑒定為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),其BDH酶活力高,并且有一定地2,3-BD產(chǎn)量,可作為2,3-BD的生產(chǎn)菌株。而在酒糟、豬舍、玉米場、菜園和鵝棚等地分離的菌株也有一定的產(chǎn)2,3-BD的潛能。本研究所得結(jié)果對進一步篩選高產(chǎn)2,3-BD的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株提供了技術(shù)支持,同時也擴大了該菌株的研究體系。