宋健

(江蘇省計(jì)量科學(xué)研究院，南京 210023)

近年來，隨著人們生活水平的提高以及國家對(duì)中醫(yī)藥事業(yè)的重視，中藥以其收費(fèi)低、療效好、副作用小等特點(diǎn)，備受廣大人民群眾推崇，其市場(chǎng)規(guī)模不斷擴(kuò)大。然而，一些不法商家為了追求快速起效，牟取更多利益，在中藥中違法添加各類處方西藥，患者不明真相地濫用藥物，帶來嚴(yán)重的副作用，導(dǎo)致各種癥狀的出現(xiàn)。吡羅昔康是非甾體抗炎藥，一般用于治療風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，但對(duì)胃腸道刺激比較大，長期服用會(huì)導(dǎo)致胃炎或胃潰瘍，甚至可能出現(xiàn)中性粒細(xì)胞減少、肝功能異常等癥狀。因其具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎功效，不良商家將其添加至抗風(fēng)濕類中成藥中以提高療效。

目前中成藥中摻偽添加的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜–質(zhì)譜法(LC–MS)和超高效液相色譜法(UPLC)等［1–3］。上述方法分析時(shí)間長、費(fèi)用高、專業(yè)性強(qiáng)，難以滿足市場(chǎng)監(jiān)管的需求，因此建立一種快速檢測(cè)中成藥中非法添加物的方法具有重要意義。表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)技術(shù)是目前發(fā)展較快的一種分析技術(shù)，通過納米增強(qiáng)試劑將拉曼信號(hào)增強(qiáng)106～109倍，彌補(bǔ)了拉曼散射效應(yīng)信號(hào)較弱、難以檢測(cè)微痕量物質(zhì)的缺陷。SERS 技術(shù)在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，已在違禁添加劑［4–6］、農(nóng)獸藥殘留［7–8］、保健品摻偽［9–10］、化妝品違禁添加［11］等食藥妝領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，但目前利用SERS 技術(shù)檢測(cè)抗風(fēng)濕類中成藥中違禁添加吡羅昔康的研究還未見報(bào)道。筆者利用便攜式表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)，建立了一種中成藥中摻偽添加的快速篩查方法，為準(zhǔn)確判斷中成藥中是否含有吡羅昔康等西藥成分提供技術(shù)支持，也為后續(xù)研究其它中成藥摻偽添加的快速篩查提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

便攜式拉曼光譜儀：SSR–3000 型，激光波長為785 nm，光譜范圍為180～2800 cm–1，南京簡智儀器設(shè)備有限公司；

金納米表面增強(qiáng)試劑(SSN–2 試劑)：金納米粒徑為45～55 nm，南京簡智儀器設(shè)備有限公司；

吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)品：純度為98%，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；

甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯：分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

N-丙基乙二胺(PSA)：粒徑為40～63 μm，100 g，天津博納艾杰爾科技有限公司；

石墨碳化黑(GCB)：粒徑為37.4～125 μm，100 g，天津博納艾杰爾科技有限公司；

同仁堂牌牛黃解毒片、修正牌復(fù)方金銀花顆粒、三精牌雙黃連口服液、白云山牌清開靈膠囊、王老吉牌廣東涼茶顆粒：上元堂大藥房；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 溶液配制

吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：10 mg／mL，準(zhǔn)確稱取0.1 g(精確至0.000 1 g)吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL 容量瓶中，加入乙酸乙酯溶解并定容至標(biāo)線，混勻。

吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：用乙酸乙酯將吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋至吡羅昔康的質(zhì)量濃度分別為1.0，0.1 mg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

吡羅昔康系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：將吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)中間溶液用乙酸乙酯逐級(jí)稀釋至吡羅昔康的質(zhì)量濃度分別為5，1，0.1，0.05 mg／L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 陽性樣品制備

牛黃解毒片、清開靈膠囊陽性樣品：將牛黃解毒片樣品研磨至粉狀，清開靈膠囊取內(nèi)容物。分別稱取牛黃解毒片粉狀、清開靈膠囊內(nèi)容物樣品各5份，每份均為0.5 g(精確至0.01 g)，分別加入質(zhì)量濃度為0.1 mg／mL 的吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)中間溶液1，2.5，5，25，50 μL，配制成吡羅昔康含量分別為0.2，0.5，1.0，5.0，10.0 mg／kg 的吡羅昔康陽性樣品溶液。

雙黃連口服液、金銀花顆粒、廣東涼茶顆粒陽性樣品：分別量取雙黃連口服液、金銀花顆粒、廣東涼茶顆粒樣品(液體樣品直接量取，固體顆粒按說明書沖泡后量取)各5 份，每份均為10 mL，分別加入質(zhì)量濃度為1.0 mg／mL 的吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)中間溶液2，5，10，50，100 μL，配制成吡羅昔康含量分別為0.2，0.5，1.0，5.0，10.0 mg／kg 的吡羅昔康陽性樣品溶液。

1.4 樣品前處理

取一定量的樣品(片劑研磨至粉狀稱取約0.5 g，膠囊取內(nèi)容物直接稱取約0.5 g，液體口服液直接量取0.5 mL，固體顆粒按說明書沖泡后量取0.5 mL)于5 mL 離心管中，加入2 mL 乙酸乙酯提取劑，超聲5 min，以4 000 r／min 轉(zhuǎn)速離心1 min。取上層清液1.5 mL 于5 mL 離心管中，加入20 mg GCB和10 mg PSA 凈化劑，充分振蕩，以4 000 r／min 轉(zhuǎn)速離心1 min，取上層清液作為待測(cè)液。

1.5 儀器工作條件

激光功率：450 mW；積分時(shí)間：10 s。

1.6 檢測(cè)方法

分別取SSN–2 增強(qiáng)試劑200 μL、待測(cè)液10 μL 于1.5 mL 玻璃瓶中，混勻，在1.5 儀器工作條件下，檢測(cè)混合溶液的拉曼光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 吡羅昔康拉曼特征峰組確定

在1.5 儀器工作條件下，將吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)品加入樣品瓶中直接進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，質(zhì)量濃度為5 mg／L 的吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和空白溶液分別按照1.6 方法進(jìn)行檢測(cè)。吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)品、吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及空白溶液的拉曼光譜圖如圖1 所示。

由圖1 可以看出，吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)示的拉曼峰 分 別 為348，405，578，646，773，818，874，1 159，1 274，1 357，1 542，1 601 cm–1，與文獻(xiàn)［12］的研究結(jié)果一致，說明標(biāo)示的拉曼峰確實(shí)為吡羅昔康的拉曼特征峰。質(zhì)量濃度為5 mg／L 的吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)工作溶液譜圖中標(biāo)示的拉曼峰分別為348，402，576，650，781，826，877，1 152，1 276，1 355，1 542，1 589 cm–1，除個(gè)別峰有微小漂移外，其拉曼峰與吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼特征峰大致相同?？瞻兹芤旱臏y(cè)試譜圖中并沒有出現(xiàn)吡羅昔康的拉曼特征峰。綜合考慮吡羅昔康在金納米增強(qiáng)體系中的拉曼峰強(qiáng)度和峰形，最 終 選 擇576，650，781，826，877，1 152，1 542，1 589 cm–18 個(gè)拉曼特征峰作為定性檢測(cè)吡羅昔康的拉曼特征峰組。

圖1 吡羅昔康拉曼光譜圖

2.2 提取劑選擇

目前中成藥中摻偽成分的檢測(cè)一般采用甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑提?。?3–17］，考慮到吡羅昔康易溶于二氯甲烷、乙酸乙酯等脂溶性有機(jī)溶劑，因此分別選擇甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯4 種溶劑作為提取劑，其它實(shí)驗(yàn)條件不變，按1.4 樣品前處理方法對(duì)吡羅昔康含量為5 mg／kg 的牛黃解毒片陽性樣品進(jìn)行處理，按1.6 方法分別進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，考察不同提取劑的提取效果，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 不同溶劑提取的拉曼光譜圖

由圖2 可以看出，4 種溶劑的提取效果：甲醇＜乙腈＜二氯甲烷＜乙酸乙酯。樣品經(jīng)甲醇和乙腈提取后，吡羅昔康拉曼特征峰只有部分出現(xiàn)，匹配比例分別為37.5%和87.5%，且提取液的信號(hào)大幅度減弱，這是因?yàn)檫亮_昔康在甲醇、乙腈中的溶解度均較小，甲醇和乙腈的提取效率較低，提取液中吡羅昔康的濃度遠(yuǎn)小于樣品溶液的濃度。而樣品經(jīng)二氯甲烷和乙酸乙酯提取后有尖銳的拉曼特征峰，匹配比例均為100%。因乙酸乙酯比二氯甲烷毒性低，對(duì)操作人員的危害小，因此選擇乙酸乙酯作為提取劑。

2.3 凈化劑優(yōu)化

以吡羅昔康含量為5 mg／kg 的牛黃解毒片陽性樣品作為待測(cè)樣品，以乙酸乙酯為提取劑，分別采用不同用量的GCB 和PSA 凈化劑對(duì)樣品進(jìn)行前處理，然后按1.6 方法進(jìn)行檢測(cè)，考察不同凈化劑用量對(duì)樣品前處理效果的影響，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 不同凈化劑用量時(shí)的拉曼光譜圖

由圖3 可以看出，沒用凈化劑時(shí)，除1 542，1 589 cm–1兩個(gè)主特征峰外，其它幾個(gè)特征峰的信號(hào)強(qiáng)度均較小，且在400～500 cm–1之間有一個(gè)較大的雜質(zhì)干擾峰。在使用不同用量的凈化劑后，吡羅昔康拉曼特征峰信號(hào)強(qiáng)度都有所增大，且濾除了雜質(zhì)峰，在GCB 用量相同的情況下，加入20 mg PSA 時(shí)的吡羅昔康拉曼特征峰信號(hào)強(qiáng)度略小于加入10 mg PSA 時(shí)的強(qiáng)度，這可能是PSA 具有一定的吸附作用所致。當(dāng)PSA 用量均為10 mg 時(shí)，分別加入10，20，30 mg 的GCB，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)GCB 用量為20 mg時(shí)，吡羅昔康拉曼特征信號(hào)強(qiáng)度最大，凈化效果最佳。結(jié)果表明雖然GCB 可以去除樣品中部分干擾色素，從而提高檢測(cè)效果，但與PSA 一樣，GCB 對(duì)部分藥物具有一定的吸附作用，因此需要選擇一個(gè)合適的用量，既可以最大程度除去色素干擾，又盡量減少其對(duì)藥物的吸附，以達(dá)到最佳凈化效果。綜合考慮，選擇20 mg GCB+10 mg PSA組合作為凈化劑。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液檢出限

以吡羅昔康系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液作為待測(cè)液，按1.6 方法分別進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，不同濃度的吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)工作溶液具有拉曼特征峰組中全部或部分譜峰，匹配比例不小于50%時(shí)認(rèn)為有檢出，小于50%時(shí)為未檢出。不同濃度吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)溶液的增強(qiáng)拉曼譜圖如圖4 所示。

圖4 不同濃度吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)溶液的拉曼光譜圖

由圖4 可以看出，吡羅昔康拉曼信號(hào)在一定范圍內(nèi)隨濃度的降低而減弱，當(dāng)吡羅昔康的質(zhì)量濃度為0.1 mg／L 時(shí)，特征峰的匹配比例為75%，而當(dāng)濃度降至0.05 mg／L 時(shí)，匹配比例明顯低于50%，幾乎觀察不到吡羅昔康的拉曼特征峰，譜圖與空白溶液極其相近，表明吡羅昔康未檢出。綜上所述該方法吡羅昔康標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢出限為0.1 mg／L。

2.5 方法評(píng)價(jià)

2.5.1 方法檢出限

按1.4 方法對(duì)1.3 中的牛黃解毒片陽性樣品進(jìn)行前處理，然后按1.6 方法進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 牛黃解毒片陽性樣品的拉曼光譜圖

由圖5 可看出，當(dāng)樣品中吡羅昔康含量不小于1 mg／kg 時(shí)，拉曼峰型明顯且能識(shí)別出吡羅昔康全部拉曼特征峰；當(dāng)吡羅昔康含量降至0.5 mg／kg 時(shí)，檢測(cè)出5 個(gè)吡羅昔康特征峰，匹配比例降至62.5%；當(dāng)吡羅昔康含量降至0.2 mg／kg 時(shí)，匹配比例低于50%，可以認(rèn)為未檢出。因此該方法的檢出限為0.5 mg／kg?？紤]到中成藥摻偽的實(shí)際情況，一般情況下每千克中成藥摻偽的質(zhì)量為幾百毫克甚至高達(dá)幾千毫克，所以該檢出限完全滿足檢測(cè)需求。

2.5.2 基質(zhì)普適性

按1.3 陽性樣品制備方法，分別以金銀花顆粒、雙黃連口服液、清開靈膠囊以及涼茶為空白基質(zhì)制備陽性樣品，驗(yàn)證基質(zhì)的普適性，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 吡羅昔康在不同劑型基質(zhì)中的拉曼光譜圖

由圖6 可以看出，該方法可用于檢測(cè)上述4 種樣品基質(zhì)中的吡羅昔康，其中金銀花顆粒和雙黃連口服液陽性樣品的檢出限為0.5 mg／kg，清開靈膠囊和涼茶陽性樣品的檢出限為1 mg／kg。

3 結(jié)語

建立了表面增強(qiáng)拉曼光譜法快速檢測(cè)中成藥中吡羅昔康的方法。該方法具有檢出限低、分析范圍廣、操作方便簡單、分析速度快等特點(diǎn)，可用于中成藥中違禁添加抗風(fēng)濕解熱鎮(zhèn)痛類藥物的快速檢測(cè)。