王利剛 費(fèi)云滟 陳 欣 周正海 黃思瑜 趙 博

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院 重慶 401121）

1 前言

隨著社會的進(jìn)步，我國的食品工業(yè)發(fā)展迅速，市場上可供消費(fèi)者選擇的食品也越來越多。一些生產(chǎn)廠家為了追求更高的經(jīng)濟(jì)利益，會在產(chǎn)品中添加一些價(jià)格相對低廉的植物源性成分，如核桃飲料中添加大豆、花生等成分[1]，芝麻醬中添加花生、玉米粉[2]，或者在動物源性產(chǎn)品中添加植物源性成分，如羊奶粉中添加大豆成分[3]，這種行為不僅損害了消費(fèi)者的權(quán)利，還可能威脅食用者的身體健康，如果添加的成分中含有對某些食用者的過敏源，則可能導(dǎo)致嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。

對食品中植物源性成分的檢驗(yàn)方法多集中于分子生物學(xué)方法，其中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）及其衍生方法應(yīng)用最為廣泛，但是也有學(xué)者就蛋白電泳[4]、氣相色譜[5]、電子鼻[6]技術(shù)等方向進(jìn)行了相關(guān)的探索。本文對廣泛使用的PCR及其衍生方法的發(fā)展以及其他方法的探索進(jìn)行綜述，以期能為食品中植物源性成分的檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展提供參考。

2 PCR及其衍生方法

2.1 PCR法

PCR建立于1983年，1988年后PCR在科學(xué)界的應(yīng)用快速發(fā)展，可靠性也不斷提高，如今在PCR原理的基礎(chǔ)上發(fā)展出了許多實(shí)驗(yàn)方法。PCR是一種核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，針對目標(biāo)序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過控制溫度，使反應(yīng)體系中的Taq酶以目標(biāo)序列為模板，以dNTP為原料，反復(fù)變性、退火、延伸3個(gè)步驟，約30個(gè)循環(huán)即可對目標(biāo)序列的片段成百萬倍的放大[7，8]，通過對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，就可以確定是否存在目標(biāo)成分。

使用PCR法檢驗(yàn)食品中的植物源性成分已經(jīng)發(fā)展成熟，對某些特定食品或者整個(gè)食品大類的植物源性成分的研究表明，PCR法的特異性、靈敏度、精確度都能達(dá)到檢驗(yàn)要求，其中某些植物源性成分的檢測已經(jīng)以內(nèi)源基因等形式存在于植物轉(zhuǎn)基因成分檢測、過敏源性成分檢驗(yàn)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中。已有相關(guān)地區(qū)采用PCR方法作為食品監(jiān)管風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測的依據(jù)。部分研究者的相關(guān)研究成果詳見表1。

表1 目標(biāo)基因、引物相關(guān)信息

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR法

實(shí)時(shí)熒光 PCR（Real-time PCR，RT-PCR）是PCR技術(shù)的衍生技術(shù)，其在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板進(jìn)行分析[19]。RT-PCR相對傳統(tǒng)PCR增加了熒光信號，可分為擴(kuò)增序列特異和非特異的檢測兩大類，擴(kuò)增序列非特異性檢測方法的基礎(chǔ)是DNA結(jié)合的熒光分子。如SYBR green I等熒光染料，熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號[20]，擴(kuò)增序列特異性檢測方法是在PCR反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產(chǎn)物，目前應(yīng)用最廣泛、最典型的代表就是TaqMan系統(tǒng)，需要設(shè)計(jì)特異性的熒光探針（表2），兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)，當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)，探針的熒光基團(tuán)會被Taq酶的5’-3’外切酶活性切除下來，從而產(chǎn)生熒光[21]。

該技術(shù)可對檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤，免去了PCR后進(jìn)行電泳觀察的步驟，還可以對DNA模板進(jìn)行定量，相對于傳統(tǒng)PCR，其靈敏度、特異性和可靠性更高，同時(shí)具有自動化程度高、無污染性、具實(shí)時(shí)性等優(yōu)點(diǎn)[22]，目前RT-PCR已廣泛應(yīng)用于動植物源性成分檢驗(yàn)。RT-PCR法檢驗(yàn)植物源性成分以內(nèi)源基因的形式存在于出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，且食品監(jiān)督管理部門也專門制定并發(fā)布了相關(guān)的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法。

2.3 數(shù)字PCR法

數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Digital Polymer-ase Chain Reaction，dPCR）是繼普通PCR和RT-PCR之后的第3代PCR技術(shù)，是基于單分子目標(biāo)基因PCR擴(kuò)增的絕對定量PCR技術(shù)。該技術(shù)通過微滴化處理或者微孔式芯片將PCR反應(yīng)液分配到獨(dú)立的反應(yīng)室中，理論上每個(gè)獨(dú)立反應(yīng)室中的目標(biāo)核酸不超過1拷貝，獨(dú)立進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，通過對每個(gè)反應(yīng)室進(jìn)行檢測、統(tǒng)計(jì)陽性和陰性反應(yīng)的數(shù)量，根據(jù)泊松分布進(jìn)行校正，最終計(jì)算出初始樣品中目標(biāo)核酸的精確拷貝數(shù)[36-38]。

表2 目標(biāo)基因、引物及探針相關(guān)信息

國內(nèi)dPCR用于食品中源性成分檢驗(yàn)的研究大多為動物源性成分檢驗(yàn)，王珊等[39]建立了一種定量檢測羊肉制品中羊源和豬源性成分的微滴式數(shù)字PCR方法，并將該方法與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2051—2008中實(shí)時(shí)熒光PCR方法做對比，結(jié)果表明2種方法均能檢出樣品含有的羊源和豬源性成分，而微滴式數(shù)字PCR方法（ddPCR）能夠?qū)NA模板定量分析。苗麗等[40]為準(zhǔn)確定量肉及肉制品中羊源性成分的含量，建立的微滴數(shù)字PCR定量檢測系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確檢測出不同樣品中羊肉的含量，并發(fā)現(xiàn)可能存在摻假現(xiàn)象，建立的微滴數(shù)字PCR定量方法在肉及肉制品中羊源性成分檢測方面具有較大的應(yīng)用潛力。王強(qiáng)等[41]利用ddPCR技術(shù)對食品和飼料中鵝源性成分進(jìn)行檢測與精確定量，所設(shè)計(jì)的引物及探針具有良好的種間特異性和種內(nèi)保守性，可用于對食品和飼料中鵝源性成分進(jìn)行檢測和精確定量。鄧珍丹[42]建立肉制品含有不同的雞、牛、羊、豬、鴨源性成分檢測的微滴數(shù)字PCR定量檢測方法，能夠更加快速、有效的檢測出動物源性成分，特異性強(qiáng)，方法快速準(zhǔn)確。史艷宇等[43]建立的鴨源性成分檢測方法能夠有效對鴨源性成分進(jìn)行檢測，特異性強(qiáng)，靈敏度高，并且其他物種成分的存在對方法靈敏度檢測沒有影響，可以實(shí)現(xiàn)畜肉食品中的鴨源性成分檢測。

dPCR用于食品中植物源性成分檢驗(yàn)的研究相對較少，楊碩等[44]為市售核桃乳中核桃源及主要摻雜物種大豆兩種源性成分建立準(zhǔn)確、快速定量檢測方法，結(jié)果顯示該方法引物探針特異性好，目標(biāo)物種間無交叉反應(yīng)；靈敏度高，核桃中摻雜大豆的質(zhì)量檢測限為0.5%，相對誤差為5.6%。多重微滴式數(shù)字PCR準(zhǔn)確、快速的定量方法可作為鑒別核桃乳中摻雜使假問題的有效手段。楊碩等建立了市售椰子汁飲料產(chǎn)品中目的種源成分（椰子）和非目的種源成分（大豆、花生）的分子生物學(xué)檢測鑒定方法，研究顯示ddPCR法對可疑結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證可避免假陽性結(jié)論[45]。

3 其他檢驗(yàn)方法

3.1 蛋白電泳

通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE），可鑒定核桃、杏仁、花生、大豆中的蛋白成分。方法采用植物活性蛋白質(zhì)提取試劑盒分別提取預(yù)處理后的核桃、杏仁、花生、大豆等樣品中的蛋白質(zhì)成分，計(jì)算蛋白質(zhì)的相對分子量，之后分別進(jìn)行SDS-PAGE檢測得到這幾種蛋白成分的特征條帶，并對不同樣品中蛋白成分的電泳圖譜進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，每一物種都有相對應(yīng)的蛋白指紋圖譜，不同種類的核桃含有相同的蛋白質(zhì)亞基，具有高同源性，但核桃與花生、黃豆和杏仁含有不同種類大小的蛋白，具有高特異性。吳亞君等[46]通過優(yōu)化條件，建立牛乳毛細(xì)管凝膠電泳方法，檢測到大豆水解蛋白標(biāo)志峰，分別測定純大豆水解蛋白溶液及牛乳-大豆水解蛋白混合溶液中的水解蛋白標(biāo)志峰峰面積-濃度線性關(guān)系，并將毛細(xì)管電泳與SDS-PAGE垂直板電泳及蛋白芯片電泳進(jìn)行比較，驗(yàn)證了毛細(xì)管電泳結(jié)果。

3.2 色譜法

呂品等[47]采用高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜對飲料中生物堿、皂苷和有機(jī)酸等24種植物源性成分進(jìn)行快速篩查、定性識別和準(zhǔn)確定量。研究表明，24種化合物在50～750 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。樣品中各化合物的檢出限為 8～20 μg/L。 在 3 種添加量（70 μg/L、250 μg/L、700 μg/L)條件下，其平均回收率為63.0%～126.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.11%～14.73%。該方法利用精確質(zhì)量數(shù)匹配和自建標(biāo)準(zhǔn)庫檢索，實(shí)現(xiàn)快速篩查，并使用多級特征碎片離子進(jìn)行確證，具有快速、高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。李瑩瑩等[48]采用基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定肉類食品中多種植物源性成分的方法，檢測肉類食品中的特征多肽，并與標(biāo)準(zhǔn)植物成分的特征多肽進(jìn)行比較，從而判定對應(yīng)的植物源性成分，可實(shí)現(xiàn)對特征性多肽的快速篩選以及對肉類多種植物源性成分的準(zhǔn)確鑒別，且方法在目標(biāo)蛋白篩選過程進(jìn)行了優(yōu)化，集中有效目標(biāo)蛋白的數(shù)量，提高了特異性多肽的篩選速度和效率。為了檢測樣品中是否含有山崳酸以及檢測核桃乳中是否摻有花生乳，可通過高效液相色譜法檢測樣品中是否含有大豆異黃酮來鑒別核桃乳中是否摻有大豆乳。

3.3 電子鼻

電子鼻檢測技術(shù)是一種分析、識別物質(zhì)“風(fēng)味”的新型檢測手段，能夠模擬人類的鼻子檢測風(fēng)味物質(zhì)，具有分析快，結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。采用電子鼻對市售不同品牌及不同品種的芝麻醬進(jìn)行識別，并在芝麻醬中分別添加不同比例的自制花生醬進(jìn)行摻假，對電子鼻響應(yīng)信號進(jìn)行主成分分析、辨別因子分析、偏最小二乘回歸分析和統(tǒng)計(jì)質(zhì)量控制分析的結(jié)果表明，電子鼻能有效識別不同品牌的黑芝麻醬、白芝麻醬及混合芝麻醬；各摻假芝麻醬樣品隨著摻假比例的增加（0%、5%、10%、20%、40%、60%、80%、100%），樣品的分布呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，電子鼻響應(yīng)信號與摻假樣品之間有較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.99；對摻假芝麻醬建立了偏最小二乘回歸模型，模型預(yù)測值誤差為0.7%～2.7%。

4 討論

在實(shí)際工作中，PCR法存在一些缺點(diǎn)，如結(jié)果觀察依賴于瓊脂糖電泳，存在環(huán)境污染和人員危害的風(fēng)險(xiǎn)；電泳條帶的大小不能完全確定是否與目標(biāo)條帶大小一致；出現(xiàn)陽性結(jié)果時(shí)還需進(jìn)一步進(jìn)行測序進(jìn)行確認(rèn)等。若設(shè)計(jì)多重PCR開展多個(gè)項(xiàng)目的檢驗(yàn)，不僅需要在設(shè)計(jì)引物時(shí)考慮引物與引物、引物與模板之間的影響，還要考慮反應(yīng)條件的協(xié)調(diào)，在能滿足以上設(shè)計(jì)需求的情況下，在結(jié)果觀察時(shí)還需要考慮產(chǎn)物條帶的大小，回收時(shí)是否有條帶重疊的情況等，因此，目前尚無開發(fā)多重PCR的報(bào)道。

隨著實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在已經(jīng)有多種熒光素進(jìn)行標(biāo)記，比如，Cy5、HEX、VIC、FAM、Cyan500、ROX、Red640 等，因此，如果設(shè)計(jì)合理，原則上可實(shí)現(xiàn)同一反應(yīng)中同時(shí)檢測多個(gè)源性成分的多重PT-PCR方法。在動物源性成分檢測中，有相關(guān)學(xué)者建立了同一管中同時(shí)檢測出豬、牛、羊、雞、鴨、鵝源性成分的六重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，在植物源性成分檢驗(yàn)中也有學(xué)者進(jìn)行探索[50]。

dPCR目前應(yīng)用并不多，但由于其自身的特點(diǎn)可以獲得絕對定量的結(jié)果，可以應(yīng)用于某些食品的含量檢驗(yàn)中。如GB/T 19855—2015《月餅》[51]細(xì)化了蓮蓉月餅的蓮蓉類餡料中蓮子的含量應(yīng)該不低于60%、蓮子含量為100%才能稱為純蓮蓉；栗蓉類月餅的餡料中板栗含量不能低于60%等條件內(nèi)容，目前尚無具體方法進(jìn)行檢驗(yàn)，而dPCR在這一領(lǐng)域具有較好的前景。

電泳法也屬于分子生物學(xué)方法，對蛋白分子電泳后，通過比較分析分辨是否摻有其他植物源性成分；色譜法和電子鼻等技術(shù)屬于成分分析法，通過篩選獲得特定的目標(biāo)成分作為標(biāo)志物，以此作為其他植物源性成分的指征，這些方法都需要在前期進(jìn)行大量的統(tǒng)計(jì)、分析、篩選工作，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在實(shí)際工作中具有較強(qiáng)的探索意義。

隨著食品安全監(jiān)管對食品中植物源性成分檢驗(yàn)技術(shù)的需求增加，現(xiàn)階段RT-PCR正逐步成為主流的檢驗(yàn)技術(shù)，且食品安全監(jiān)管部門已經(jīng)發(fā)布基于RTPCR的食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法作為檢驗(yàn)依據(jù)，但隨著監(jiān)管維度的擴(kuò)寬和力度的加深，其他方向的檢驗(yàn)方法也會在日后檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展之中占有一席之地。