白 松 吳 斌

中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院 泌尿外科（遼寧沈陽 110004）

前 言

先天性雙側(cè)輸精管缺如 （Congenital bilateral absence of the vas deferens,CBAVD,OM IM 277180） 是導致男性不育的重要原因[1]，約占男性不育的2%～6%，占梗阻性無精子癥的25%， 是常見的常染色體隱性遺傳疾病，發(fā)病率為1/1000。 臨床一般表現(xiàn)為雙側(cè)輸精管缺如、精液量減少、精囊及附睪尾發(fā)育不良或缺失[2]。 目前的治療方法主要為經(jīng)附睪或睪丸取精聯(lián)合卵泡漿內(nèi)單精子注射（ICSI）技術(shù)以達到生育目的。

CFTR 基 因 （Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator,OM IM 602421）編碼一種ATP 依賴的跨膜蛋白，具有介導氯離子、碳酸氫根離子和水分子進行跨膜轉(zhuǎn)運的功能，在呼吸道、消化道和生殖道的上皮細胞多有表達。CFTR 基因突變可以導致CBAVD 的發(fā)生，但是CFTR 基因突變對CBAVD 患者睪丸生精功能是否造成影響， 相關(guān)研究較少而且一直備受爭議，CFTR 蛋白在睪丸組織中的表達情況也未見報道。

本研究通過對66 例CBAVD 患者的睪丸穿刺組織行CFTR 蛋白免疫組化檢測和睪丸生精功能評價，旨在探索我國CBAVD 患者睪丸組織中CFTR 蛋白的表達與睪丸生精功能的關(guān)系。

材料和方法

一、標本收集

2008 年8 月至2014 年1 月在盛京醫(yī)院就診的66名CBAVD 患者為實驗組； 實驗組標本來自睪丸穿刺活檢術(shù)，本實驗經(jīng)過盛京醫(yī)院倫理委員會批準，所有入組患者均簽署知情同意書。CBAVD 患者納入標準[3]：1.觸診雙側(cè)精索未觸及輸精管，睪丸大小正常（Prader 睪丸模型＞12m L）， 兩名?？漆t(yī)師同時查體；2. 無囊性纖維化其它癥狀，排除慢性胰腺炎和慢性阻塞性肺疾病等；3.精液分析檢查至少3 次，無精子，射精后尿液沉淀后也未見精子以除外逆行射精， 精液量＜1.5m L，PH＜6.4，精漿果糖＜13umol/m l 和ɑ-糖苷酶＜20umol/m L；4. 超聲示附睪頭飽滿，呈網(wǎng)格狀，可伴有附睪尾和精囊的缺失或發(fā)育不良；5. 性激素水平正常；6. 染色體正常；7. 行TESE-ICSI 輔助生殖；8.無家族遺傳疾病。

二、取材、石蠟包埋和免疫組化實驗方法

取材：術(shù)區(qū)消毒鋪無菌單，局麻成功后，使用18G穿刺活檢針（Bard，美國）取睪丸組織2 條，大小約0.5×0.08cm，將其中1 條組織進行石蠟包埋；固定：4%多聚甲醛固定24h；沖洗：流水沖洗24h；脫水和透明：80%乙醇2h →90%乙醇2h →95%乙醇40min →無水乙醇40m in →二甲苯10m in →二甲苯10m in；浸蠟：軟蠟1h→軟蠟1h→硬蠟1h；包埋：生物組織包埋機包埋，制成蠟塊；石蠟切片，厚度3um，然后放入烤箱65℃，4h；常規(guī)脫蠟，水化：二甲苯20min →二甲苯20min →無水乙醇10min →95%乙醇10min →90%乙醇10min →80%乙 醇10min；3%H2O2孵 育10m in，PBS 沖 洗，3 次×3min；高溫高壓抗原修復3min，自然冷卻；滴加1:400稀釋的CFTR 兔抗人多克隆抗體 （RLTO888， 睿瀛生物， 中國），4℃放入濕盒內(nèi)過夜；PBS 沖洗，3m in×3 次，滴加HRP 辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔多克隆抗體 （PV-6000 18m l， 北京中杉金橋， 中國），37℃孵育30m in；PBS 沖洗，3m in×5 次，DAB 顯色劑顯色，結(jié)合顯微鏡檢查（E800 Nikon，日本），3-5m in，顯色合格后自來水沖洗終止染色；蘇木素復染3min；流水充分沖洗反藍10m in；脫水，二甲苯透明：80%乙醇10m in →90%乙醇10m in →95%乙醇10min →無水乙醇10min →二甲苯20m in →二甲苯20min；中性樹膠封片。

陽性對照使用附睪組織， 空白對照用PBS 替代CFTR 兔抗人多克隆抗體。

三、免疫組化結(jié)果判定標準

使用Nikon E800 顯微鏡及NIS-Elements F4.3 軟件采集圖像。 CFTR 蛋白免疫組化結(jié)果判定標準：兩名病理科醫(yī)師同時單獨閱片， 對于有爭議的結(jié)果討論后再決定，每個標本觀察5 個20×10 高倍視野，計數(shù)陽性細胞占整個視野的百分比：≦5%、5-25%、26-50%、51-75%和76-100%分別記錄為0、1、2、3 和4 分； 著色程度：無著色、淡黃、棕黃和棕褐色分別記錄為0、1、2 和3 分，兩者相乘結(jié)果為最后得分， 根據(jù)得分：0、1-4 分、5-8 分和9-12 分分別記錄為陰性-、弱陽性+、陽性++和強陽性級+++。

四、睪丸生精功能障礙Johnsen 評分標準

10 分：精子發(fā)生功能完整，精子放出正常；9 分：精子發(fā)生功能減低，精子放出少見；8 分：精子發(fā)生功能減低，精子放出不可見；7 分：精子細胞分化障礙，多數(shù)未成熟的精子細胞；6 分：精子細胞分化障礙，少數(shù)未成熟的精子細胞；5 分：初級精母細胞成熟受阻，多數(shù)初級精母細胞；4 分：初級精母細胞成熟受阻，少數(shù)初級精母細胞；3 分：精原細胞阻滯；2 分：唯支持細胞綜合征；1 分：生殖道萎縮。

五、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用SPSS 22.0 軟件，Kendall'tau-b 相關(guān)系數(shù)，P＜0.05 認為有意義。

結(jié) 果

一、免疫組化結(jié)果

CFTR 蛋白在睪丸支持細胞和生精細胞內(nèi)均有表達，著色主要位于細胞漿及細胞膜，具體見圖1。

圖1 CFTR 蛋白免疫組化在睪丸組織中的表達

二、CBAVD 患者睪丸組織CFTR 蛋白表達情況

CBAVD 患者CFTR 蛋白在睪丸生精上皮及支持細胞的表達強陽性、 陽性、 弱陽性和陰性分別為：5(7.59%)、33(50.00%)、25(37.87%)和3(4.54%)。

三、CBAVD 患者睪丸生精功能評分

CBAVD 組患者睪丸生精Johnsen 評分7-10 分的比例分別為3 (4.45%)、27 (40.9%)、28 (42.42%) 和8(12.23%)。

四、CFTR 蛋白表達與睪丸生精功能評分的相關(guān)性

Kendall'tau-b 等級相關(guān)分析顯示，睪丸內(nèi)CFTR 蛋白表達水平與生精功能呈強正相關(guān)性，CBAVD 組Kendall'tau-b=0.785，P＜0.01。

討 論

1989 年Riordan 等首先克隆了CFTR 基因的cDNA 片段并鑒定了其產(chǎn)物CFTR 蛋白[4]， 該基因位于7q31.2[5]，全長250kb，有27 個外顯子，mRNA 序列長度6128bp，編碼CFTR 蛋白，由1480 個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為168kDa[6]。

CFTR 蛋白屬于cAMP 依賴的跨膜蛋白質(zhì)[7]，位于上皮細胞頂膜， 主要為氯離子跨上皮運動提供選擇性通道，此外對鈉離子、碳酸氫鹽和水分子的跨膜流動也具有重要的作用。 廣泛分布于呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和汗腺等組織中， 以維持人體的電解質(zhì)平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。 根據(jù)CFTR 蛋白缺失的程度可以有不同的臨床表型，包括囊性纖維化（OM IM 219700,cystic fibrosis,CF）、 高氯性的汗液分泌、 彌散性支氣管擴張（OM IM 211400）、CBAVD 和急性或慢性反復復發(fā)性胰腺炎（OM IM 167800）等[8]。

精子的發(fā)生非常復雜， 由多潛能干細胞經(jīng)減數(shù)分裂最后發(fā)育成精子，受到卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)和雄激素(T)等多種激素的調(diào)節(jié)，這一過程發(fā)生在睪丸曲細精管及支持細胞內(nèi)。CFTR 蛋白在人類生殖系統(tǒng)有表達，可能對睪丸的生精微環(huán)境有重要作用，但是CBAVD 患者睪丸生精功能是否受到影響， 研究較少而且一直備受爭議，因為研究結(jié)果大相徑庭，從正常到嚴重的無精癥均有報道[9,10]。

Li 等[11]研究發(fā)現(xiàn)CBAVD 患者睪丸內(nèi)精子細胞頭部畸形，線粒體鞘缺失和頂體內(nèi)陷，支持細胞內(nèi)降解小體增多，細胞之間連接疏松。 Hui 等[12]在敲除CFTR 基因小鼠的睪丸中，發(fā)現(xiàn)生精細胞停止更新，最終會導致唯支持細胞綜合征， 認為CFTR 基因可能是通過HCO3-/sAC/cAMP/CREB 通路和NF-kB/COX-2/PGE2通路來調(diào)節(jié)睪丸生精功能。Lu 等[13]研究也發(fā)現(xiàn)CBAVD患者行輔助生殖時伴有更高的失敗風險。

目前在CBAVD 患者中，CFTR 基因突變在導致CBAVD 的同時，是否會影響睪丸的生精功能以及睪丸組織內(nèi)CFTR 蛋白的表達情況未見相關(guān)研究。

本研究首次報道了我國CBAVD 患者睪丸內(nèi)CFTR 蛋白的表達情況及睪丸生精功能情況。免疫組化結(jié)果顯示CFTR 蛋白可同時表達于睪丸內(nèi)的支持細胞及曲細精管的生精上皮細胞， 著色主要位于細胞漿和細胞膜。CFTR 蛋白在睪丸生精上皮及支持細胞的表達以陽性和弱陽性為主，約占87.87%（58/66），且有3 例為陰性。 這表明部分CBAVD 患者睪丸內(nèi)生精上皮及支持細胞的CFTR 蛋白表達下降，而CFTR 蛋白是重要的離子和液體通道， 對睪丸生精功能非常重要， 所以CFTR 蛋白表達的減少也可能會對CBAVD 患者的睪丸生精功能造成傷害。

CBAVD 患者中睪丸生精Johnsen 評分8 分及以下的生精功能障礙患者比例達45.45%（30/66）， 甚至有3例患者僅為7 分，睪丸內(nèi)未見精子，導致無法行輔助生殖。 同時本研究也發(fā)現(xiàn)CFTR 蛋白在睪丸組織中的表達與生精功能 Johnsen 評分有強正相關(guān)性，Kendall'tau-b 等級相關(guān)系數(shù)為0.785。 這表明CFTR 蛋白在睪丸組織中表達水平下降可能是影響睪丸生精功能的原因之一。

可見CFTR 基因在多個方面廣泛的影響著男性生育，不僅會導致雙側(cè)輸精管缺如，同時還會引起睪丸內(nèi)CFTR 蛋白表達的減少，進而對睪丸的生精功能造成影響，這對睪丸取精行ICSI 輔助生殖技術(shù)來說是一個挑戰(zhàn)。

結(jié)論

CBAVD 患者睪丸內(nèi)的CFTR 蛋白表達以陽性和弱陽性為主， 可表達于睪丸內(nèi)支持細胞及生精上皮細胞，以細胞膜和細胞漿為主；部分CBACD 患者存在生精功能障礙，CFTR 蛋白在睪丸組織中的表達水平與生精功能存在強正相關(guān)性。