胡佳莉，陳丕峰，葉萍，張小容

（1.九江學(xué)院附屬醫(yī)院，九江332000；2.江西省九江市婦幼保健院兒外科，九江332000）

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤， 隨著生活水平的提高，高脂高蛋白食物的攝入，結(jié)直腸癌在中國的發(fā)病率和致死率顯著提升， 已躍居第五位，嚴(yán)重威脅著人民的生命健康[1]。

導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生的原因尚不明確， 世界衛(wèi)生組織曾指出生活方式、 飲食或慢性炎癥是誘發(fā)結(jié)直腸癌的非常重要的危險(xiǎn)因素[2]。 近年來越來越多的研究顯示細(xì)胞周期過程中癌基因的激活和抑癌基因的失活以及一連串的信號(hào)通路的改變都可能造成細(xì)胞惡性增殖、 轉(zhuǎn)化從而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生[3]。 細(xì)胞周期素D1（CyclinD1）是重要的細(xì)胞周期的調(diào)控蛋白,調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1 期到S 期的轉(zhuǎn)化，完成對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控，是近年來確立的癌基因和原癌基因[4]。 表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR） 屬受體酪氨酸激酶家族成員，參與激活重要的細(xì)胞信號(hào)通路，介導(dǎo)細(xì)胞分化、遷移、侵襲等[5]。 而腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移仍然是結(jié)直腸癌患者預(yù)后差以及死亡的重要原因[6]。 血管內(nèi)皮生 長 因 子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）是促血管生成因子，是腫瘤新生血管形成及生長轉(zhuǎn)移的重要影響因素。 近年來應(yīng)用于結(jié)直腸癌的靶向藥物主要包括以EGFR 信號(hào)傳導(dǎo)通路為靶點(diǎn)的藥物（帕尼單抗、西妥昔單抗）和以VEGF為靶點(diǎn)（貝伐單抗）的2 類藥物，研究者發(fā)現(xiàn)，靶向藥物聯(lián)合化療較單一化療可得到更好地療效[7]。 而有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CyclinD1 可以作為晚期結(jié)直腸癌患者應(yīng)用西妥昔單抗的預(yù)后指標(biāo)[8]。 本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測結(jié)直腸癌中CyclinD1，EGFR 和VEGF 的表達(dá)，進(jìn)一步探討它們與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的診斷、治療及預(yù)后判斷提供參考指標(biāo)， 同時(shí)為結(jié)直腸癌的分子靶向藥物的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料收集 2016-2019 年九江學(xué)院附屬醫(yī)院病理科存檔的接受手術(shù)治療的80 例結(jié)直腸癌患者的石蠟標(biāo)本。 納入標(biāo)準(zhǔn)： ⑴無其他部位的原發(fā)腫瘤；⑵術(shù)前均未接受過放療和化療；⑶所有病例均經(jīng)組織學(xué)檢查明確確診為結(jié)直腸癌；⑷臨床資料、病理資料完整。 將距離腫瘤5cm 以外的正常的腸粘膜作為對(duì)照組。 納入研究的80 例結(jié)直腸癌患者中男47 例，女33 例，年齡22-92，中位年齡60 歲；發(fā)生在左半結(jié)腸和直腸57 例，右半結(jié)腸和橫結(jié)腸23 例。 根據(jù)WHO（2010）消化系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，其中低級(jí)別腺癌61 例，高級(jí)別腺癌19 例（低分化腺癌9 例，黏液腺癌10 例）；累及漿膜層及漿膜外（T3-T4）68 例，不超過肌層（T1-T2）12 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30 例，沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移50 例。

1.2 主要試劑 兔抗人單克隆CyclinD1 抗體（克隆號(hào)：EP12）購自北京中杉金橋公司，鼠抗人單克隆VEGF 抗體（克隆號(hào)：MAB-0243）、 鼠抗人單克隆EGFR 抗體（克隆號(hào)：MAB-0196）、即用型快捷免疫組化MaxVision 試劑盒及DAB 顯示試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 免疫組化 免疫組化染色采用Max Vision 法，參照試劑說明書操作。 步驟：4μm 厚石蠟切片常規(guī)脫蠟水化；EDTA 緩沖液高壓修復(fù)， 濃縮型一抗用抗體稀釋液稀釋，CyclinD1，EGFR、VEGF 的稀釋度均為1:100;4℃過夜，滴加二抗，DAB 顯色，復(fù)染，脫水，封固。 用PAS 液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 CyclinD1 蛋白是定位于胞核，EGFR 蛋白主要定位于細(xì)胞膜，VEGF 蛋白主要定位于細(xì)胞漿。使用雙盲法對(duì)IHC 結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。在正置顯微鏡下， 隨機(jī)挑出5 個(gè)高倍視野來數(shù)陽性個(gè)數(shù)，IHC 染色結(jié)果評(píng)分根據(jù)前人做法[9]，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)量所占百分比和染色顏色深淺進(jìn)行綜合評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為兩者相乘,再根據(jù)等級(jí)來評(píng)價(jià)結(jié)果。

評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：無陽性結(jié)果為0 分，1%-19%得1分，20%-50%得2 分，51%-100%得3 分；顏色深淺強(qiáng)度按細(xì)胞著色深淺：染不上色得0 分，淡黃得1分，棕黃得2 分，棕褐得3 分。 兩項(xiàng)得分相乘，(0-4分)就是低表達(dá)，判為陰性；（6-9 分)就是高表達(dá)，判為陽性。 染色結(jié)果由兩位副主任以上職稱的病理醫(yī)師共同閱片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)。 以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CyclinD1、VEGF 及EGFR 蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)結(jié)直腸癌組織中CyclinD1 的表達(dá)主要在細(xì)胞核，呈黃色至棕黃色顆粒（圖1）。 VEGF 主要定位在細(xì)胞漿（圖2）。 EGFR 主要定位在細(xì)胞膜（圖3）。 80 例結(jié)直腸癌組織中CyclinD1，VEGF 及EGFR 的陽性率分別為68.7%，66.2%，75%， 而癌旁正常組織對(duì)照組的陽性率為10%，28.7%，38.7%，CyclinD1、VEGF 及EGFR 蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

圖1 CyclinD1 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

圖2 VEGF 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

圖3 EGFR 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

2.2 CyclinD1、VEGF 及EGFR 蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌中，CyclinD1 的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05，表1），隨分級(jí)的增高和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量增多而增高，與性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位和浸潤深度無關(guān)（P>0.05）；VEGF 的表達(dá)與腫瘤發(fā)生部位、組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)， 與性別、 年齡和浸潤深度無關(guān)（P<0.05，表2）；EGFR 與性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位、 組織學(xué)分級(jí)、 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤深度均無關(guān)（P>0.05，表3）。

表1 CyclinD1 表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 CyclinD1、VEGF 及EGFR 蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 在CyclinD1 表達(dá)陽性的55 例結(jié)直腸癌組織當(dāng)中，EGFR 及VEGF 陽性表達(dá)例數(shù)分別是44 例（80%）與37 例（67.2%）；在CyclinD1陰性表達(dá)的25 例結(jié)直腸癌組織中，EGFR 及VEGF 陽性表達(dá)例數(shù)分別是16 例（64%）與16 例（64%）； 在CyclinD1 陽性表達(dá)的結(jié)直腸癌組織當(dāng)中EGFR 陽性表達(dá)率比EGFR 陰性表達(dá)的結(jié)直腸癌組織高，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，一定程度上可以認(rèn)為CyclinD1 和EGFR、VEGF 表達(dá)之間沒有明顯的相關(guān)性。 目前關(guān)于結(jié)直腸中CyclinD1、VEGF 和EGFR 的關(guān)聯(lián)研究有限，有待進(jìn)一步深入。

表2 VEGF 表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

表3 EGFR 表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

結(jié)直腸癌是發(fā)生在大腸的消化道腫瘤， 發(fā)病率和病死率有逐漸升高的趨勢，高危年齡為50-60歲，男女發(fā)病比例約為2-3:1。 結(jié)直腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著國人的健康。 根據(jù)第四版消化系統(tǒng)腫瘤WHO 分類，結(jié)直腸癌的組織病理學(xué)類型主要分為腺癌、 腺鱗癌、 梭形細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌和未分化癌，其中，腺癌又包括了幾個(gè)亞型，如篩狀粉刺型腺癌、髓樣癌、微乳頭狀癌、 黏液腺癌、 鋸齒狀腺癌和印戒細(xì)胞癌， 超過90%的結(jié)直腸癌為腺癌。 第四版WHO 分類在分級(jí)上還提出以腺體形成比例為基礎(chǔ)， 傳統(tǒng)上將結(jié)直腸癌腺癌分為高、中、低分化和未分化。 臨床更多使用低度惡性及高度惡性， 因?yàn)楦叻只椭蟹只侔┥飳W(xué)相似，且重復(fù)性好[10]。 因此結(jié)合生物學(xué)行為和臨床特點(diǎn)我們將高分化和中分化腺癌歸為低級(jí)別腺癌， 而低分化腺癌和黏液腺癌歸為高級(jí)別腺癌。

目前， 對(duì)于結(jié)直腸癌的傳統(tǒng)治療方式包括以手術(shù)切除為主再輔以化療的綜合治療。 而對(duì)于高級(jí)別癌和某些已經(jīng)發(fā)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌病人來說，預(yù)后很差，傳統(tǒng)的治療方式預(yù)后仍不容樂觀。 近年來，隨著分子靶向治療用于臨床，已經(jīng)應(yīng)用的治療結(jié)直腸癌的靶向藥物主要有抗血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的藥物，如貝伐珠單抗；抗表皮生長因子受體（EGFR）的藥物，如西妥昔單抗，靶向藥物聯(lián)合傳統(tǒng)的傳統(tǒng)的化療在很大程度上改善了結(jié)直腸癌患者的總生存期， 然而靶向藥物的局限性也越來越被發(fā)現(xiàn)， 例如貝伐單抗和西妥昔單抗僅僅對(duì)KRAS 野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌有效，而對(duì)于這兩類靶向藥物的選擇目前沒有定論[6]。 這就說明了還要其他方面的因素影響著靶向藥物的療效[11]。

CyclinD1 是細(xì)胞周期蛋白Cyclin 家族成員之一，廣泛存在于真核細(xì)胞中，是高度保守的細(xì)胞周期家族蛋白。 CyclinD1 的編碼基因定位在11q13上，包含5 個(gè)外顯子，全長約15kb。 CyclinD1 可以和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶cyclin-dependent kinase（CDKs）結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1 到S 期的轉(zhuǎn)化[4]。 在許多腫瘤中，如食管鱗狀細(xì)胞癌，子宮內(nèi)膜腺癌，乳腺癌，胸腺瘤,膀胱癌等均有過表達(dá)[12-14]。徐慧敏等[15]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示cyclinD1 蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)率為68.3%（41/60）顯著高于正常組織中，其陽性率與浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移和dukes分期相關(guān)。 而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在結(jié)直腸癌組織中CyclinD1 的表達(dá)率68.7%（55/80）高于癌旁正常組織， 與組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān) （P<0.05）,與性別、年齡、腫瘤部位、浸潤深度無關(guān)，結(jié)果基本是相符合的。 分化程度低且存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中陽性率較高， 提示CyclinD1 的表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。

VEGF 是一種重要的促血管生成因子，可以通過血管內(nèi)皮上的受體（VEGFR）介導(dǎo)的受體信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。 VEGF在腫瘤組織中表達(dá)水平增高， 提示它促進(jìn)腫瘤血管的生成，進(jìn)而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 谷化平等[16]研究發(fā)現(xiàn)VEGF 表達(dá)陽性率為66.3%，高于正常腸黏膜組織，并隨著Dukes 分期增高、漿膜浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移， 其表達(dá)水平亦隨著顯著性增高。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在結(jié)直腸癌組織中VEGF的表達(dá)率66.2%，高于癌旁正常黏膜組織，與腫瘤的部位，組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與浸潤深度無關(guān)，這個(gè)結(jié)果跟李文婷[17]研究的結(jié)果基本一致。 近年來在結(jié)直腸癌的治療方面，很多研究關(guān)注左右半結(jié)腸癌靶向治療的差異上， 治療結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)抗VEGF 靶向藥貝伐珠單抗高度依賴于原發(fā)瘤部位[18]，研究者在比較貝伐珠單抗和EGFR 單抗時(shí)發(fā)現(xiàn)在右半結(jié)腸癌， 一線使用貝伐珠單抗療效更優(yōu)[19]。我們的結(jié)果顯示VEGF 的表達(dá)升高與腫瘤部位有關(guān)，且右半結(jié)腸陽性率高于左半結(jié)腸，這為臨床篩選靶向藥適應(yīng)的病人提供了理論依據(jù)，對(duì)于實(shí)施個(gè)體化治療有十分重要的意義。

EGFR 是酪氨酸激酶I 型受體家族成員之一，位于人體第7 號(hào)染色體的短臂， 含有28 個(gè)外顯子。 一些文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中EGFR 過度表達(dá)，與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[20]，但也有文獻(xiàn)提出了不同的觀點(diǎn)認(rèn)為EGFR 表達(dá)和臨床病理特征之間是否具有聯(lián)系,具有何種聯(lián)系仍然存在爭議。 我們的結(jié)果顯示EGFR 表達(dá)水平與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分期分級(jí)和類型無顯著相關(guān)性這與王文聞[21]的結(jié)果一致?？笶GFR 靶向藥物例如西妥昔單抗只對(duì)野生KRAS 患者有效， 明確KRAS 基因的突變狀態(tài)對(duì)結(jié)直腸癌的治療有重要意義。 但是，僅僅依靠KRAS 基因狀態(tài)并不能完美的預(yù)測抗EGFR 靶向藥物的療效,研究者推測可能存在如EGFR 信號(hào)通路BRAF、PIK3CA突變等[7]。

結(jié)直腸癌作為常見的惡性腫瘤之一， 它的治療一直備受關(guān)注，大約1/3 的腫瘤被認(rèn)為是EGFR依賴型， 如何篩選出對(duì)EGFR 敏感的患者是癌癥精準(zhǔn)治療的重要內(nèi)容，zhang,W 等人發(fā)現(xiàn)CyclinD1可以作為晚期結(jié)直腸癌患者應(yīng)用抗EGFR 單抗的預(yù)后指標(biāo)[8]，這就提示我們CyclinD1 可能跟EGFR之間存在某種聯(lián)系， 但是很可惜本實(shí)驗(yàn)利用Spearman 等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)沒有檢測到兩個(gè)蛋白在結(jié)直腸中具有相關(guān)性聯(lián)系。 但是我們也發(fā)現(xiàn)在CyclinD1 陽性表達(dá)的結(jié)直腸癌組織當(dāng)中EGFR 陽性表達(dá)率比EGFR 陰性表達(dá)的結(jié)直腸癌組織高。這也提示我們CyclinD1 可能對(duì)結(jié)直腸癌組織中EGFR 的表達(dá)起促進(jìn)作用。 在今后臨床使用EGFR靶向藥時(shí)， 檢測CyclinD1 蛋白的表達(dá)可能有助于篩查對(duì)EGFR 敏感的患者。 眾所周知，免疫組化染色被廣泛用于研究， 但它始終是一種半定量的實(shí)驗(yàn)方法，具有一定的不精確性，收到觀察者主觀感受的影響，因此，可能需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本或者蛋白定量實(shí)驗(yàn)來探尋CyclinD1、VEGF 和EGFR 之間的關(guān)系。