漆愛明毛麗秋，肖樹雄，余 燕

(1.廣東省藥品檢驗(yàn)所，中國(guó) 廣州 510300；2.湖南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，中國(guó) 長(zhǎng)沙 410081)

隨著人們生活水平的不斷提高，化妝品已成為日常生活中必不可少的消費(fèi)品。在化妝品的生產(chǎn)、使用和保存過(guò)程中，為免受致病性和非致病性微生物污染，化妝品生產(chǎn)企業(yè)會(huì)添加各類防腐劑，這不僅可以延長(zhǎng)保質(zhì)期和貨架期，還能確保產(chǎn)品的安全性。但研究表明，長(zhǎng)期使用含高濃度防腐劑的化妝品會(huì)引起過(guò)敏性和接觸性皮炎等一系列副作用[1，2]，甚至致癌[3-5]。

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)中對(duì)我國(guó)允許使用的 51 項(xiàng)防腐劑進(jìn)行了限量規(guī)定，收載了11個(gè)檢測(cè)方法，涵蓋19類24種化合物的測(cè)定[6]。用于化妝品中防腐劑的檢測(cè)方法有分光光度法、氣相色譜法[7-9]、液相色譜法[10-12]、氣相色譜-質(zhì)譜法[13,14]、液相色譜-質(zhì)譜法等。同時(shí)測(cè)定氯己定、芐氯酚、氯二甲酚、o-苯基苯酚和p-氯-m-甲酚5種限用防腐劑的方法未見報(bào)道。從近年化妝品檢驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，我國(guó)化妝品中防腐劑的檢出率高，為加強(qiáng)對(duì)化妝品的衛(wèi)生監(jiān)督和日常管理，有必要研究化妝品中防腐劑含量的快速檢測(cè)方法。本文擬采用高效液相色譜法和高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀法建立對(duì)化妝品中5 種防腐劑的快速測(cè)定方法，并分別用于檢測(cè)非蠟質(zhì)和蠟質(zhì)類兩類化妝品。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜：Agilent 1200高效液相色譜儀配二極管陣列檢測(cè)器； 液質(zhì)聯(lián)用儀：Agilent Technologies 6430 Triple QUAD LC/MS； Mettler Toledo XS205 和 Sartorius CPA224S電子天平；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器； PB-10 pH計(jì)；LG10-2.4 A離心機(jī)；渦流振蕩器(美國(guó)IFA 公司)。芐氯酚(東京化成工業(yè)株式會(huì)社，C0161)，p-氯-m-甲酚(Acros Organics,BE,109480050)，氯己定(Dr. Ehrenstorfer GmbH，C 11310000)，o-苯基苯酚(Dr. Ehrenstorfer GmbH，C 16070000)，氯二甲酚(東京化成工業(yè)株式會(huì)社，C0161)標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于96%)；甲醇和四氫呋喃(色譜純，德國(guó)Merck 公司)，甲酸(色譜純)，乙酸銨(色譜純)，乙腈(色譜純)，實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水。

1.2 液相色譜和液質(zhì)測(cè)定條件

液相色譜測(cè)定條件：色譜柱: Kromasil 100-5 C18柱，250 mm×4.6 mm×5 μm；流動(dòng)相：甲醇(C相)和0.025 mol/L磷酸二氫鈉水溶液(D相，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.8)，采用梯度洗脫，洗脫程序：0～10 min，55%～65%(C)，45%～35%(D)；10～15 min，65%～80%(C)，35%～20%(D)；15～20 min，80%～90%(C)，20%～10%(D)；20～22 min，90%～55%(C)，10%～45%(D)；22～26 min，55～55%(C)，45～45%(D)。流速1.0 mL/min; 柱溫: 25 ℃; 檢測(cè)器掃描范圍210～400 nm; 進(jìn)樣量10 μL; 采用外標(biāo)法定量。

氯己定液質(zhì)測(cè)定條件：色譜柱：資生堂SPOLAR C18，250 mm×4.6 mm×5 μm；流動(dòng)相：0.1%甲酸甲醇，0.1%甲酸水溶液(體積比80∶20)，等度洗脫，流速：0.2 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；離子化模式：電噴霧正離子化(ESI+)；霧化氣：氮?dú)猓?41 379.3 Pa(35 psi)；干燥氣：氮?dú)猓魉?0 L/mim，溫度350 ℃；噴霧電壓：4 kV；碰撞氣：氮?dú)猓粰z測(cè)模式：MRM模式，檢測(cè)條件見表1。

p-氯-m-甲酚、o-苯基苯酚、氯二甲酚、芐氯酚液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18，2.1×100 mm×1.8 μm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；流動(dòng)相：乙腈(B相)和0.2%乙酸銨、0.2%乙酸混合液(D相)；梯度洗脫，流速：0.3 mL/min；梯度洗脫程序：0～4 min，60%～90%(B),40%～10%(D)；4～5 min，90%～90%(B)，10%～10%(D)；5～7 min，90%～60% (B)，10%～40%(D)。離子化模式：電噴霧負(fù)離子化(ESI-)；霧化氣：氮?dú)猓?41 379.3 Pa(35 psi)；干燥氣：氮?dú)?，流?2 L/mim，溫度350 ℃；噴霧電壓：4 kV；檢測(cè)模式：MRM模式，檢測(cè)條件如表2。

表2 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下p-氯-m-甲酚、o-苯基苯酚、氯二甲酚、芐氯酚的質(zhì)譜分析參數(shù)

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

用甲醇(色譜純)作溶劑，稱取適量的各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成5種防腐劑原混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，見表3。

表3 各物質(zhì)貯備溶液濃度及標(biāo)準(zhǔn)系列濃度 單位：mg·L-1

1.4 樣品來(lái)源及處理

在各大超市隨機(jī)購(gòu)買15種化妝品樣品，按種類分為:非蠟質(zhì)(液體類、粉類、膏霜類)和蠟質(zhì)類，按不同類型分類統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.1 不含蠟質(zhì)的化妝品如護(hù)膚類、香波、粉等 準(zhǔn)確稱取試樣約0.4 g(精確至1 mg)，置于10 mL具塞比色管中，加甲醇(色譜純)約5 mL，在漩渦混勻器上振蕩1 min，加入飽和氯化鈉溶液2 mL，用甲醇(色譜純)稀釋至10 mL，混勻，超聲提取15 min，再以8 000 r/min離心15 min，過(guò)0.45 μm濾膜(作為液相待測(cè)液)，取過(guò)濾液1 mL于10 mL比色管中，用甲醇定容至刻度，過(guò)0.22 μm濾膜作為液質(zhì)待測(cè)液。

1.4.2 含蠟質(zhì)的化妝品如唇膏、口紅等 準(zhǔn)確稱取試樣約0.4 g(精確至1 mg)，置10 mL具塞比色管中，加四氫呋喃(色譜純)1 mL，在漩渦混勻器上振蕩1 min，加飽和氯化鈉溶液1 mL，用甲醇(色譜純)稀釋至10 mL，混勻，超聲提取15 min，再以8 000 r/min離心15 min，過(guò)0.45 μm濾膜(作為液相待測(cè)液)，取過(guò)濾液1 mL于10 mL比色管中，用甲醇定容至刻度，過(guò)0.22 μm濾膜作為液質(zhì)聯(lián)用儀待測(cè)液。

若提取液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后濾液渾濁，則先將提取液用濾紙過(guò)濾后再經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用儀法線性范圍和回歸方程的比較

在1.2測(cè)定條件和1.4提取條件下，對(duì)該方法的線性范圍進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表4。參考限度范圍要求，配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到目標(biāo)化合物的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)，5 種防腐劑在其各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，液相方法相關(guān)系數(shù)均大于 0. 999；液質(zhì)方法相關(guān)系數(shù)均大于 0. 990。

表4 5種防腐劑的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(R2)

2.2 液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用儀法檢出限及定量限的比較

在最優(yōu)測(cè)定條件和提取條件下，對(duì)檢出限(LOD)和定量限(LOQ)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表5。采用樣品空白基質(zhì)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3倍信噪比和10倍信噪比確定兩種方法的檢出限和定量限。關(guān)于5種防腐劑的檢出限液相色譜檢測(cè)法和液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)法分別為 0.84～1.96 ng和0.004～0.010 ng；定量限分別為2.52～9.81 ng和0.01～0.03 ng，由表5可知，5種防腐劑的檢出限、定量限、檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)、定量質(zhì)量分?jǐn)?shù)，液相色譜法分別比液質(zhì)聯(lián)用儀法高。在測(cè)定氯己定、芐氯酚、氯二甲酚、o-苯基苯酚和p-氯-m-甲酚5種防腐劑的檢測(cè)過(guò)程中，液質(zhì)聯(lián)用儀法儀器的靈敏性優(yōu)勢(shì)凸顯，但從性價(jià)比和實(shí)驗(yàn)儀器的普及性上考慮，液相色譜法的適用普及性優(yōu)于液質(zhì)聯(lián)用儀法。

表5 5種防腐劑的檢出限、定量限、檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)、定量質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.3 液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用儀法精密度的比較

液相色譜法分別平行測(cè)定高濃度(標(biāo)準(zhǔn)系列溶液2的濃度)6次作為本實(shí)驗(yàn)的精密度；液質(zhì)聯(lián)用儀法分別平行測(cè)定中濃度(標(biāo)準(zhǔn)系列溶液3的濃度)6次作為本實(shí)驗(yàn)的精密度，由表6可知，液相高濃度對(duì)應(yīng)的組分精密度的相對(duì)偏差為0.4%～1.1%，液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)應(yīng)組分精密度的相對(duì)偏差為1.0%～2.8%。液相色譜法的精密度的相對(duì)偏差比液質(zhì)聯(lián)用儀法的精密度的相對(duì)偏差小，實(shí)驗(yàn)的隨機(jī)誤差液相色譜法比液質(zhì)聯(lián)用儀法小，實(shí)驗(yàn)的再現(xiàn)性液相色譜法比液質(zhì)聯(lián)用儀法好。

2.4 液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用儀法加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性比較

分別對(duì)2種基質(zhì)(非蠟質(zhì)類和蠟質(zhì)類)同一基質(zhì)樣品分別進(jìn)行5種(p-氯-m-甲酚、芐氯酚、氯己定、o-苯基苯酚、氯二甲酚)成分高低2個(gè)濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),6份回收率測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差作為各不同化妝品基質(zhì)中含高、低濃度待測(cè)成分時(shí)的測(cè)定重復(fù)性(見表7)。液相色譜法：加入量為高濃度時(shí)，5種成分的回收率范圍為103.7%～113.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～2.5%；加入量為低濃度時(shí)，5種成分的回收率為108.7%～119.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～3.4%。液質(zhì)聯(lián)用儀法：加入量為高濃度時(shí)，5種成分的回收率為77.6%～117.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～4.7%；加入量為低濃度時(shí)，5種成分的回收率為71.2%～114.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～5.2%。液相色譜法的回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差比液質(zhì)聯(lián)用儀法的回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值低，由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，液相色譜法比液質(zhì)聯(lián)用儀法系統(tǒng)誤差小，重復(fù)性高，實(shí)驗(yàn)的可靠性好。

表6 5種防腐劑的精密度 (n=6)

表7 2種基質(zhì)(非蠟狀和蠟質(zhì)類)的加標(biāo)回收率及重復(fù)性 (n=6)

續(xù)表

2.5 液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用儀法檢測(cè)樣品

應(yīng)用所建立液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用儀法，分別對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行了分析，結(jié)果如表8所示。

表8 實(shí)際樣品中5種防腐劑的檢測(cè)結(jié)果

“—”5種組分均未檢出。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜法與液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀法分別對(duì)2種基質(zhì)類型15批次化妝品的5種限用防腐劑氯己定、芐氯酚、氯二甲酚、o-苯基苯酚和p-氯-m-甲酚的測(cè)定方法。兩種方法操作簡(jiǎn)便，分離效果都好，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，高效液相色譜法比液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀法實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性和可靠性，但選擇性和靈敏度稍差。運(yùn)用建立的兩種方法分別對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行了分析檢測(cè)，兩種方法對(duì)實(shí)際樣品5#、6#、8#的氯二甲酚和o-苯基苯酚的檢測(cè)結(jié)果非常吻合，但對(duì)實(shí)際樣品7#的醋酸氯己定的測(cè)定，結(jié)果相差較大(測(cè)定結(jié)果見表8)，原因是液質(zhì)聯(lián)用儀法在加標(biāo)回收中醋酸氯己定回收偏低，實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較差。比較兩種方法的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果表明液質(zhì)聯(lián)用儀具有高的選擇性和靈敏度，更適合用于5種限用防腐劑的定性分析；而高效液相色譜法具有好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，更適合用于5種限用防腐劑的定量分析。