田華開，鄭辭華，劉韋東，許添，溫華斌，鄧小榮

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院胃腸外科，江西 南昌 330006)

目前，胃癌的治療方法包括手術(shù)治療、放化療、基因療法和免疫治療等，其中，手術(shù)治療是胃癌最常見最有效的治療方法[1-2]。有資料顯示，手術(shù)創(chuàng)傷應(yīng)激可影響腸道菌群平衡、腸內(nèi)炎癥以及腸黏膜損害，從而影響病人術(shù)后恢復(fù)、預(yù)后以及生活質(zhì)量[3-4]。近年來，胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)受到廣泛關(guān)注，胃腸道微生物約占人體微生物的76%[5]。胃腸道微生物種類龐大，數(shù)量繁多，參與機(jī)體的代謝，對人類健康有著極其重要的作用[6-7]。胃癌術(shù)后病人由于手術(shù)創(chuàng)傷、消化道重建造成解剖關(guān)系改變，腸道菌群可能發(fā)生變化，同時，胃腸道微生物對胃癌術(shù)后病人的恢復(fù)存在哪些影響還有待探討。本研究應(yīng)用高通量測序等方法檢測胃癌病人手術(shù)后的腸道菌群變化，及其對病人術(shù)后恢復(fù)的影響。現(xiàn)報告如下。

資料與方法

一、資料

收集2018年6月至2019年6月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院胃腸外科收治的行胃癌根治術(shù)的100例病人，其中男性84例，女性16例，年齡(54.4±8.9)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理確診為胃癌病人；②年齡為40～70歲，無嚴(yán)重心腦血管疾病、肝腎功能損害病人；③術(shù)前檢查無遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，術(shù)前未行放療、化療病人。排除標(biāo)準(zhǔn)：①病人營養(yǎng)狀態(tài)差(總蛋白<70 g/L,白蛋白<40 g/L),術(shù)前存在貧血；②病人有糖尿病等內(nèi)分泌代謝性疾?。虎鄄∪擞懈腥拘约膊?。

二、方法

術(shù)前(未行腸道準(zhǔn)備前)收集病人糞便行腸道菌群檢測，采集新鮮的、中后段、內(nèi)部的糞便標(biāo)本2 g，立即置于-80 ℃冷凍保存，保存期間勿反復(fù)凍融，以免損傷菌群。所有病人在完善相關(guān)術(shù)前準(zhǔn)備后均于全身麻醉下行遠(yuǎn)端胃大部分切除伴胃空腸吻合術(shù)，術(shù)后均給予頭孢替安(2 g)每12 h一次靜脈輸液預(yù)防感染，一般常規(guī)使用48～72 h后停止。術(shù)后第1天開始均給予營養(yǎng)支持治療，待病人恢復(fù)飲食(稀飯或面條)、解黃色稀便后(約8～10 d)收集病人糞便標(biāo)本，同術(shù)前標(biāo)本低溫保存，同時記錄病人術(shù)后首次通氣通便時間，待所有標(biāo)本收集完畢后一起送檢，提取糞便樣本DNA，通過高通量測序檢測分析樣本中腸道菌群種類及豐度。

糞便DNA提取及高通量測序：將上述低溫(-80 ℃)保存的糞便標(biāo)本聯(lián)合使用基因組DNA試劑盒(中國北京天根生物技術(shù)有限公司)和珠子敲打的方法，通過分光光度計在230 nm和260 nm確定其濃度和質(zhì)量。然后使用515F/806R(515F，5′-GTGCCAGCMGCCGCGGGGTAA-3′; 806R，5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′)的引物擴(kuò)增每個樣品中16S rDNA基因的V4區(qū)，并使用Illumina HiSeq 2000平臺(GenBank登錄號SRP155279)對這些PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。菌群DNA提取流程見圖1。

三、觀察指標(biāo)

比較100例病人手術(shù)前后腸道菌群(雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、大腸桿菌、鏈球菌等)變化，術(shù)后各菌群豐度。觀察記錄病人術(shù)后首次恢復(fù)通氣通便時間，術(shù)后是否出現(xiàn)腹痛、腹脹等癥狀。收集病人術(shù)后炎癥指標(biāo)(白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、C反應(yīng)蛋白)，免疫指標(biāo)(淋巴細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比)，營養(yǎng)指標(biāo)(總蛋白、白蛋白和前白蛋白)等臨床數(shù)據(jù)資料。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、手術(shù)前后病人腸道菌群變化

所有病人糞便樣本經(jīng)過高通量基因檢測后發(fā)現(xiàn)，腸道菌群種類未見明顯變化，各菌群的相對豐度即數(shù)量手術(shù)前、后發(fā)生改變：其中雙歧桿菌(15.68%比3.06%)、嗜乳酸桿菌(21.6%比4.74%)平均相對豐度發(fā)生明顯改變，術(shù)后較術(shù)前明顯減少；而大腸桿菌(8.67%比14.34%)、鏈球菌(12.61%比26.75%)平均相對豐度術(shù)后較術(shù)前明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05 )，見圖2。

二、腸道菌群改變對病人術(shù)后恢復(fù)影響

根據(jù)不同病人有益菌相對豐度是否大于上述平均豐度，將100例病人分為相對豐度高組和相對豐度低組，比較兩組病人術(shù)后恢復(fù)情況，探究腸道菌群對術(shù)后恢復(fù)的影響。相對豐度高組54例，男性47例，女性7例，均未予以輸血；相對豐度低組46例，男性37例，女性9例，均未予以輸血。兩組病人年齡、性別、手術(shù)時間、術(shù)中出血量等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。100例病人均未出現(xiàn)吻合口漏，5例病人因皮下脂肪層較厚術(shù)后出現(xiàn)手術(shù)切口脂肪液化，經(jīng)加強換藥后傷口愈合良好，所有病人術(shù)后均順利出院。

觀察病人術(shù)后恢復(fù)情況及相關(guān)血液生化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，有益菌相對豐度高組術(shù)后首次通氣通便時間較相對豐度低組明顯縮短，相對豐度高組術(shù)后出現(xiàn)腹痛、腹脹病人2例，相對豐度低組術(shù)后出現(xiàn)腹痛、腹脹病人8例，所有病人經(jīng)過適當(dāng)活動、通便、恢復(fù)飲食后(糞便標(biāo)本已取)給予口服雙歧桿菌四聯(lián)活菌片后癥狀均緩解，兩組病人結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。通過收集病人術(shù)后生化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，相對豐度高組炎癥指標(biāo)(白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、C反應(yīng)蛋白)異常例數(shù)較相對豐度低組明顯較少，免疫指標(biāo)(淋巴細(xì)胞計數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比)異常例數(shù)較相對豐度低組明顯較少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；相對豐度高組術(shù)后營養(yǎng)狀態(tài)(總白蛋白、白蛋白、前白蛋白)較相對豐度低組有明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(表1)

討 論

手術(shù)治療能夠顯著延長胃癌病人生存時間[8-9]。但手術(shù)創(chuàng)傷會影響腸道菌群變化，有研究顯示，手術(shù)創(chuàng)傷應(yīng)激能夠改變病人術(shù)后腸黏膜通透性、導(dǎo)致菌群紊亂，加劇腸內(nèi)炎癥反應(yīng)，降低免疫力，直接影響病人術(shù)后恢復(fù)[10]。胃癌手術(shù)所致炎癥反應(yīng)，促使白細(xì)胞介素6、腫瘤壞死因子水平明顯上升，免疫因子表達(dá)下降，同時腸黏膜屏障受損，腸道細(xì)菌移位使腸道炎癥進(jìn)一步加重形成惡性循環(huán)[11-13]。目前，關(guān)于胃癌術(shù)后腸道菌群變化的研究甚少，本研究通過提取糞便標(biāo)本DNA，應(yīng)用高通量測序的方法檢測腸道菌群種類及相對豐度變化，探討其對術(shù)后恢復(fù)的具體影響，為臨床促進(jìn)胃癌病人圍手術(shù)期加速康復(fù)提供新的方案。

表1 兩組病人術(shù)后恢復(fù)情況比較

目前已知，人體內(nèi)存在著上千種微生物，對宿主的新陳代謝起著重要的作用。正常微生物群、宿主和環(huán)境之間始終處于動態(tài)平衡狀態(tài)，形成一個相互依存、相互制約的系統(tǒng)，這個平衡一旦破壞，就可能導(dǎo)致機(jī)體功能紊亂。腸道微生物對于腸道功能發(fā)揮著重要的作用，能夠明顯促進(jìn)腸道蠕動，減少有害菌產(chǎn)氣，促進(jìn)腸道有害物質(zhì)排出，促使腸道充分發(fā)揮腸道屏障功能。有研究表明，腸道菌群能夠幫助機(jī)體消化食物，分解毒素，合成多種人體生長發(fā)育必需的一些維生素和必需氨基酸，并參與糖類和蛋白質(zhì)的代謝，抵御入侵者，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，對人類的健康有著極其重要作用[14- 15]。胃腸道菌群大致可分為有益菌、有害菌和中性菌[16]。有益菌，也稱之為益生菌，主要是各種雙歧桿菌、乳酸桿菌等，是人體健康不可缺少的要素，可以合成各種維生素，參與食物的消化，促進(jìn)腸道蠕動，抑制有害菌和致病菌群的生長，分解有害、有毒物質(zhì)等[17- 18]。中性菌，即具有雙重作用的細(xì)菌，如大腸桿菌、腸球菌等，當(dāng)機(jī)體功能發(fā)生紊亂，增殖失控，將導(dǎo)致宿主表現(xiàn)各種癥狀[19-20]。

本次研究收集胃癌手術(shù)病人手術(shù)前后的糞便標(biāo)本，通過高通量基因測序的方法檢測樣本中腸道菌群的種類和數(shù)量變化。結(jié)果表明，胃癌術(shù)后病人腸道菌群種類無明顯改變，但各菌群相對豐度發(fā)生明顯改變，體內(nèi)雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌相對豐度明顯降低，大腸桿菌、鏈球菌等相對豐度明顯增加。同時，通過檢測胃癌病人術(shù)后體內(nèi)各菌群數(shù)量變化及病人術(shù)后恢復(fù)情況、生化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，術(shù)后體內(nèi)有益菌相對豐度高的病人炎癥指標(biāo)、淋巴細(xì)胞更趨于正常，病人術(shù)后營養(yǎng)狀態(tài)較好，術(shù)后首次通氣通便時間明顯縮短，腹痛腹脹等臨床表現(xiàn)明顯減少。

通過本次研究發(fā)現(xiàn)，胃癌手術(shù)病人術(shù)后腸道菌群種類未見明顯改變，各腸道菌群相對豐度發(fā)生明顯變化，術(shù)后體內(nèi)益生菌明顯減少，大腸桿菌、鏈球菌相對豐度明顯增加，導(dǎo)致病人術(shù)后抵抗力下降。同時，體內(nèi)有益菌豐度相對較高組具有更快的術(shù)后恢復(fù)能力，能明顯減少機(jī)體炎癥反應(yīng)，提高機(jī)體免疫能力，增強病人術(shù)后營養(yǎng)狀態(tài)。

綜上所述，手術(shù)治療影響胃癌病人腸道菌群平衡，這可能與手術(shù)應(yīng)激以及消化道重建改變胃腸生理結(jié)構(gòu)(胃腸液酸堿失衡)有關(guān)。另外，腸道菌群變化、炎癥指標(biāo)與病人術(shù)后恢復(fù)密切相關(guān)，提示調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，即增加腸道有益菌有助于降低炎癥反應(yīng)，促進(jìn)胃癌病人術(shù)后恢復(fù)。