胡誼容 田松明 趙福容

喉癌是我國(guó)最常見的頭頸部腫瘤之一[1]，喉癌的生存率、無(wú)癌生存期及喉功能的保留在很大程度上與喉癌診斷時(shí)所處的臨床分期密切相關(guān)[2]。早期喉癌5 年生存率較高，部分地區(qū)可達(dá)80%以上[3]。雖然近年喉癌在診治方面取得了長(zhǎng)足發(fā)展，但是其復(fù)發(fā)率仍然較高，術(shù)后復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致喉癌治療失敗的主要原因，同時(shí)也是影響患者預(yù)后的主要因素[4]。有研究顯示，血小板活化狀態(tài)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中血小板粘附因子和釋放物質(zhì)起到了關(guān)鍵作用[5]。血小板表面血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa 纖維蛋白原受體（platelet membrane glycoprotein Ⅱb/Ⅲa fibrin original receptor, PAC-1）和血小板P-選擇素（platelet P-selectin, CD62P）分別是血小板早期和晚期活化標(biāo)志物，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與血小板結(jié)合，刺激新生血管的形成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的種植、轉(zhuǎn)移、侵襲等[6]。但是鮮少見有研究分析PAC-1 和CD62P 與喉癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。本文擬通過對(duì)比喉癌患者和健康受試人群PAC-1和CD62P 表達(dá)的差異，結(jié)合患者的臨床病理特征和術(shù)后隨訪資料，以明確PAC-1 和CD62P 與喉癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的相關(guān)性?，F(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

1 一般資料

選擇2014 年1 月～2015 年12 月間在我院耳鼻咽喉科手術(shù)治療的116 例喉癌患者為實(shí)驗(yàn)組，其中男性101 例，女性15 例；年齡42～71 歲，平均（56.6±5.9）歲。按2012 年UICC 進(jìn)行臨床分期：I 期24 例，II 期41 例，III 期35 例，IV 期16 例，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移31 例，復(fù)發(fā)19 例。所有患者均經(jīng)喉部、頸部CT 及電子喉鏡檢查。入選標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)確診為鱗狀細(xì)胞癌；②術(shù)前未接受化療、放療或其他抗腫瘤治療；③患者簽署知情同意書。排除合并其他惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)、心腦血管疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全、急慢性感染者。另外選取同時(shí)期我院健康體檢者60 例作為對(duì)照組（與入組患者年齡、性別構(gòu)成相匹配），其中男性52 例，女性8 例，年齡42～67歲，平均（54.2±7.4）歲。兩組一般資料比較，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），具有可比性。

2 方法

2.1 標(biāo)本收集

所有患者抽取晨起空腹靜脈血5ml，收集到EDTA 抗凝試劑管中。以德國(guó)Hermle Z200A 小型離心機(jī)低速離心（3000r/min）15min，離心半徑10cm，離心后提取富含血小板血漿2ml 置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PAC-1 和CD62P 檢測(cè)

采用流式細(xì)胞術(shù)通過單抗免疫熒光標(biāo)記測(cè)定特異性熒光抗體結(jié)合血小板陽(yáng)性率來(lái)檢測(cè)PAC-1和CD62P 的表達(dá)水平。首先將富含血小板的血漿10μL 以及10μL CD61-PerCP、FITC-PAC-1、PECD62P 單克隆抗體（購(gòu)自法國(guó)Immunotech 公司）加入實(shí)驗(yàn)試管中，另加富含血小板的血漿10μL、FITC/PE 標(biāo)記的IgG（購(gòu)自法國(guó)Immunotech 公司）同型對(duì)照管，兩試管中各加入PBS 液30μl 混勻,室溫避光保存20min 后以1%多聚甲醛PBS 液固定。采用流式細(xì)胞儀（美國(guó)Coulter 公司）檢測(cè)，光源為488nm氦氖激發(fā)光，開始前以前向角、側(cè)向角的散射光信號(hào)對(duì)血小板群設(shè)門，同型對(duì)照作為陰性群，每次檢測(cè)10000 個(gè)血小板，結(jié)果以血小板表面表達(dá)PAC-1或CD62P 的陽(yáng)性百分率表示。

3 隨訪

116 例患者均建立病例隨訪檔案，術(shù)后對(duì)腫瘤組織進(jìn)行病理檢查，每3 個(gè)月通過電話或門診隨訪，記錄復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移情況，隨訪≥2 年，未有患者死亡，隨訪率為100%。隨訪至2018 年9 月30 日。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)均錄入SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間的比較采用方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較以SNK-q 檢驗(yàn)。采用單因素和多因素Logistics 回歸模型分析影響喉癌患者復(fù)發(fā)的因素。P<0.05 表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 兩組受試對(duì)象PAC-1 和CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率比較

喉癌患者的PAC-1 和CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率分別為（17.82±1.76）%和（22.87±3.13）%，明顯高于健康人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而且經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，實(shí)驗(yàn)組患者PAC-1 表達(dá)和CD62P 表達(dá)呈正相關(guān)性（r=0.238，P<0.05）。見表1、圖1。

表1 兩組PAC-1 和CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率比較（±s）

表1 兩組PAC-1 和CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率比較（±s）

組別 例數(shù)（n） PAC-1(%) CD62P(%)實(shí)驗(yàn)組 116 17.82±1.76 22.87±3.13對(duì)照組 60 3.79±0.54 18.31±1.95 t-60.227 10.291 P 值 - 0.000 0.000

2 喉癌患者PAC-1、CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率與患者病理特征的關(guān)系

喉癌患者的PAC-1 和CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率與患者腫瘤的T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N 分期）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，T 分期和N 分期越高，PAC-1 和CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。另外遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組PAC-1 和CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移組，差異亦存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。喉癌患者PAC-1 和CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率與性別、年齡、臨床分型、分化程度無(wú)關(guān)（P>0.05）。見表2。

表2 116 例喉癌患者PAC-1、CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率與臨床病理特征的關(guān)系

3 喉癌患者PAC-1、CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率與喉癌復(fù)發(fā)的關(guān)系

隨訪期間有24 例患者復(fù)發(fā)，92 例患者未復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為20.69%。復(fù)發(fā)喉癌患者PAC-1、CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率分別為（17.02±0.85）%和（21.84±1.17）%，明顯高于未復(fù)發(fā)的喉癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。另外局部復(fù)發(fā)患者、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者PAC-1、CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見表3。

表3 喉癌患者PAC-1、CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率與復(fù)發(fā)的關(guān)系

4 單因素和多因素Logistic 回歸分析PAC-1 和CD62P 與喉癌復(fù)發(fā)的關(guān)系

以本研究中喉癌患者中性別、年齡、臨床分型、分化程度、T 分期、N 分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及PAC-1、CD62P 指標(biāo)作為自變量，以復(fù)發(fā)（局部復(fù)發(fā)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）進(jìn)行單因素和多因素Logistic回歸分析，T 分期、N 分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、PAC-1 和CD62P 是喉癌復(fù)發(fā)的獨(dú)立影響因素（P<0.05）。見表4。

表4 單因素和多因素Logistic 回歸分析PAC-1和CD62P 與喉癌復(fù)發(fā)的關(guān)系

討論

吸煙、飲酒、空氣污染、病毒感染、長(zhǎng)期接觸石棉、芥子氣、鎳等化學(xué)物質(zhì)以及慢性炎癥等是喉癌發(fā)生最主要的危險(xiǎn)因素[7]。與其他腫瘤一樣，喉癌是由上述多種環(huán)境因素和遺傳因素協(xié)同作用所致，是一種多基因參與、多階段的復(fù)雜病理過程[8]。目前臨床上主要采取手術(shù)和放化療手段，但是大量資料證實(shí)，喉癌血行和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率占初診患者的20%左右，在死亡患者中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率更是高達(dá)65%以上[9]。因此如何預(yù)測(cè)患者預(yù)后，并選擇合理的治療方案具有重要的臨床價(jià)值。目前許多血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)廣泛應(yīng)用于喉癌的早期診斷及預(yù)后判斷，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)血小板活化與腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)密切相關(guān)[10]。

有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞可通過釋放炎性因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等誘導(dǎo)血小板活化，而活化的血小板表面糖蛋白通過與腫瘤細(xì)胞結(jié)合形成血小板-腫瘤細(xì)胞復(fù)合物，從而為腫瘤細(xì)胞的脈管浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移提供了病理?xiàng)l件[11]。PAC-1 是血小板膜表面表達(dá)最為豐富的糖蛋白分子，屬于細(xì)胞表面粘附蛋白受體。血小板被激活后，PAC-1 的分子構(gòu)型發(fā)生改變，從而介導(dǎo)活化血小板上GPⅡb/Ⅲa 與纖維蛋白原結(jié)合，是引起血小板聚集的關(guān)鍵因子[12]。CD62P 又稱為血小板依賴性顆粒膜表面膜蛋白（PADGEM），同樣也是粘附分子家族的成員之一，參與血小板的粘附和聚集過程，其分子結(jié)構(gòu)為高度糖基化的單鏈跨膜蛋白，主要由血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并儲(chǔ)存于血小板的α 顆粒和內(nèi)皮細(xì)胞的Weibel-Palade 小體內(nèi)[13]。血小板活化后可迅速導(dǎo)致PAC-1 和CD62P表達(dá)升高，其配體多為寡糖基團(tuán)，如sialyl lewis x,sialyl lewis a, PSGL-1 等；腫瘤細(xì)胞表面可大量表達(dá)s-lewis x, s-lewis a 等寡糖，因此PAC-1 和CD62P可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與活化內(nèi)皮細(xì)胞的粘附并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞穿越血管壁，從而參與腫瘤細(xì)胞的血行轉(zhuǎn)移。Qi 等[14]學(xué)者證實(shí)，激活的血小板在CD62P 的介導(dǎo)下，可與結(jié)腸癌、小細(xì)胞肺癌的結(jié)合并聚集在腫瘤細(xì)胞周圍，降低腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力，從而為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供必不可少的條件。本研究也發(fā)現(xiàn)，喉癌患者的PAC-1、CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于健康人群。可能與升高的TNF-α 刺激血小板及內(nèi)皮細(xì)胞活化，α 粒和Weibel-Palade 小體迅速與質(zhì)膜融合，高表達(dá)PAC-1 和CD62P 有關(guān)。另外喉癌患者PAC-1 和CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率與患者腫瘤的T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N 分期）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。T 分期和N 分期越高，PAC-1 和CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率越高，同樣遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組患者PAC-1 和CD62P陽(yáng)性表達(dá)率高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移組，這與其他相關(guān)腫瘤中報(bào)道的一致，表明喉癌患者體內(nèi)存在血小板活化，可能與喉癌細(xì)胞可分泌大量細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、基質(zhì)金屬蛋白酶等特殊物質(zhì)從而促使血小板表面大量表達(dá)粘附因子有關(guān)。除此以外，Huang 等[15]還發(fā)現(xiàn)血小板GPⅡb/Ⅲa 受體拮抗劑精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽可通過抑制血小板-腫瘤細(xì)胞復(fù)合物的形成，從而抑制大鼠肺鱗狀細(xì)胞癌株的轉(zhuǎn)移?；谏鲜鏊幚碜饔梅治?，我們進(jìn)一步對(duì)比了復(fù)發(fā)患者和未復(fù)發(fā)患者PAC-1 和CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率的差異。結(jié)果也證實(shí)PAC-1 和CD62P 高表達(dá)與喉癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

綜上所述，PAC-1 和CD62P 陽(yáng)性表達(dá)率與喉癌患者T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時(shí)可作為喉癌局部復(fù)發(fā)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo)。