劉小燕，王 娟，張曉明，常 琦，張義福，楊平榮

（1.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000）

仿制藥質(zhì)量的差異直接影響群眾用藥的安全性和有效性。為整體提升我國(guó)藥品質(zhì)量水平,《國(guó)家藥品安全“十二五”規(guī)劃》明確提出把全面提高仿制藥質(zhì)量作為一項(xiàng)重要任務(wù)[1]。異煙肼，化學(xué)名4-吡啶甲酰肼，是結(jié)核病聯(lián)合治療中的首選藥。本品分子量小137.14，口服后幾乎完全吸收，生物利用度達(dá)90%[2]。國(guó)內(nèi)異煙肼片批準(zhǔn)文號(hào)數(shù)571 個(gè)，涉及生產(chǎn)企業(yè)331 個(gè)，有500mg,300mg，100mg，50mg 四個(gè)規(guī)格，臨床首選規(guī)格為100mg。屬于289 目錄品種之一[3]。截至3 月13 日，異煙肼片參比制劑備案記錄共52條，涉及生產(chǎn)企業(yè)數(shù)24 個(gè)。有12 家企業(yè)申報(bào)一致性評(píng)價(jià)，通過(guò)一致性評(píng)價(jià)的有6 家企業(yè)，涉及8 個(gè)受理號(hào)，包括100mg6 個(gè)，300mg2 個(gè)。目前，均已納入《中國(guó)上市藥品目錄集》。筆者以異煙肼片為例，對(duì)異煙肼片仿制藥體外質(zhì)量研究進(jìn)行了總結(jié)分析，并對(duì)參比制劑的選擇提出建議，期望對(duì)我國(guó)仿制藥質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)提供參考。

1 品種概況

根據(jù)美國(guó)兒童健康和人類(lèi)發(fā)展研究所(NICHD) 和美國(guó)FDA BCS（2011 年）分類(lèi)[4]及WHO（2005 年）的研究[5]，異煙肼為BCSⅠ或BCSⅢ類(lèi)。報(bào)道指出異煙肼不存在多種晶型[6]。FDA 和WHO 指出，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的臨床有效性驗(yàn)證，異煙肼片可以通過(guò)體外溶出曲線(xiàn)的方法來(lái)評(píng)價(jià)與參比制劑的一致性，不推薦體內(nèi)試驗(yàn)，可以生物等效性（bioequivalence,BE）豁免[6,7]。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）也提出異煙肼片可申請(qǐng)豁免人體BE 研究[8]。因此，體外藥學(xué)研究則是評(píng)價(jià)異煙肼片一致性最主要的手段。

NMPA 發(fā)布的異煙肼片100mg，300mg 推薦的參比制劑為FDA 指定的參比制劑(RLD)：SANDOZ INC（山德士），現(xiàn)已撤市。針對(duì)這種RLD 不能獲得的情況，F(xiàn)DA 于2017 年引入了對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)制劑（RS）。其中異煙肼片的RS 為BARR LABORATORIES INC。FDA 指定RS 僅用于作為仿制藥申請(qǐng)（abbreviated newdrugapplication，ANDA）時(shí)進(jìn)行BE 研究的對(duì)照制劑，體外藥學(xué)研究還應(yīng)與RLD 進(jìn)行對(duì)比[9]。NMPA 之后又增補(bǔ)了 BARR LABORATORIES INC/Teva Pharmaceuticals USA,Inc.（梯瓦）異煙肼片同時(shí)作為我國(guó)參比制劑之一。目前50mg,500mg 異煙肼片沒(méi)有推薦參比制劑。

2 仿制藥質(zhì)量研究

2.1 雜質(zhì)分析

異煙肼合成路線(xiàn)主要有兩條，如圖1 所示[10]。

圖1 異煙肼合成路線(xiàn)圖

異煙肼及其片劑主要已知雜質(zhì)有8 種，見(jiàn)表1。除了未反應(yīng)的起始原料，在合成過(guò)程中會(huì)進(jìn)一步產(chǎn)生的反應(yīng)中間體，降解產(chǎn)物，副產(chǎn)物及相容性產(chǎn)物等。

表1 異煙肼及其片劑已知雜質(zhì)及歸屬

2.1.1 游離肼

游離肼可在原料合成時(shí)引入，也可在儲(chǔ)存過(guò)程中由異煙肼降解產(chǎn)生，肼是一種誘變劑和致癌物質(zhì)[11]。因此，對(duì)游離肼含量的控制是評(píng)價(jià)異煙肼及其制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)中有三種檢測(cè)方法：濁度法、TLC 及柱前衍生HPLC 法，見(jiàn)表2。

表2 異煙肼及異煙肼片國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)比較

僅ChP2015 在異煙肼及其片劑中都設(shè)有游離肼檢查項(xiàng)。其中JP17 目視濁度法不能客觀(guān)反映游離肼真實(shí)含量，而ChP2015 采用的TLC 法檢測(cè)靈敏度較低。此前，中國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì)已擬定提高異煙肼及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[12]。

HPLC 法是利用游離肼與苯甲醛反應(yīng)生成的苯甲醛吖嗪進(jìn)行色譜分析測(cè)定，該方法準(zhǔn)確性好,專(zhuān)屬性強(qiáng),靈敏度高[13]。已有國(guó)內(nèi)企業(yè)在申報(bào)異煙肼片一致性評(píng)價(jià)的注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中將游離肼測(cè)定法修訂為HPLC 法，設(shè)定限度低至0.0015%，等同于BP2020/EP10.0 對(duì)原料藥中游離肼的限度：15ppm。這或許預(yù)示著我國(guó)仿制藥質(zhì)量在雜質(zhì)控制方面有了較大提高?？陀^(guān)、合理的質(zhì)量控制限度的制定，還需結(jié)合仿制藥與參比制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)中游離肼的測(cè)定數(shù)據(jù)，以保證產(chǎn)品在有效期內(nèi)達(dá)到限度要求。

2.1.2 有關(guān)物質(zhì)

1）雜質(zhì)譜分析。有關(guān)物質(zhì)是藥品關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一，對(duì)藥品安全性和質(zhì)量可控性有著重要影響。國(guó)內(nèi)外藥典對(duì)異煙肼有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量控制差異較大。比較之下，BP2020/EP10.0 的質(zhì)控限度較為嚴(yán)格。僅ChP2015 在異煙肼片中設(shè)定有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)，其余藥典均未在片劑中控制有關(guān)物質(zhì)（見(jiàn)表2）。

在前期研究工作中，筆者測(cè)定了包括異煙肼和山德士、日本第一三共在內(nèi)的20 家企業(yè)異煙肼片的有關(guān)物質(zhì)。山德士異煙肼片檢出一特有雜質(zhì)，含量高達(dá)3.1%，經(jīng)LC-MS 結(jié)構(gòu)確證為異煙肼與乳糖原輔料相容性產(chǎn)物——乳糖異煙腙。而17 批國(guó)內(nèi)異煙肼片檢出未知雜質(zhì)在0.2%以上的有2 家，涉及3 種雜質(zhì)；異煙肼及所有異煙肼片中均檢出異煙酸、異煙酰胺，而4-甲基吡啶及USP43 與BP2020/EP10.0 列出的4-氰基吡啶，2-吡啶甲酰肼均未檢出[14]。基于以上研究，并結(jié)合文獻(xiàn)資料對(duì)8 種已知雜質(zhì)進(jìn)行了來(lái)源歸屬，詳見(jiàn)表1。一般情況下，工藝雜質(zhì)及降解雜質(zhì)都須在原料中進(jìn)行控制，由于制劑中工藝雜質(zhì)不會(huì)增加，故只須控制降解雜質(zhì)及原輔料相容性產(chǎn)物。在異煙肼片仿制藥一致性評(píng)價(jià)中，已知雜質(zhì)中須控制的是：異煙酸、異煙酰胺、1,2-二異煙?；录叭樘钱悷熾?。如果研究證明光降解產(chǎn)物1,2-二異煙酰基肼在確定的儲(chǔ)存條件下，并在加速試驗(yàn)、長(zhǎng)期試驗(yàn)中不會(huì)增加，則在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中無(wú)需單獨(dú)控制，籠統(tǒng)要求即可。乳糖異煙腙僅在處方中添加乳糖時(shí)產(chǎn)生，沒(méi)有添加時(shí)無(wú)需考慮。

異煙肼片最大服用量為900mg/天，依照ICHQ3b 中對(duì)于制劑雜質(zhì)的要求，雜質(zhì)報(bào)告限為0.1%，鑒定限為0.2%，質(zhì)控限為0.2%[15]。企業(yè)需對(duì)檢出在0.2%以上的未知雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，參考文獻(xiàn)資料或根據(jù)毒理實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定質(zhì)控限。但對(duì)仿制藥研發(fā)而言，企業(yè)可以從提升原料質(zhì)量，優(yōu)化制劑生產(chǎn)工藝角度入手，降低該雜質(zhì)含量至鑒定限以下。

2）限度的制定。對(duì)于已知雜質(zhì)，如異煙酸、異煙酰胺及乳糖異煙腙，有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或文獻(xiàn)資料的，可結(jié)合參比制劑與仿制藥穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果確定雜質(zhì)限度。雜質(zhì)對(duì)照品價(jià)格昂貴，不建議外標(biāo)法測(cè)定，主張采用加校正因子的主成分自身對(duì)照HPLC 法進(jìn)行定量。為確保相對(duì)保留時(shí)間定性的準(zhǔn)確性，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中可指明色譜柱型號(hào)及參數(shù)。在系統(tǒng)性試驗(yàn)中，需要驗(yàn)證雜質(zhì)與主成分之間的分離度時(shí)，可采用雜質(zhì)對(duì)照品的相應(yīng)試劑代替。未知雜質(zhì)的控制，研究者可根據(jù)穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，以幫助擬定質(zhì)控限度，試驗(yàn)設(shè)計(jì)參照原CFDA 發(fā)布的《化學(xué)藥物（原料藥和制劑）穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》。

如果該雜質(zhì)為仿制藥特有雜質(zhì)，質(zhì)控限就不得高于鑒定限，對(duì)異煙肼片來(lái)說(shuō)是0.2%。若為仿制藥與參比制劑共有雜質(zhì)，當(dāng)參比制劑含量高于鑒定限0.2%時(shí)，質(zhì)控限不得高于參比制劑含量；若參比制劑含量低于鑒定限0.2%，則仿制藥可高于參比制劑，但不得高于鑒定限。為使降解雜質(zhì)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度，縮短有效期是被容許的，國(guó)家藥品審評(píng)中心(CDE)公布的已通過(guò)異煙肼片一致性評(píng)價(jià)的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中有效期存在12 個(gè)月，24 個(gè)月。而一致性評(píng)價(jià)之前，多數(shù)國(guó)內(nèi)企業(yè)異煙肼片有效期設(shè)定均為36個(gè)月。雜質(zhì)質(zhì)控詳細(xì)研究思路可參考謝沐風(fēng)作者的系列文章[16,17]。

2.2 溶出度

體外溶出行為的比較已成為仿制藥申報(bào)和上市后質(zhì)量監(jiān)管工作中越來(lái)越重要的一個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)。異煙肼片為可申請(qǐng)BE 豁免品種，需證明仿制制劑與參比制劑為BCSⅠ類(lèi)快速溶出或BCSⅢ類(lèi)非?？焖偃艹?。此時(shí)，胃排空是藥物吸收的限速步驟，藥物的吸收速度和吸收程度就不會(huì)依賴(lài)于藥物的溶出時(shí)間或在胃腸道的通過(guò)時(shí)間[18]，僅取決于制劑中API 的特性[19,20]。李飛[21]認(rèn)為對(duì)于高溶解性快速溶出類(lèi)制劑的處方、原輔料質(zhì)量及生產(chǎn)工藝的變化很難從溶出結(jié)果中體現(xiàn)，此類(lèi)產(chǎn)品溶出方法的確定不需要更多驗(yàn)證。

然而，申請(qǐng)生物豁免并非易事。BCSⅢ類(lèi)藥物的難點(diǎn)在于達(dá)到仿制制劑與參比制劑處方種類(lèi)用量的一致；BCSⅠ類(lèi)藥物的難點(diǎn)在于證明其高滲透性。而滲透性數(shù)據(jù)的獲得并不容易，有些滲透性試驗(yàn)的成本甚至超過(guò)了體內(nèi)BE 試驗(yàn)[22]。所以我們才會(huì)看到，在申報(bào)異煙肼片一致性評(píng)價(jià)時(shí)，有兩家企業(yè)放棄申請(qǐng)生物豁免，完成了BE 研究。

一般來(lái)說(shuō)，選擇原研制劑的溶出度方法是一種比較保險(xiǎn)的做法[23]。但是有的情況下，選擇已有溶出方法作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并不能很好反映產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性[24]。依據(jù)“仿產(chǎn)品，不是仿標(biāo)準(zhǔn)”理念，還應(yīng)根據(jù)仿制制劑的特點(diǎn)及BE 研究數(shù)據(jù)，在對(duì)參比制劑、仿制藥進(jìn)行溶出曲線(xiàn)研究后，制定出符合本制劑質(zhì)量控制的溶出度方法作為該仿制藥上市后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[25]。

筆者之前的pH-溶解度曲線(xiàn)測(cè)定顯示異煙肼的溶解度無(wú)pH 依賴(lài)性[26]，該曲線(xiàn)與X 軸基本平行，理論上同一制劑多條溶出曲線(xiàn)應(yīng)重合。這與我們對(duì)山德士異煙肼片及國(guó)內(nèi)多家企業(yè)仿制制劑在四種溶出介質(zhì)中的溶出曲線(xiàn)測(cè)定結(jié)果一致[27]。同時(shí)，我們可以假設(shè)，若仿制制劑本身四條曲線(xiàn)不能重合，推測(cè)產(chǎn)品的處方工藝還有提升空間。在測(cè)定了20 家國(guó)內(nèi)異煙肼片的溶出曲線(xiàn)后，結(jié)果顯示不同企業(yè)制劑在水中溶出量差異較大[26]。比較各國(guó)藥典除USP43 溶出介質(zhì)為0.01mol/L 鹽酸溶液外，其余均為水。日本的“藥品品質(zhì)再評(píng)價(jià)工程”將溶出度評(píng)價(jià)作為主要手段，提出“溶出一致，臨床療效一致”理念，溶出試驗(yàn)條件也是各國(guó)藥典中最嚴(yán)格的[28,29]。我們有理由相信JP17 的溶出度質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有更強(qiáng)的可參考性。溶出裝置選擇槳法，轉(zhuǎn)速為50rpm。同時(shí)，從秉承環(huán)保、提高效率出發(fā)，首選水作為溶出介質(zhì)。

溶出曲線(xiàn)測(cè)定時(shí)，為保證不同采樣時(shí)間點(diǎn)溶出量測(cè)定的準(zhǔn)確度，通常采用HPLC 法；而在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)擬定時(shí)，快速溶出類(lèi)制劑通常為一個(gè)介質(zhì)一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在排除輔料干擾的前提下，考慮UV 對(duì)照品法。溶出限度的制定可參考FDA 發(fā)布的相關(guān)指南[30]，在規(guī)定的溶出條件下，API 為高溶解性的口服固體制劑的可接受限度為30min 溶出量80%，以此作為一個(gè)最低的要求。

3 參比制劑的選擇

參比制劑是一致性評(píng)價(jià)的標(biāo)桿，對(duì)體外質(zhì)量評(píng)價(jià)有決定作用。參比制劑應(yīng)是處方工藝合理，質(zhì)量穩(wěn)定的藥品。

3.1 處方組成

參考藥品說(shuō)明書(shū)，山德士與梯瓦異煙肼片（100mg）添加輔料的功能基本一致，最大的不同是山德士異煙肼片處方中添加了輔料乳糖（見(jiàn)表3）。

表3 參比制劑輔料比較

乳糖是片劑較理想的稀釋劑，我國(guó)乳糖產(chǎn)量低，價(jià)格貴，較少使用。調(diào)研發(fā)現(xiàn)我國(guó)仿制藥異煙肼片處方中均不含乳糖。而文獻(xiàn)報(bào)道，乳糖可與胺類(lèi)化合物配伍后生成棕黃色的加成物，在處方中含有乳糖時(shí)，可能會(huì)增加異煙肼片的生物豁免風(fēng)險(xiǎn)[31,32]。

3.2 質(zhì)量分析

在雜質(zhì)譜分析中，發(fā)現(xiàn)山德士異煙肼片中的特有雜質(zhì)乳糖異煙腙，含量可高達(dá)3.1%。該雜質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了ICH 中Q3b 的質(zhì)控限度[15]。同時(shí)，山德士異煙肼片有關(guān)物質(zhì)兩批批間差異較大，批號(hào)ME130402：異煙酸0.21%，乳糖異煙腙1.6%，異煙酰胺0.12%，各雜質(zhì)總和2.0%；批號(hào)ME130036：異煙酸0.06%，乳糖異煙腙3.1%，異煙酰胺0.03%，各雜質(zhì)總和3.2%[14]。

筆者采用已建立的HPLC 溶出量測(cè)定方法[27]：槳法50rpm，溶出介質(zhì)為pH1.2,pH4.5,pH6.8 及水500ml，取樣時(shí)間點(diǎn)為5min,10min,15min,30min。測(cè)定了兩種參比制劑在四種溶出介質(zhì)中的溶出曲線(xiàn)。結(jié)果顯示，山德士與梯瓦異煙肼片在四種介質(zhì)中15min 時(shí)溶出量均達(dá)到85%以上，為非?？焖偃艹觯ㄈ鐖D2 所示）。

圖2 參比制劑在四種溶出介質(zhì)中的溶出曲線(xiàn)

同一批12 片樣品15min 溶出量RSD%，梯瓦：RSD%<2%（n=12），山德士：RSD%<4%（n=12）。梯瓦異煙肼片批內(nèi)一致性更佳。

3.3 小結(jié)

從參比制劑遴選順序來(lái)說(shuō)，原研產(chǎn)品具有全套的質(zhì)量研究、體內(nèi)BE 試驗(yàn)及臨床有效性試驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)首選FDA 進(jìn)口原研制劑：山德士異煙肼片。但作為可申請(qǐng)生物豁免品種，在符合快速溶出或非?？焖偃艹鰰r(shí)，生物不等效風(fēng)險(xiǎn)較低。在經(jīng)過(guò)一系列藥學(xué)研究后，顯示山德士處方存在異煙肼與乳糖不相容的風(fēng)險(xiǎn)，有關(guān)物質(zhì)中檢出含量3.1%的雜質(zhì)；而梯瓦異煙肼片的處方合理，溶出均一性更佳，在結(jié)合穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，可優(yōu)先考慮作為我國(guó)異煙肼片一致性評(píng)價(jià)參比制劑。

4 結(jié)語(yǔ)

仿制藥一致性評(píng)價(jià)研究的核心是對(duì)藥物制劑處方工藝的再研究。不論是申報(bào)仿制藥還是一致性評(píng)價(jià)，目標(biāo)都是建立一個(gè)完善合理的質(zhì)量保證體系[24]，保障仿制藥上市前后產(chǎn)品質(zhì)量與參比制劑或原研制劑一致。NMPA 第102 號(hào)文指出，自首家仿制藥品種通過(guò)一致性評(píng)價(jià)后，其他生產(chǎn)企業(yè)的相同產(chǎn)品原則上3 年內(nèi)要完成，在藥品集中采購(gòu)方面不再選用未通過(guò)一致性評(píng)價(jià)的品種[33]。同時(shí)，“4+7 帶量采購(gòu)”的實(shí)施，使通過(guò)一致性評(píng)價(jià)的仿制藥與原研產(chǎn)品同組競(jìng)價(jià)[34,35]，促使仿制藥企業(yè)完善生產(chǎn)線(xiàn)，實(shí)現(xiàn)行業(yè)全面轉(zhuǎn)型升級(jí)。

近年抗結(jié)核菌藥物導(dǎo)致的嚴(yán)重肝損傷越來(lái)越受到人們的關(guān)注，異煙肼作為一線(xiàn)藥物有著不可替代的作用。在新一代抗結(jié)核藥物問(wèn)世前，如何利用現(xiàn)代化技術(shù)，研發(fā)出能減少異煙肼造成肝損害的新型藥物制劑顯得越來(lái)越迫切[36]。中國(guó)已加入ICH，對(duì)國(guó)內(nèi)藥企的研發(fā)能力將提出更高的要求，對(duì)企業(yè)來(lái)說(shuō)既是機(jī)遇也是挑戰(zhàn)。企業(yè)在積極應(yīng)對(duì)的同時(shí)，應(yīng)全面做好戰(zhàn)略布局，應(yīng)對(duì)產(chǎn)業(yè)升級(jí)，不斷研發(fā)創(chuàng)新。