武文波， 張?jiān)秸\， 李承佳， 馬紅燕， 楊曉軍

(延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院 延安市分析技術(shù)與檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 陜西 延安 716000)

1 引 言

L-抗壞血酸(L-ascorbic acid,Ascorbic acid,AA)又稱維生素C，是一種富含于水果和蔬菜中的水溶性維生素，也是維持機(jī)體正常生理功能的重要元素之一。AA在美白、組織修補(bǔ)、維持免疫功能、保持血管完整等過程中起著至關(guān)重要的作用，而長期缺乏AA則可能會引起敗血癥[1]。由于人體不能自身合成，只能從食物和藥物中攝取，因此，對于食品藥物中AA的分析具有重要意義[2]。目前，定量檢測AA的方法有FTIR[3]、自動(dòng)電位滴定[4]、HPLC[5]、紫外分光光度法[6]、動(dòng)態(tài)比濁法[7]、伏安法[8]和熒光分析法[9]等。

碳量子點(diǎn)(CQDs)是一種新型的碳納米功能材料，由于其顯著的光學(xué)性能、低細(xì)胞毒性、良好的光穩(wěn)定性、易于制備和環(huán)境友好等特性，在生物成像、光電催化、離子及藥物檢測等領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注[10]。目前，基于CQDs的“關(guān)-開”型AA熒光探針已有課題組報(bào)道[11-12]，但其信號僅基于單波長熒光強(qiáng)度信號檢測。由于熒光強(qiáng)度易受外部環(huán)境(如溫度、粘度)、儀器條件(如光散射、光漂白、背景光)等因素的影響，具有一定的波動(dòng)性。而比率型熒光探針通常是將具有兩種發(fā)射特性、不同發(fā)射波長的熒光材料構(gòu)建成熒光探針，使用單一波長激發(fā)下的兩個(gè)發(fā)射峰熒光強(qiáng)度比值的變化為信號，進(jìn)行目標(biāo)分析物的測定。兩個(gè)峰的信號比值可以減小干擾從而提高分析的靈敏度和準(zhǔn)確度[13-14]。因此，比率型熒光探針可廣泛應(yīng)用于化學(xué)傳感、環(huán)境檢測和生物分析等領(lǐng)域。目前，基于有機(jī)染料和半導(dǎo)體量子點(diǎn)比率熒光探針用于檢測金屬離子[15-16]、有機(jī)小分子[17]已有文獻(xiàn)報(bào)道，但半導(dǎo)體量子點(diǎn)內(nèi)在的細(xì)胞毒性、較差的水溶性和生物相容性限制了其進(jìn)一步的發(fā)展和應(yīng)用。CQDs的低毒性和環(huán)境友好性使其成為一種良好的替代品，但基于CQDs的比率型熒光分析法報(bào)道較少[18]。

本文以天然生物質(zhì)去皮的蓖麻為碳源，只加入水，無需添加其他試劑，采用一步水熱法合成了熒光性能良好的綠色蓖麻CQDs(CO-CQDs)。在紫外燈照射下，CO-CQDs的熒光發(fā)射峰位于405 nm處，呈藍(lán)色熒光；而曙紅Y(Eosin Y,EY)的熒光發(fā)射峰位于540 nm處，呈綠色熒光。CO-CQDs與EY可通過靜電引力、疏水作用力與氫鍵作用緊密結(jié)合，形成具有雙發(fā)射特性的CO-CQDs/EY比率型熒光探針，在紫外燈照射下，具有405 nm與540 nm兩個(gè)發(fā)射峰。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cr(Ⅵ)可顯著猝滅CO-CQDs/EY復(fù)合物于540 nm/405 nm雙發(fā)射峰處的熒光強(qiáng)度，而AA的加入僅可以使λem=540 nm處的熒光強(qiáng)度恢復(fù)，但λem=405 nm處的熒光強(qiáng)度基本不變。AA的濃度與該探針在540 nm/405 nm兩處的熒光強(qiáng)度比值呈良好線性關(guān)系，可用于樣品中AA含量的測定。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 試劑與儀器

測試儀器：F-2700型熒光分光光度計(jì)(日本日立儀器有限公司)；IR Prestige-21型傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津儀器有限公司)；HT7700型透射電鏡(TEM)(日本日立儀器有限公司)；FLSP920型瞬態(tài)穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀(英國愛丁堡儀器有限公司)。

EY(1.0×10-3mol/L)：準(zhǔn)確稱取0.064 8 g EY，加入5.00 mL乙醇溶解，攪拌、超聲后用水定容至100 mL容量瓶，置于冰箱 (4 ℃) 備用，使用時(shí)逐級稀釋。

K2Cr2O7(6.0×10-3mol/L)：準(zhǔn)確稱取0.176 5 g K2Cr2O7，加適量水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，定容，搖勻，備用。

AA標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0×10-3mol/L)：準(zhǔn)確稱取0.017 6 g AA標(biāo)準(zhǔn)品(廣東光華科技股份有限公司)，用水溶解，定容至100 mL容量瓶，置于冰箱 (4 ℃) 備用，使用時(shí)逐級稀釋。

Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液(pH=4.00)，蓖麻子去皮(市售)，西紅柿和檸檬采購于當(dāng)?shù)啬侈r(nóng)貿(mào)市場。

實(shí)驗(yàn)中所用水均是超純水，所用試劑均為分析純且沒有進(jìn)行任何后期處理。

2.2 CO-CQDs和CO-CQDs/EY復(fù)合物的合成

CO-CQDs的合成：將干凈無雜質(zhì)的蓖麻去皮、研碎，稱取15.00 g置于50 mL有聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓釜中，加入30.00 mL水，180 ℃加熱22 h。待高壓釜冷卻至室溫，得到顏色為深棕色的CO-CQDs懸浮液，經(jīng)濾紙、微孔濾膜(0.22 μm)依次過濾，定容至100 mL容量瓶，即得CO-CQDs溶液。稀釋200倍得CO-CQDs工作液，備用。

CO-CQDs/EY復(fù)合物的制備：將7.00 mL CO-CQDs工作液和3.00 mL EY(5.0×10-5mol/L)溶液加入15.00 mL pH=4.00的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液中，將混合物在室溫下超聲處理30 min后，即得CO-CQDs/EY復(fù)合物溶液。

2.3 基于CO-CQDs/EY比率型熒光探針的AA測定

向一系列10 mL比色管中依次加入1.00 mL CO-CQDs/EY復(fù)合物溶液、1.50 mL pH=4.00的Na2HPO4檸檬酸緩沖溶液、1.50 mL 6.0×10-3mol/L K2Cr2O7溶液以及不同濃度的AA溶液，用超純水定容，搖勻，室溫靜置半小時(shí)，測定其在單一激發(fā)波長λex=320 nm下，λ405與λ540處的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算其熒光強(qiáng)度比值I540/I405。

3 結(jié)果與討論

3.1 CO-CQDs的性質(zhì)表征

圖1(a) CO-CQDs的透射電鏡(TEM)圖顯示CO-CQDs呈規(guī)則的球形形態(tài)，平均粒徑10 nm，且分散性好、無團(tuán)聚現(xiàn)象。CO-CQDs的晶格形態(tài)可用XRD圖譜(圖1(b))表征，CO-CQDs在2θ為20.36°處有一個(gè)衍射寬峰，該峰為無定形態(tài)碳的特征峰，因此該CO-CQDs的晶型為無定型碳[19]。

圖1 CO-CQDs的透射電鏡圖(a)和XRD譜(b),不同激發(fā)下的CO-CQDs的熒光發(fā)射譜(c)和紅外光譜(d)。

Fig.1 Transmission electron micrograph(a), XRD spectrum(b), fluorescence emission spectra under different excitation(c) and FTIR spectra(d) of CO-CQDs.

3.2 基于AA測定的CO-CQDs /EY比率型熒光探針構(gòu)建

隨后，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(圖2)，在320 nm的紫外光照射下，單獨(dú)的CO-CQDs與EY的發(fā)射峰分別位于405 nm(黑線)與540 nm(紅線)處。而CO-CQDs/EY復(fù)合物出現(xiàn)了兩個(gè)發(fā)射峰(藍(lán)線)，分別位于405 nm與540 nm處，這分別顯示出CO-CQDs和EY的特征峰，相較單一CO-CQDs與EY，CO-CQDs/EY復(fù)合物發(fā)射峰位置沒變，熒光強(qiáng)度略有降低，進(jìn)一步說明CO-CQDs與EY二者之間有相互作用發(fā)生。二者復(fù)合實(shí)現(xiàn)了用單一波長激發(fā)而得到兩個(gè)熒光發(fā)射峰的設(shè)想。

進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，于CO-CQDs/EY溶液中加入Cr(Ⅵ)時(shí)，Cr(Ⅵ)可以與CO-CQDs/EY復(fù)合物相結(jié)合，形成有效的電子轉(zhuǎn)移[24]，使CO-CQDs/EY 405 nm與540 nm處的熒光強(qiáng)度均顯著降低(圖2綠線)，形成雙猝滅。FLSP920型瞬態(tài)穩(wěn)態(tài)熒光光譜壽命擬合結(jié)果顯示,CO-CQDs/EY和CO-CQDs/EY-Cr(Ⅵ)的加權(quán)平均熒光壽命[25]分別為1.65 ns和1.69 ns，τ0/τ≈1，表明Cr(Ⅵ)與CO-CQDs/EY體系之間是以靜態(tài)猝滅的方式相互作用的。

圖2 不同物質(zhì)結(jié)合的熒光發(fā)射譜

Fig.2 Fluorescence emission spectra of different component

于CO-CQDs/EY- Cr(Ⅵ)體系中加入AA后(圖2粉線)，EY的熒光逐漸恢復(fù)，而CQDs的熒光強(qiáng)度基本保持不變。圖3(a)為Cr(Ⅵ)與AA作用的紫外-可見吸收光譜，由圖可知，于Cr(Ⅵ)溶液中加入AA，Cr(Ⅵ)和AA之間可發(fā)生電子轉(zhuǎn)移的氧化還原反應(yīng)，使Cr(Ⅵ) 349 nm處的吸收峰消失。由于AA與Cr(Ⅵ)反應(yīng)，AA可將Cr(Ⅵ)從CO-CQDs/EY復(fù)合物的表面脫落下來，阻隔了Cr(Ⅵ)與CO-CQDs/EY的反應(yīng)。由于EY是包裹在CO-CQDs的周圍，所以其表面的Cr(Ⅵ)首先脫落下來，EY熒光恢復(fù)，其恢復(fù)程度與AA濃度呈線性關(guān)系(圖3(b))，而CQDs熒光強(qiáng)度不變，從而實(shí)現(xiàn)了用于檢測AA的比率型熒光探針的構(gòu)建。該方法的基本原理如圖4所示。

圖3 Cr(Ⅵ)-AA體系的紫外-可見吸收光譜(a)和CO-CQDs/EY與不同濃度AA溶液作用的熒光發(fā)射光譜(b)

Fig.3 UV-Vis absorption spectra of Cr(Ⅵ)-AA systems(a) and fluorescence emission spectra of CO-CQDs/EY interaction with different concentrations of AA solutions(b)

圖4 CO-CQDs比率型熒光探針作用機(jī)理圖

3.3 測定條件的優(yōu)化

3.3.1 酸度、緩沖溶液的種類及用量的影響

在不同酸度環(huán)境中，CO-CQDs和EY有不同的形態(tài)和存在型體，因此酸度對其熒光性質(zhì)有很大的影響。試驗(yàn)了不同酸度對CO-CQDs/EY體系的影響，如圖5所示，其熒光強(qiáng)度比值I540/I405在pH為3.78～9.00的范圍內(nèi)保持恒定，因此，實(shí)驗(yàn)選擇體系的酸度為4.00。此外，考察了HAc-NaAc、Na2HPO4-檸檬酸、檸檬酸-檸檬酸鈉和BR等緩沖溶液種類和緩沖溶液的用量對體系I540/I405的影響。結(jié)果表明,加入1.50 mL pH=4.00的Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液時(shí),I540/I405值最佳。

圖5 CO-CQDs/EY、CO-CQDs/EY-Cr(Ⅵ)、CO-CQDs/EY-Cr(Ⅵ)-AA的pH值優(yōu)化圖。

Fig.5 pH optimization of CO-CQDs/EY, CO-CQDs/EY-Cr(Ⅵ), CO-CQDs/EY-Cr(Ⅵ)-AA.

3.3.2 Cr(Ⅵ)用量的影響

考察了Cr(Ⅵ)用量對體系的影響。結(jié)果表明,Cr(Ⅵ)用量太少，反應(yīng)不完全，熒光響應(yīng)值?。籆r(Ⅵ)用量過大，影響熒光恢復(fù)的效率。試驗(yàn)了Cr(Ⅵ)溶液用量在0.1～2.0 mL范圍內(nèi)對體系熒光強(qiáng)度比值I540/I405的影響，如圖6所示，實(shí)驗(yàn)選擇Cr(Ⅵ)溶液用量為6.0×10-3mol/L 1.50 mL。

圖6 Cr(Ⅵ)的用量對CO-CQDs/EY-Cr(Ⅵ)和CO-CQDs/EY-Cr(Ⅵ)-AA體系的影響

Fig.6 Effect of Cr(Ⅵ) amount on CO-CQDs/EY-Cr(Ⅵ) and CO-CQDs/EY-Cr(Ⅵ)-AA system

3.3.3 反應(yīng)溫度的影響

實(shí)驗(yàn)考察了不同溫度對體系熒光強(qiáng)度比值I540/I405的影響，結(jié)果表明，加熱對體系無任何增敏作用，實(shí)驗(yàn)選擇不進(jìn)行加熱。

3.3.4 體系的穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)研究了不同的反應(yīng)時(shí)間對體系熒光強(qiáng)度比值I540/I405的影響，如圖7所示。結(jié)果表明，CO-CQDs/EY體系的熒光信號比值在室溫下反應(yīng)30 min可達(dá)穩(wěn)定，且在7.5 h內(nèi)保持不變。

圖7 反應(yīng)時(shí)間對體系的影響

3.4 檢出限及線性范圍

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，AA濃度在5.0×10-8～4.0×10-6mol/L范圍內(nèi)與CO-CQDs/EY體系位于兩發(fā)射波長處熒光強(qiáng)度的比值I540/I405呈良好線性關(guān)系，線性方程為I540/I405=2.51+9.3×105c(mol/L),r=0.993 9，對濃度為1.0×10-6mol/L的AA進(jìn)行5次平行測定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.85%。

根據(jù)IUPAC規(guī)定，方法檢出限σ=3S/K=3.7×10-8mol/L。

3.5 共存物質(zhì)的影響

3.6 實(shí)際樣品分析

3.6.1 藥片中AA含量的測定

隨機(jī)抽取同一批次的維生素C 10片(規(guī)格：0.1 g)，研磨成粉，準(zhǔn)確稱取適量粉末(相當(dāng)于0.017 6 g AA)，加水溶解，超聲后定容至100 mL容量瓶，搖勻、靜置10 min后過濾。準(zhǔn)確移取濾液適量，按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定，同時(shí)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表1。

表1 藥片中AA測定及回收率實(shí)驗(yàn)(n=5)

注：1. 廣東恒健制藥有限公司，產(chǎn)品批號：H44021171；2. 西安利君制藥有限責(zé)任公司，產(chǎn)品批號：1804176030。

3.6.2 水果和蔬菜中AA的測定

將新鮮蔬菜西紅柿和水果檸檬去皮取果肉，分別稱20 g置于研缽中，各加少許石英砂和20 mL 0.001% HCl充分研磨至勻漿，雙層紗布過濾至50 mL容量瓶中，0.001% HCl反復(fù)浸洗殘?jiān)V入容量瓶，0.001% HCl定容[26]，混勻，稀釋100倍備用。取1.00 mL待測果蔬提取液，按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定，同時(shí)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 水果和蔬菜中AA的測定(n=5)

4 結(jié) 論

本文構(gòu)建了一種基于AA高靈敏度檢測的CO-CQDs/EY復(fù)合物比率型熒光探針。以天然生物質(zhì)蓖麻為前驅(qū)體一步水熱法合成了綠色熒光CO-CQDs，與熒光極強(qiáng)的鹵代熒光素染料EY復(fù)合，二者形成了熒光發(fā)射峰相距較遠(yuǎn)的新型CO-CQDs/EY復(fù)合物?；贑r(Ⅵ)的加入可使復(fù)合物405 nm/540 nm處的熒光發(fā)生雙猝滅、而AA只使540 nm處的熒光有恢復(fù)作用的現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)了基于CO-CQDs/EY雙發(fā)射比率型熒光探針對AA的測定。該體系簡單、靈敏，有效消除了熒光測定的背景干擾，為AA測定提供了新方法，為碳量子點(diǎn)在分析化學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新思路。