呂志敏 于 佳 管 寧

（青島市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)技術(shù)研究所 山東青島 266101）

1 前言

食品安全是人類(lèi)健康安全的重要保障，而酵母菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生容易引起人類(lèi)病理變化的次級(jí)代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致人類(lèi)急性或慢性中毒，嚴(yán)重的還有可能致癌[1]。通過(guò)酵母菌計(jì)數(shù)來(lái)測(cè)定食品被污染的程度，可以評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量[2]。酵母菌的數(shù)量在一定程度上反映食品包裝用紙衛(wèi)生質(zhì)量，可用于評(píng)價(jià)其微生物污染程度。目前，常用的關(guān)于食品包裝用紙酵母菌總數(shù)的檢驗(yàn)方法是食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定》[3]中的第一法：平板計(jì)數(shù)法。

2 材料與方法

2.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用樣品為青島市地區(qū)質(zhì)量抽查采集的食品包裝用紙。

2.2 儀器與試劑

高壓滅菌鍋；恒溫培養(yǎng)箱；電子天平；孟加拉紅瓊脂；氯化鈉。

2.3 檢驗(yàn)方法

2.3.1 檢驗(yàn)依據(jù)

按GB 4789.15—2016中第一法進(jìn)行檢測(cè)。

2.3.2 樣品制備

無(wú)菌條件下，添加質(zhì)控菌株釀酒酵母ATCC9763菌懸液到酵母菌陰性的食品包裝用紙樣品中。

無(wú)菌條件下，取25 g該樣品于225 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻，制成1∶10樣品勻液。用1 mL無(wú)菌吸管吸取1∶10樣液1 mL，沿管壁緩慢注于盛有9 mL稀釋液的無(wú)菌試管中，振搖試管或換用1支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1∶100樣液。依次制備10倍系列稀釋樣品勻液。

總而言之，小班化教學(xué)是當(dāng)今農(nóng)村教育的潮流，大勢(shì)所趨。小班化教學(xué)為學(xué)困生的輔導(dǎo)提供了時(shí)間和機(jī)會(huì)，有利于學(xué)困生養(yǎng)成良好的學(xué)習(xí)習(xí)慣，培養(yǎng)自主學(xué)習(xí)能力。

2.3.3 樣品檢測(cè)

選擇2個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，吸取1 mL樣品勻液于無(wú)菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做2個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1 mL空白稀釋液加入2個(gè)無(wú)菌平皿做空白對(duì)照。然后在46℃的孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基上傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)使其混合均勻，待瓊脂凝固后，將平板正置，28℃培養(yǎng)，觀察并記錄，培養(yǎng)5d后計(jì)數(shù)報(bào)告結(jié)果。

2.3.4 結(jié)果計(jì)算

用肉眼和低倍鏡觀察，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的酵母菌落數(shù)（CFU）。選取菌落數(shù)在10～150 CFU的平皿用于結(jié)果計(jì)算。

2.4 不確定度模型

采用整體法評(píng)估測(cè)量不確定度，以影響測(cè)試結(jié)果分析程序的總變量為基礎(chǔ)進(jìn)行評(píng)估?？傋兞堪ň芏群推?，在實(shí)際操作中，單位樣品的菌落數(shù)并不能獲得真值，即使使用的材料都經(jīng)過(guò)相關(guān)認(rèn)可，得出的數(shù)值也經(jīng)過(guò)了實(shí)驗(yàn)室間驗(yàn)證，也只能對(duì)總偏倚的部分進(jìn)行評(píng)定。因此，此次實(shí)驗(yàn)的測(cè)量不確定度的評(píng)估不考慮偏倚。

2.4.1 不確定度來(lái)源

本實(shí)驗(yàn)利用“黑匣子”系統(tǒng)確定實(shí)驗(yàn)中不確定度的來(lái)源。整體法可看作是一個(gè)“黑匣子”系統(tǒng)，食品微生物不確定度的主要來(lái)源都可以被標(biāo)識(shí)。它有助于識(shí)別不確定度來(lái)源，不論其是否包括在實(shí)驗(yàn)方案中（圖1）。

圖1 “黑匣子”系統(tǒng)：食品微生物不確定度主要來(lái)源示意

最終，此次實(shí)驗(yàn)根據(jù)操作員、實(shí)驗(yàn)室樣品、次級(jí)取樣、培養(yǎng)基和試劑、操作時(shí)間、培養(yǎng)箱等不確定度來(lái)源設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案。

其中，次級(jí)取樣是指從滴加菌懸液的食品包裝用紙樣品中取出測(cè)試的部分，酵母菌計(jì)數(shù)中的初始懸液屬于次級(jí)取樣。

2.4.2 實(shí)驗(yàn)方案

此次實(shí)驗(yàn)為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差，實(shí)驗(yàn)將取樣的影響并入到總不確定度評(píng)估中。排除取樣和偏倚，將同一批次的食品包裝用紙加入酵母菌菌懸液混合均勻，平均分成10份，操作員A和操作員B同時(shí)根據(jù)次級(jí)取樣、培養(yǎng)基、試劑、操作時(shí)間、培養(yǎng)箱等不確定度來(lái)源進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。最終得到各樣品的酵母菌菌落總數(shù)，采用合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差的方法進(jìn)行計(jì)算，進(jìn)而對(duì)測(cè)量不確定度進(jìn)行評(píng)定。詳見(jiàn)圖2。

圖2 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差的實(shí)驗(yàn)方案

2.4.3 計(jì)算公式

依據(jù)RB/T 151—2016中要求，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度通過(guò)最終測(cè)量結(jié)果的再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)計(jì)算。

本實(shí)驗(yàn)的再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算n個(gè)給定基質(zhì)樣品的再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差SR的方法，按（1）式計(jì)算：

其中，SR—再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)方差；Yij—對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換值，單位為log10（CFU/g）；n—給定基質(zhì)樣品數(shù)量；i—樣品的序號(hào)，i=1-n（n≥10）；j—再現(xiàn)性條件的編號(hào)，j=A 或 j=B。

擴(kuò)展不確定度U為合成不確定度uc（y）和包含因子k的乘積，本標(biāo)準(zhǔn)中k值為2（對(duì)應(yīng)95%的置信水平），按式（2）計(jì)算：

其中，k—包含因子；U—擴(kuò)展不確定度；uc（y）—合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度；SR—再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)方差。

3 結(jié)果與分析

平板計(jì)數(shù)時(shí)，用肉眼觀察，在記下平板菌落數(shù)后，求出各重復(fù)平均菌落總數(shù)，數(shù)據(jù)單位從CFU/g轉(zhuǎn)換為 log10（CFU/g）。 詳見(jiàn)表 1。

表1 平板計(jì)數(shù)計(jì)算結(jié)果

把表1數(shù)據(jù)帶入再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差SR，所求再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

擴(kuò)展不確定度為：

U=k×SR=0.24 log10（CFU/g）（置信水平 95%時(shí)，包含因子k=2）

此次實(shí)驗(yàn)由操作員、次級(jí)取樣、培養(yǎng)基、試劑、操作時(shí)間、培養(yǎng)箱等不確定度來(lái)源的不同，分成10組實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值為6.4 log10CFU/g，lgx=lgx±U，因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告為（6.4±0.24）log10（CFU/g），lgx值區(qū)間為6.16 log10～6.64 log10。取反對(duì)數(shù)后，此次食品包裝用紙酵母菌總數(shù)的置信區(qū)間為1.4×106～4.4×106CFU/g。

4 結(jié)論

食品化學(xué)樣品分析結(jié)果常以微量為主，且化學(xué)物質(zhì)具有均一性，有較成熟計(jì)算不確定度的方法，而微生物污染的樣品分析結(jié)果常以宏量為主，測(cè)定的是活的物質(zhì)，不同的菌落之間有互生或拮抗等相互作用，是微生物測(cè)量不確定度評(píng)定的難點(diǎn)。檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告后，剩余樣品或同批樣品不進(jìn)行微生物項(xiàng)目的復(fù)檢，所以，同一樣品多次重復(fù)測(cè)量的方法并不可取。從統(tǒng)計(jì)學(xué)上講，所有被合并計(jì)算的檢測(cè)結(jié)果都是在檢測(cè)重復(fù)性或復(fù)現(xiàn)性條件下對(duì)同一或類(lèi)似被測(cè)對(duì)象的重復(fù)檢測(cè)所得到的結(jié)果。本文將同一批次的食品包裝用紙加入酵母菌菌懸液后混合均勻，平均分成10份，同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，既避免了同一樣品重復(fù)測(cè)量，又實(shí)現(xiàn)了在檢測(cè)重復(fù)性條件下對(duì)同一被測(cè)對(duì)象的重復(fù)檢測(cè)的目的。

隨著食品安全問(wèn)題的焦點(diǎn)化，人們對(duì)與食品相關(guān)的細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)度、可信性要求不斷提升，引入測(cè)量不確定度可以解決對(duì)精準(zhǔn)度和可信性的要求。在檢驗(yàn)時(shí)，合理應(yīng)用測(cè)量不確定度的方法，可以更加客觀地分析檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，為檢驗(yàn)結(jié)果提供技術(shù)支撐。食品包裝用紙中酵母菌計(jì)數(shù)結(jié)果引入測(cè)量不確定度不僅易于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制，更能客觀分析、評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果，是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的一部分，可為檢測(cè)部門(mén)保障食品安全奠定理論技術(shù)基礎(chǔ)。