孫國鋒，涂國勝，方正旭

(南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院心內(nèi)科，南昌330003)

冠心病尤其是急性心梗是嚴(yán)重威脅人們健康的心血管疾病之一， 目前治療主要是通過冠脈介入術(shù)或冠脈搭橋術(shù)進行血運重建， 但多少仍有一些不盡人意之處。 近年來，血管新生已成為冠心病研究熱點,特別是急性心梗后的心肌血管新生已成為研究重點。 血管新生是心肌缺血后的一種重要代償機制， 指通過各種方法促進新生血管生成的過程[1]。 目前急性心梗的治療性血管新生有各種促血管新生因子、干細(xì)胞等，但由于各種原因未能在臨床上得到廣泛應(yīng)用。 近年來有研究表明一些中成藥具有擴張冠脈，改善缺血心肌血液供應(yīng)，降低心肌耗氧量，減小心肌梗塞范圍等作用[2]。 本研究旨在觀察芪參益氣滴丸對梗死后大鼠血管新生的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料 雄性Wistar 大鼠30 只，體重(200±20) g，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。 按隨機數(shù)字表法分為3 組，即芪參益氣滴丸組(實驗組，10 例) 、心肌梗死組(對照組，10 例) 和假手術(shù)組(10 例) 。 芪參益氣滴丸0.5g×9 袋/盒，國藥準(zhǔn)字Z030139。 由天津天士力藥業(yè)公司提供。

1.2 急性心梗動物模型制作 Wistar 大鼠， 用10%水合氯醛( 按250mg/kg 劑量) 腹腔注射麻醉，無菌操作下氣管切開并插管，動物呼吸機輔助呼吸。 在第四、五肋間鈍性分離胸肌，暴露心臟，在左冠脈前降支中上1/3 處結(jié)扎，觀察到左室前壁心肌顏色變白，局部搏動變?nèi)?，心電圖有明顯ST 段弓背向上抬高，心肌梗死模型制作成功。 假手術(shù)組只穿過縫線而不結(jié)扎冠狀動脈。

1.3 給藥方法 實驗組在結(jié)扎同時予以芪參益氣滴丸0.135 g/kg 溶于5ml 生理鹽水灌胃，對照組和假手術(shù)組等量生理鹽水灌胃，3 組均每日1 次，連續(xù)給藥28d。 術(shù)后3 組均肌肉注射40 kU 青霉素預(yù)防感染。

1.4 心梗面積的測定 喂養(yǎng)4 周后處死大鼠，分別進行常規(guī)HE 染色和TTC 染色。 心肌梗死面積=左心室梗死區(qū)面積/左心室面積×100%。

1.4.1 HE 染色 取大鼠心尖部心肌組織，用液氮快速冷凍，置入10%的甲醛浸泡固定12h 后，沿左室長軸的中點行組織切片， 制作厚度4μm 的組織切片，去離子水沖洗1- 2min 后，蘇木精染色50s，再次用去離子水沖洗1-2 min 后，置入含1% HCl 的無水乙醇中固定30s，伊紅染色6-8s，去離子水沖洗1-2min 后，無水乙醇固定后石蠟包埋，取5 個不同視野觀察分析。

1.4.2 TTC 染色 將切片放入37℃預(yù)熱過的1%TTC 溶液中， 置于水浴恒溫振蕩器中，37℃避光振蕩染色20min，用4%甲醛液固定24 h，觀察染色結(jié)果。氯化三苯四唑（TTC 染色）肉眼觀察缺血區(qū)組織呈灰白色，正常組織呈磚紅色。

1.5 新生血管計數(shù) 經(jīng)Ⅷ因子免疫組化染色后，心肌組織切片，計算機圖像分析軟件處理，測量血管數(shù)目，即心肌梗死邊緣區(qū)有Ⅷ因子染色陽性，每張切片隨機觀察5 個視野(×200)，取均數(shù)，再根據(jù)測量窗面積可算出每平方毫米的血管數(shù)目即面密度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用 全部數(shù)據(jù)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行處理。計量資料以（x±s）表示，多組間兩兩間的比較采用多重比較方差分析，P＜0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織病理形態(tài)學(xué)觀察 實驗組大鼠心肌壞死改變明顯輕于對照組，排列較有序；對照組大鼠HE 染色病理改變明顯， 心肌細(xì)胞形態(tài)模糊，排列紊亂，有胞核固縮、溶解或消失，有炎性細(xì)胞浸潤；假手術(shù)組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞排列整齊。

2.2 心梗面積的測定 和假手術(shù)組相比，實驗組及對照組大鼠均可見左心室缺血區(qū)有透壁性梗死。染色后光鏡下可見梗死區(qū)內(nèi)纖維組織反應(yīng)性增生明顯， 但實驗組的梗死面積明顯小于對照組，2 組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 見表1。

表1 3 組心梗面積的比較

2.3 大鼠心肌梗死周邊區(qū)毛細(xì)血管密度變化 結(jié)果顯示:對照組、實驗組心肌毛細(xì)血管密度均顯著多于假手術(shù)組(P 均<0.05);與對照組比較, 實驗組心肌毛細(xì)血管密度顯著增加(P 均<0.05)。 表明芪參益氣滴丸可促進心肌梗死周邊區(qū)毛細(xì)血管密度增加。 見表2。

表2 大鼠心肌梗死面積、梗死周邊區(qū)毛細(xì)血管計數(shù)(±s)

表2 大鼠心肌梗死面積、梗死周邊區(qū)毛細(xì)血管計數(shù)(±s)

注:與假手術(shù)組比較aP<0.05；與對照組比較bP<0.05

組別 心肌梗死面積(%) 心肌毛細(xì)血管密度(條/0.2mm2)假手術(shù)組(n=10)對照組(n=10)實驗組(n=10)0 30.18±3.35 22.46±2.15b 1.25±0.32 3.46±0.35a 7.32±1.31ab

3 討論

心肌血管新生療法己成為一種新方法,對部分不接受手術(shù)治療的患者來說可能是一種新的希望[3]。近年來我國中醫(yī)藥在冠心病血管新生的研究中,積累了豐富的臨床經(jīng)驗。 很多研究發(fā)現(xiàn)一些中藥有促進血管新生的作用。 芪參益氣滴丸主要藥理成分有黃芪、丹參等，中醫(yī)常用于心絞痛的治療[4]。

Notch 信號通路在促進改善心肌缺血、誘導(dǎo)血管新生的過程中起重要作用， 對損傷心肌起修復(fù)作用。 有學(xué)者研究表明，在心肌梗死的大鼠中，通過上調(diào)Notch 信號通路，可以促進心肌存活和血管新生，改善心功能[5]。 有研究提示宣痹通瘀方可以通過調(diào)節(jié)Notch 含量來發(fā)揮改善心肌缺血的作用，考慮與中藥發(fā)揮益氣化瘀、 理氣通絡(luò)作用相關(guān)[6]。黃芪、 丹參配伍提取物可以有效上調(diào)VEGF 及其受KDR 的表達(dá)，從而促進心肌梗死大鼠心肌組織中血管新生作用[7]。 黃芪甲苷可部分通過調(diào)控蛋白激酶D1(PKD1)-組蛋白脫乙酰酶5(HDAC5)-血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 信號通路發(fā)揮促大鼠心肌梗死后心肌組織血管新生的作用[8]。 紅景天具有促進AMI 大鼠心肌血管新生的作用， 其機制可能與上調(diào)HIF-1a、HIF-18、VEGF 表達(dá)有關(guān)[9]。芪參膠囊能夠改善心肌梗死后大鼠的心功能， 減輕不利的心室重塑。 其機制與其抑制心肌細(xì)胞凋亡及促進血管新生有關(guān)。 AKT 信號通路的激活及MEK/ERK信號通路的抑制可能是芪參膠囊發(fā)揮保護作用的核心機制[10]。研究表明麝香保心丸可以促進心梗后大鼠的血管新生， 機制可能和通過上調(diào)20-HETE介導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞動員和VEGF 表達(dá)有關(guān)[11]。研究證實芪參益氣滴丸能減少大鼠心肌梗死面積，增加血管密度,增加mRNA 和VEGF、bFGF 的蛋白水平，PDGF-B 的mRNA 也增加[12]。還有研究表明：丹參素通過改善大鼠左室功能， 減少心梗面積來減輕心肌缺血； 缺血后新生血管形成和心肌梗死邊緣區(qū)的微血管密度增加，機制和VEGF、BFGF 的表達(dá)上調(diào)有關(guān)[13]。 在以上各種信號通路中，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號通路是目前研究最清楚的一個,VEGF 信號通路參與到血管新生整個過程,發(fā)揮了重要的作用。

我們實驗觀察到， 對照組大鼠心肌組織形態(tài)較紊亂，部分心肌細(xì)胞輪廓消失，壞死心肌組織呈現(xiàn)明顯的纖維化，血管不完整；實驗組觀察到新生的血管數(shù)量較對照組增多。 假手術(shù)組心肌細(xì)胞無明顯病理改變。 通過3 組心梗面積測量，3 組間的心梗面積有顯著差異，P<0.05。 實驗組的心梗面積顯著小于對照組，P<0.05。 結(jié)果表明芪參益氣滴丸有減少心梗面積的作用。 實驗組的血管面密度比心肌梗死組高， 說明心梗后有代償性血管新生發(fā)生。 結(jié)果表明芪參益氣滴丸對心肌梗死組比較有顯著血管新生作用，P<0.05。

芪參益氣滴丸具有刺激心肌缺血區(qū)新血管生成，建立有效的側(cè)支循環(huán)，能夠改善心肌缺血，減少心肌梗死面積的作用。 本研究表明芪參益氣滴丸有減少心肌梗死面積和促進血管新生的作用。本試驗為臨床治療心肌梗死的新方法提供實驗依據(jù)； 但是我們的不足之處是未對如何引起血管新生的機制進行更深入的研究。