余河玲 朱師良 何啟牮 王彥

摘要：本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建PDPK1基因3′UTR雙熒光素酶報(bào)告載體，并驗(yàn)證gga-miR-148a-5p與PDPK1的靶向關(guān)系。利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)gga-miR-148a-5p與PDPK1結(jié)合位點(diǎn);利用PCR擴(kuò)增PDPK1基因3′UTR序列，將其克隆到PGL3-CMV-LUC-MCS雙熒光素酶報(bào)告基因載體中;將gga-miR-148a-5p及陰性對(duì)照分別與野生型gga-PDPK1-WT-3′UTR雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)各組熒光素酶活性。Targetscan、miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，gga-miR-148a-5p與PDPK1基因3′UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn);酶切及測(cè)序結(jié)果表明，雙熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建成功;熒光素酶活性試驗(yàn)結(jié)果表明，gga-miR-148a-5p mimics能夠與PDPK1基因3′UTR結(jié)合并抑制熒光素酶活性。gga-miR-148a-5p能夠與PDPK1靶向性結(jié)合，PDPK1是gga-miR-148a-5p的靶基因。

關(guān)鍵詞：PDPK1;gga-miR-148a-5p;禽白血病;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)

中圖分類(lèi)號(hào)：Q783文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）01-0147-05

Abstract：In this study， the PDPK1 gene 3′UTR dual luciferase reporter vector was established， and the targeting relationship between gga-miR-148a-5p and PDPK1 was verified. Bioinformatics software was used to predict the binding site of gga-miR-148a-5p and PDPK1. The 3′UTR sequence of PDPK1 gene was amplified by PCR and cloned into PGL3-CMV-LUC-MCS dual luciferase reporter vector. The gga-miR-148a-5p and negative control were cotransfected with wild-type gga-PDPK1-WT-3′UTR dual luciferase reporter plasmid into 293T cells， and the luciferase activity of each group was detected by dual luciferase reporter system. Prediction results from Targetscan and miRbase databases showed that there were complementary binding sites between gga-miR-148a-5p and the 3′UTR of PDPK1 gene. The enzyme digestion and sequencing results showed that the dual luciferase reporter vector was successfully constructed. The results of luciferase activity assay indicated that gga-miR-148a-5p mimics could bind to the 3′UTR of PDPK1 gene and inhibit luciferase activity. The gga-miR-148a-5p can bind to PDPK1， and PDPK1 is the target gene of gga-miR-148a-5p.

Key words：PDPK1;gga-miR-148a-5p;avian leukosis;dual luciferase reporter gene detection system

禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosisvirus，ALV）引起的，是雞三大腫瘤性疾?。R立克氏病、白血病、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥?。┲凶钕缺蝗藗冴P(guān)注并研究的一種禽類(lèi)疾病。該疾病是由反轉(zhuǎn)錄病毒科（Retroviridae）禽白血病病毒（又稱(chēng)肉瘤病毒群病毒）（ ALV）引起的以造血細(xì)胞惡性增生為主的多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱(chēng)[1]。據(jù)報(bào)道，在一些中國(guó)雞群中，ALV-J可誘導(dǎo)各種腫瘤的發(fā)生[2-3]，導(dǎo)致雞晚期發(fā)病和急性腫瘤[4-5]，且具有高達(dá)60%的發(fā)病率和20%的死亡率[2]。由于ALV-J具有極高的突變率和重組率，且極易導(dǎo)致其宿主范圍和毒性改變，可導(dǎo)致腫瘤、免疫缺陷、白血病和淋巴瘤。因此，研制相關(guān)疫苗存在一定難度。除此之外，在實(shí)際生產(chǎn)中，禽白血病病毒的傳播方式也給禽白血病的防治帶來(lái)了一定的難度。

3-磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶-1（PDK1或PDPK1）是屬于AGC激酶家族的古老絲氨酸-蘇氨酸激酶，具有作為AGC激酶的主要調(diào)節(jié)劑的特性[6]。眾所周知，許多腫瘤是由關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)途徑的失調(diào)引起的。而PDPK1上游信號(hào)蛋白的改變，例如酪氨酸激酶受體的激活、PI3K組成型活化及PTEN功能喪失，都可以引發(fā)人類(lèi)癌癥。同時(shí)，PDPK1的多個(gè)下游效應(yīng)物，如Akt、p90RSK、p70S6K、PKC和SGK，與癌癥惡化趨向及更具侵襲性的疾病有關(guān)。例如，在人體前列腺癌中，與原發(fā)性腫瘤相比，含有PDPK1基因的基因座在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和去勢(shì)抵抗性前列腺癌中常被檢測(cè)到[7];在人體食管鱗狀細(xì)胞癌中，與鄰近的非癌組織相比，腫瘤細(xì)胞中PDPK1蛋白表達(dá)更高。此外，PDPK1的高表達(dá)與晚期腫瘤分期（陽(yáng)性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或高組織學(xué)分級(jí)）和較短的總生存期相關(guān)[8]。例如，PDPK1在40%以上的急性髓性白血病患者中過(guò)度表達(dá)，PDPK1高表達(dá)的患者呈現(xiàn)較差的治療結(jié)果，且比PDPK1低表達(dá)的患者存活時(shí)間更短[9]。

hsa-miR-148a位于雞7號(hào)染色體，包含68個(gè)核苷酸序列。而gga-miR-148a位于雞2號(hào)染色體上，有68個(gè)核苷酸序列。miR-148a的表達(dá)已在人、小鼠、大鼠和斑馬魚(yú)中得到證實(shí)，但尚未在雞中得到驗(yàn)證。在正常生理?xiàng)l件下，miR-148a在各種人體組織中表達(dá)，包括腦、心臟、肝臟、胸腺、胰腺、腎、胎盤(pán)、子宮、睪丸和造血系統(tǒng)等[10-12]。miR-148a的表達(dá)下調(diào)可以在多種癌癥中檢測(cè)到，包括胃癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、肝癌、食道癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和泌尿生殖系統(tǒng)癌癥。本試驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)gga-miR-148a-5p在40日齡的禽白血病患病雞和未患病雞的脾臟組織中存在差異表達(dá)，但目前對(duì)于其與PDPK1的靶向關(guān)系尚未報(bào)道。本研究采用生物信息學(xué)方法對(duì)gga-miR-148a-5p的直接作用靶基因及作用位點(diǎn)進(jìn)行分析，并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析gga-miR-148a-5p是否能靶向調(diào)控PDPK1基因，為進(jìn)一步研究gga-miR-148a-5p在雞抗禽白血病育種中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

人腎上皮細(xì)胞（293T）、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、雙熒光素報(bào)告基因載體（PGL3-CMV-LUC-MCS）均購(gòu)自上海吉滿(mǎn)公司，膠回收試劑盒購(gòu)自凱杰生物技術(shù)有限公司（上海），小提質(zhì)粒試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司（美國(guó)），Taq polymerase、DNA ladder購(gòu)自TaKaRa寶生物（大連）科技有限公司，Hieff Clone Plus One Step Cloning Kit購(gòu)自YEASEN，瓊脂糖購(gòu)自上海前塵生物有限公司，Mlu I、Xho I內(nèi)切酶購(gòu)自Fermantas公司，胎牛血清、DMEM、胰酶均購(gòu)自GIBICO公司（美國(guó)），引物合成及測(cè)序由生工生物工程（上海）有限公司完成。二氧化碳培養(yǎng)箱，SHELLAB公司產(chǎn)品;熒光倒置顯微鏡，Nikon公司產(chǎn)品;CFX96熒光定量PCR儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品;超低溫冰箱，Thermo公司產(chǎn)品。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1gga-miR-148a-5p靶基因的預(yù)測(cè)及靶基因富集前期課題組曾對(duì)miRNA與雞白血病之間的關(guān)系進(jìn)行了探究，通過(guò)采集40日齡患病雞和健康雞的脾臟組織進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，最終篩選出了7個(gè)差異表達(dá)的miRNA（gga-miR-205a、gga-miR-21-5p、gga-miR-383-5p、gga-miR-203、gga-miR-223、gga-miR-148a-5p、gga-miR-21-3p）。在此基礎(chǔ)上，首先，通過(guò)使用miRDB、TargetScan7.1等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)gga-miR-148a-5p靶基因，求其交集。然后，利用生物信息學(xué)軟件DAVID將靶基因的交集在NF-kB信號(hào)通路進(jìn)行靶基因富集，最終選定PDPK1作為gga-miR-148a-5p的靶基因。

1.2.2構(gòu)建PDPK1野生型雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒本試驗(yàn)結(jié)合miRDB軟件和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，找到PDPK1與gga-miR-148a-5p的結(jié)合位點(diǎn)（http：//www.mirdb.org/cgi-bin/target_detail.cgi？targetID=541541），共構(gòu)建3個(gè)PDPK1基因3′UTR野生型報(bào)告基因質(zhì)粒。選用的載體為PGL3-CMV-LUC-MCS（上海吉滿(mǎn)生物科技有限公司提供），首先通過(guò)雙酶切的方法得到線(xiàn)性化載體，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法得到PCR擴(kuò)增片段，gga-PDPK1引物序列： gga-PDPK1-F：5′-AGATCGCCGTGTGACTCGAGTAACAATCAGACATGCAGTCACCTTGC-3′，gga-PDPK1-R：5′-CCCCGACTCTAGCACGCGTCCTTGACACAAGATTTGAAACTGCC-3′，其引物末端具有20個(gè)線(xiàn)性化載體末端的同源堿基，其中黑色下劃線(xiàn)部分序列為同源臂序列，未劃線(xiàn)部分分別為PDPK1的上游引物序列和下游引物序列，Mlu I、Xho I酶切位點(diǎn)為引物兩端添加同源臂的位置。PDPK1報(bào)告基因質(zhì)粒及gga-miR-148a-5p mimincs序列由上海吉滿(mǎn)生物科技有限公司合成。

雙酶切PCR產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳純化回收;Mlu I、Xho I雙酶切PGL3-CMV-LUC-MCS空載體，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳純化回收;采用無(wú)縫克隆的方式，根據(jù)HieffCloneTM重組反應(yīng)體系，將酶切好的載體與目的片段進(jìn)行連接，于50 ℃連接20 min，再取10 μl的連接產(chǎn)物加入制備好的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，置于冰上。最后再加入到含氨芐霉素或卡那霉素等的平板上，涂板后挑選若干個(gè)單菌落，進(jìn)行小量搖菌培養(yǎng)，然后進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.3雙熒光素酶活性檢測(cè)分別將接種構(gòu)建成功的PDPK1 3′UTR報(bào)告基因載體質(zhì)粒菌液移至5 ml LB培養(yǎng)液中，37 ℃搖床（220 r/min）過(guò)夜，用高純度質(zhì)粒抽提試劑盒QIAprep Miniprep Handbook制備質(zhì)粒。將狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的空白細(xì)胞用0.25%胰酶消化，用完全培養(yǎng)基懸浮成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接種于24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過(guò)夜，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。在細(xì)胞覆蓋率70%左右時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，轉(zhuǎn)染2 h前將培養(yǎng)基換為新鮮的培養(yǎng)基，分別為miR-148a-5p mimics+PDPK1 WT1+TK、miR-148a-5p mimics+PDPK1 WT2+TK、miR-148a-5p mimics+PDPK1 WT3+TK、miR-148a-5p mimics+UTRNC+TK、miR NC+ PDPK1 WT1+TK、miRNC+PDPK1 WT2+TK、miRNC+PDPK1 WT3+TK、miRNC+UTRNC+TK，轉(zhuǎn)染48 h后，從培養(yǎng)箱中取靶細(xì)胞裂解、離心，收取上清液，然后根據(jù)報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有試驗(yàn)結(jié)果均采用 SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1gga-miR-148a-5p與PDPK1 3′UTR互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)生物信息學(xué)軟件Targetscan、miRbase篩選得分較高，且交集較多的靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)gga-miR-148a-5p與PDPK1 3′UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)（圖1）。

2.2重組載體質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果

重組載體質(zhì)?；驕y(cè)序選用sanger測(cè)序法，其中PGL3-CMV-LUC-gga-PDPK1 3′UTR（gga-miR-148a-5p）WT1、PGL3-CMV-LUC-gga-PDPK1 3′UTR（gga-miR-148a-5p）WT2采用sanger反向測(cè)序法，PGL3-CMV-LUC-gga-PDPK1 3′UTR（gga-miR-148a-5p）WT3采用sanger正向測(cè)序法。3種PGL3-CMV-LUC-gga-PDPK1 3′UTR（gga-miR-148a-5p）WT陽(yáng)性重組克隆測(cè)序分別如圖2、圖3、圖4，經(jīng)過(guò)比對(duì)，重組克隆中插入片段序列與目的片段序列完全一致，因此載體構(gòu)建成功。

2.3雙熒光素酶活性

轉(zhuǎn)染48 h 后，在infinite M1000熒光檢測(cè)儀上檢測(cè)螢火蟲(chóng)與海腎熒光素酶值，并計(jì)算二者相對(duì)熒光素酶活性（△Ct），3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，每個(gè)樣品的螢火蟲(chóng)及海腎的熒光素酶值均較高且表達(dá)穩(wěn)定。在轉(zhuǎn)染重組載體質(zhì)粒PGL3-CMV-LUC-gga-PDPK1 3′UTR WT的試驗(yàn)中，與 gga-miR-148a-5p NC組相比較，gga-miR-148a-5p組的熒光素酶活性和miR-148a-5p mimics組熒光素酶活性均顯著下降，差異顯著;轉(zhuǎn)染空白載體質(zhì)粒的試驗(yàn)中，2組熒光素酶活性無(wú)顯著差異（圖5）。

3討論

截至目前，已經(jīng)報(bào)道了994個(gè)與雞有關(guān)的成熟miRNA，但尚不清楚miRNA參與ALV-J誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的機(jī)制以及參與宿主抗ALV-J應(yīng)答調(diào)節(jié)的具體miRNA。ALV-J在受感染的雞中能引發(fā)腫瘤性疾病，從而導(dǎo)致其死亡，同時(shí)引起非腫瘤性疾病，即由免疫抑制引起的繼發(fā)感染[1]，使得病雞出現(xiàn)身體消瘦、耐受性病毒血癥和免疫抑制等癥狀[13-14]。ALV-J影響了全球家禽業(yè)，它已在美國(guó)[15]、中東[16]、澳大利亞[17]等地被發(fā)現(xiàn)，并造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

miRNA作為重要的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中的調(diào)控因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，miRNA通過(guò)結(jié)合其靶基因3′UTR區(qū)域沉默其靶基因的功能，從而發(fā)揮其調(diào)控樞紐的作用[18]。在本試驗(yàn)前期階段，我們利用生物信息學(xué)技術(shù)，在miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站（miRDB，TargetScan）發(fā)現(xiàn)，PDPK1基因3′UTR的第42、2 455、3 731、3 907、4 110堿基序列位置可能和gga-miR-148a-5p互補(bǔ)，所以據(jù)此推測(cè)，PDPK1可能是在癌癥發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中g(shù)ga-miR-148a-5p的一個(gè)潛在靶基因，gga-miR-148a-5p調(diào)控PDPK1基因mRNA表達(dá)。所以為了進(jìn)一步研究gga-miR-148a-5p和PDPK1之間的關(guān)系，本試驗(yàn)采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，驗(yàn)證二者之間是否存在靶標(biāo)關(guān)系。我們將含有g(shù)ga-miR-148a-5p結(jié)合靶位點(diǎn)3′UTR的PDPK1基因目的片段克隆插入PGL3-CMV-LUC-MCS雙熒光素酶報(bào)告載體中的Xho I，Mlu I的酶切位點(diǎn)，將構(gòu)建成功的質(zhì)粒經(jīng)Xho I，Mlu I酶切，并經(jīng)過(guò)測(cè)序后證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。試驗(yàn)結(jié)果表明，gga-miR-148a-5p能夠顯著抑制熒光素酶的表達(dá)，gga-miR-148a-5p 能夠直接作用于PDPK1的3′UTR區(qū)并對(duì)其產(chǎn)生負(fù)性調(diào)控作用，PDPK1是gga-miR-148a-5p的靶基因。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）