楊蘭 李欠 馮彥梅 常寶勤 馬秀琴 張瑜 邱黛玉

摘要：以歐前胡素為內(nèi)標(biāo)物，建立了測(cè)定川白芷藥材中白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素多種成分含量的一測(cè)多評(píng)方法。采用HPLC方法，色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18 （4.6 mm×250.0 mm，5 μm），以甲醇-水為流動(dòng)相，等度洗脫，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，流速為1 ml/min進(jìn)行測(cè)定。以歐前胡素為內(nèi)標(biāo)物，建立川白芷藥材中白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、異歐前胡素的相對(duì)校正因子。川白芷藥材中白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、異歐前胡素的相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好，分別為0.407、0.844、0.847、0.625，一測(cè)多評(píng)法測(cè)定結(jié)果與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異。表明以歐前胡素為內(nèi)標(biāo)物建立川白芷藥材多種成分的一測(cè)多評(píng)法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性良好，方法可行，可作為川白芷藥材的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：川白芷;一測(cè)多評(píng)法;相對(duì)校正因子;質(zhì)量控制

中圖分類號(hào)：R286.0文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2020）01-0199-07

Abstract：The quantitative analysis of multi-components by single-marker （QAMS） method for content determination of byakangelicin， bergapten， oxypeucedanin， imperatorin and isoimperatorin in Angelica dahurica was established by setting imperatorin as internal standard substance. The high performance liquid chromatography （HPLC） method was adopted， and the chromatographic column of ZORBAX Eclipse Plus C18 （ 4.6 mm×250.0 mm， 5 μm） was used. The mobile phase was composed of methanol and water in isocratic elution. The column temperature was controlled at 30 ℃， the flow speed was 1 ml/min， and the detection wavelength was 250 nm. The relative correction factors of imperatorin to other four components were established by setting imperatorin as internal standard substance. The relative correction factors of byakangelicin， bergapten， oxypeucedanin and isoimperatorin in Angelica dahurica were 0.407， 0.844， 0.847 and 0.625， which had a high reproducibility. There was no significant difference between the results of QAMS method and external standard method. The QAMS method established by setting imperatorin as internal standard substance is accurate and feasible， which can be used as a useful quality control method for Angelica dahurica.

Key words：Angelica dahurica var. formosana;quantitative analysis of multi-components by single-marker（QAMS） method;relative correction factors;quality control

中藥白芷為傘形科植物白芷[Angelica dahuricae （Fisch.exHoffm.） Benth.etHook.f.]或杭白芷[A.dahuricae （Fisch.exHoffm.） Benth.etHook.f.var.formosana （Boiss.） ShanetYuan]的干燥根[1]，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，因初生根桿為芷，色白，因而得名，在中國(guó)有著悠久的藥食兩用的歷史[2]。白芷性溫，氣芳香，味辛，微苦，具有解表散寒、通竅止痛、祛風(fēng)除濕、消腫排膿、抗炎、解熱、美白等作用，且廣泛應(yīng)用于風(fēng)寒感冒、頭痛、鼻塞、鼻淵、牙痛、赤白帶下、癰疽瘡瘍、濕盛久瀉等病癥，特別是用于風(fēng)寒侵犯陽(yáng)陰引起的頭痛，其療效較顯著[3-8]。除藥用外，在食品、保健品、香料、護(hù)膚美容用品、日用化工品等方面也有廣泛用途[9]，特別是其干燥根部作為調(diào)味料可增香添味，脫臭除異，增進(jìn)食欲[10]。白芷之鄉(xiāng)四川遂寧產(chǎn)的白芷稱為川白芷，年產(chǎn)量占全國(guó)總產(chǎn)量的一半左右[11]，除此之外還有杭白芷、禹白芷、祁白芷、亳白芷、山東白芷、甘肅白芷等[12-13]。

白芷中主要的生物活性成分有香豆素、揮發(fā)油、多糖和微量元素[14]。香豆素主要包括歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、白當(dāng)歸素、水合氧化前胡素和異珊瑚菜素等[15-17]。在2015版《中國(guó)藥典》中用歐前胡素的含量對(duì)白芷進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)[18]。中藥質(zhì)量與其化學(xué)成分息息相關(guān)，但其化學(xué)成分具有多樣性和復(fù)雜性的特點(diǎn)，選取單一指標(biāo)難以表征這些特點(diǎn)，所以多組分分析對(duì)中藥質(zhì)量控制更加科學(xué)合理[19-21]。由于對(duì)照品昂貴、分離難度較大、單體不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，使得多組分分析存在一定的難度[22-24]。一測(cè)多評(píng)法是一種用于多指標(biāo)質(zhì)量控制的分析方法，其原理是通過(guò)將某一廉價(jià)易得的成分作為內(nèi)參物，建立內(nèi)參物與其他待測(cè)成分間的相對(duì)校正因子，從而實(shí)現(xiàn)多個(gè)待測(cè)成分的同時(shí)測(cè)定，是一種適合中藥多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)的模式，它的提出解決了上述對(duì)照品的問(wèn)題，且在一定程度上降低了中藥質(zhì)量控制的分析成本[25-29]。

目前，楊芳等[30]采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定了白芷中歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素的含量，分離時(shí)間超過(guò)25 min。江宇勤等[31]采用一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定白芷中歐前胡素、異歐前胡素、氧化前胡素和佛手柑內(nèi)酯4種香豆素成分，分析時(shí)間為25 min。有研究結(jié)果表明，白當(dāng)歸素具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛、解痙和抗腫瘤等功效[32-34]，除此之外Yoshiyuki等[35]也發(fā)現(xiàn)白當(dāng)歸素對(duì)組胺釋放具有抑制作用。所以白當(dāng)歸素也是白芷中重要的成分，將白當(dāng)歸素作為對(duì)白芷質(zhì)量控制指標(biāo)更加科學(xué)合理。

因此，本研究采用一測(cè)多評(píng)法，以廉價(jià)易得的歐前胡素為內(nèi)參物，建立白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素和異歐前胡素相對(duì)校正因子，同時(shí)測(cè)定川白芷藥材中5種香豆素成分的含量，為川白芷藥材質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

高效液相色譜儀，島津公司產(chǎn)品;PS-30A超聲清洗器，深圳市得康科技有限公司產(chǎn)品;HX203T電子天平，慈溪市天東衡器廠產(chǎn)品;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品;JFSD-100粉碎機(jī)，上海嘉定糧油儀器有限公司產(chǎn)品。

對(duì)照品白當(dāng)歸素（批號(hào)B-005-180921，≥98%）和佛手柑內(nèi)酯（批號(hào)17120501，≥98%）分別購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司和成都普菲德生物技術(shù)有限公司，對(duì)照品氧化前胡素（批號(hào)B21471，≥98%）、歐前胡素（批號(hào)18051502，≥98%）、異歐前胡素（批號(hào)18062202，≥98%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。甲醇為天津市富宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品，色譜純，≥99.5%。白芷藥材購(gòu)于四川省遂寧市的新橋、大英、新勝等地。

1.2色譜條件

在舒翔等[36]方法基礎(chǔ)上，進(jìn)行略微改動(dòng)。色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B），流速：1.0 ml/min，柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm，進(jìn)樣量：20 μl。

1.3對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素和異歐前胡素適量，加甲醇溶解，將其配制成質(zhì)量濃度各為100 μg/ml的混合對(duì)照品溶液，用0.45 μm的有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾。

1.4供試品溶液的制備

精密稱取藥材粉末（過(guò)40目篩）2 g，置于錐形瓶中，加入甲醇50 ml，稱質(zhì)量，超聲波處理（40 min，40 ℃），冷卻補(bǔ)質(zhì)量，搖勻，抽濾，取濾液經(jīng)0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾即得。

2結(jié)果與分析

2.1高效液相色譜系統(tǒng)適應(yīng)性及專屬性

精密量取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μl，進(jìn)行色譜分析。結(jié)果（圖1）顯示，供試品溶液色譜中呈現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰;白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素和異歐前胡素與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于3 000，方法專屬性良好。

2.2一測(cè)多評(píng)法的方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1川白芷中5種香豆素成分含量的線性關(guān)系精密量取混合對(duì)照品溶液，稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、40 μg/ml、80 μg/ml的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)行色譜分析。以質(zhì)量濃度為x軸、峰面積為Y軸進(jìn)行回歸處理，得到白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素和異歐前胡素含量的回歸方程。結(jié)果表明各化合物在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（表1）。

2.2.2精密度精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)行6次色譜測(cè)定，結(jié)果顯示白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素和異歐前胡素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.028%、0.024%、0.022%、0.024%、0.021%，表明儀器精密度良好。

2.2.3穩(wěn)定性取供試品溶液分別于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h，進(jìn)行色譜測(cè)定，白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素和異歐前胡素峰面積的RSD分別為0.626%、1.894%、1.128%、0.537%、0.478%，表明處理后的樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4重復(fù)性

精密稱取同一批藥材粉末2 g，共6份，制備樣品溶液，進(jìn)行色譜測(cè)定，計(jì)算5種香豆素成分含量。結(jié)果表明白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素和異歐前胡素的平均含量分別為0.109%、0.014%、0.105%、0.164%、0.087%， RSD分別為3.073%、2.562%、1.723%、3.494%、1.681%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5加樣回收率

在同一批已知含量的樣品（1 g）中加入一定量的混合對(duì)照品溶液，共6份，制備樣品溶液并測(cè)定各成分含量，計(jì)算各成分的加樣回收率及其RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3川白芷藥材中5種香豆素成分的相對(duì)校正因子

取混合對(duì)照品溶液，分別測(cè)定進(jìn)樣量為2 μl、4 μl、8 μl、16 μl、20 μl時(shí)的峰面積，按公式計(jì)算校正因子，fk/s=fk/fs=（Wk×As）/（Ws×Ak），式中fk/s為內(nèi)參物k對(duì)組分s的校正因子，Ak為內(nèi)參物峰面積，Wk為內(nèi)參物的質(zhì)量或質(zhì)量濃度，As為其他組分s的峰面積，Ws為其他組分s的質(zhì)量或質(zhì)量濃度。

以歐前胡素為內(nèi)參物，分別計(jì)算其對(duì)白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)脂、氧化前胡素和異歐前胡素的相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4相對(duì)校正因子的耐用性

2.4.1不同系統(tǒng)和色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響除了采用上述高效液相色譜系統(tǒng)與色譜柱之外，還考察了Waters高效液相色譜系統(tǒng)和Symmetry C18 色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）對(duì)各成分相對(duì)校正因子的影響。計(jì)算白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素和異歐前胡素與內(nèi)參物歐前胡素間的相對(duì)校正因子，結(jié)果（表4）顯示在不同色譜柱條件下重現(xiàn)性良好。

2.4.2不同流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響在同一實(shí)驗(yàn)室，采用島津LC20-A高效液相色譜系統(tǒng)和Waters（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，分別考察體積流量為 0.8 ml/min、0.9 ml/min、1.0 ml/min、1.1 ml/min、1.2 ml/min時(shí)歐前胡素對(duì)其他成分的相對(duì)校正因子，結(jié)果表明各成分相對(duì)校正因子在不同體積流量下重現(xiàn)性良好（表5）。

2.4.3不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響在同一實(shí)驗(yàn)室，采用島津 LC20-A 高效液相色譜系統(tǒng)和 Waters（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，分別考察柱溫為 20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃ 時(shí)歐前胡素對(duì)其他成分的相對(duì)校正因子，結(jié)果表明各成分相對(duì)校正因子在不同柱溫下重現(xiàn)性良好（表6）。

2.4.4不同檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)相對(duì)校正因子的影響在同一實(shí)驗(yàn)室，采用島津 LC20-A 高效液相色譜系統(tǒng)和 Waters（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，分別考察波長(zhǎng)為240 nm、245 nm、250 nm、255 nm、260 nm時(shí)歐前胡素對(duì)其他成分的相對(duì)校正因子，結(jié)果顯示各成分相對(duì)校正因子在不同波長(zhǎng)下重現(xiàn)性良好（表7）。

2.5一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較

精密吸取供試品溶液20 μl進(jìn)行色譜測(cè)定。采用一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法計(jì)算川白芷中白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素的含量。結(jié)果（表8）顯示，2種方法測(cè)得的各批次藥材中白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素含量差異不顯著。說(shuō)明用一測(cè)多評(píng)法評(píng)價(jià)川白芷的多指標(biāo)質(zhì)量是可行的。

3結(jié)論

本研究通過(guò)測(cè)定內(nèi)參物歐前胡素與白當(dāng)歸素、佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素和異歐前胡素之間的相對(duì)校正因子，同時(shí)測(cè)定川白芷藥材中5種香豆素成分含量，并與外標(biāo)法進(jìn)行比較，結(jié)果表明2種方法無(wú)顯著差異。說(shuō)明一測(cè)多評(píng)法準(zhǔn)確性良好，方法可行，結(jié)果可靠，可作為一種評(píng)價(jià)川白芷多成分質(zhì)量的方法。采用一測(cè)多評(píng)法可以解決對(duì)照品不足、中藥單指標(biāo)成分難以表達(dá)藥材質(zhì)量的弊端，同時(shí)能降低成本。

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（責(zé)任編輯：張震林）