謝力，皈燕

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科 四川南充 637000

結(jié)腸癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，多發(fā)于中年以上男性，早期無(wú)明顯癥狀，隨疾病發(fā)展表現(xiàn)為便血、腹瀉、便秘等[1]。結(jié)腸癌的病因目前尚不清楚，臨床主要采用外科手術(shù)治療，具有一定的臨床療效，但對(duì)于中晚期病灶廣泛伴隨遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者尚缺乏有效的治療手段[2]。尋找新的腫瘤標(biāo)識(shí)物評(píng)估結(jié)腸癌的病情發(fā)展和預(yù)后，分析其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，對(duì)結(jié)腸癌的治療具有重要作用。人轉(zhuǎn)錄因子叉頭框1（humanforkheadboxD1，F(xiàn)OXD1）是FOX家族成員之一，研究顯示[3-5]，F(xiàn)OXD1在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤均存在異常高表達(dá)，但其在結(jié)腸癌中的表達(dá)意義及作用機(jī)制目前尚不清楚。因此，本研究擬分析FOXD1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平及與患者臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系，并探討其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2014年1月至2015年12月72例在本院行結(jié)腸癌手術(shù)患者的結(jié)腸癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織（距離癌組織邊緣約3 cm）各一份，癌旁組織經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)診斷為正常黏膜組織。所納入患者術(shù)前均未接受放化療治療，并對(duì)治療內(nèi)容知情同意，未合并其他惡性腫瘤，未合并嚴(yán)重心腦血管、免疫系統(tǒng)或血液系統(tǒng)疾病，均無(wú)嚴(yán)重肝腎功能不全，具有術(shù)后3年隨訪有效資料。72例患者中，男性42例，女性30例；年齡40～80歲，平均年齡（60.35±8.79）歲；腫瘤直徑≤5 cm者40例，＞5 cm者32例；腫瘤分化程度：高分化9例，中分化39例，低分化24例；TNM分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期23例，Ⅲ期25例，Ⅳ期10例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例?；颊咝g(shù)后進(jìn)入隨訪，采用門診及電話形式進(jìn)行，每3～6個(gè)月一次，隨訪截止時(shí)間為2019年1月，隨訪記錄患者隨訪時(shí)狀態(tài)（存活、死亡或其他）等，72例患者均具有完整的術(shù)后3年生存隨訪資料。

1.2 材料與儀器

7500 RT-PCR系統(tǒng)購(gòu)自于美國(guó)Applied Biosystems公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)Gel Doc XR）購(gòu)自于美國(guó)Bio-Rad公司；人結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116購(gòu)自美國(guó)典型物種保藏中心；FOXD1 shRNA質(zhì)粒及對(duì)照Control-shRNA購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程公司；MTT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；TUNEL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；轉(zhuǎn)染試劑、RT-PCR試劑盒均購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；Transwell小室、Matrigel基底膜，購(gòu)自美國(guó)BD公司。FOXD1抗體、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。熒光顯微鏡（BX-2，日本OLYMPUS公司）；多功能酶標(biāo)檢測(cè)儀（iMark680，美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 檢測(cè)FOXD 1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

取結(jié)腸癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織勻漿后，采用RT-PCR測(cè)定兩組細(xì)胞中FOXD1 mRNA的表達(dá)水平，循環(huán)閾值（Ct值）表示cDNA達(dá)到指數(shù)擴(kuò)增所需的循環(huán)數(shù)，目的基因Ct值減去參照基因Ct值等于△Ct值，將△Ct值轉(zhuǎn)化為表達(dá)量進(jìn)行比較。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，以GAPDH作為內(nèi)參，F(xiàn)OXD1 mRNA上游引物：5’-ACAACTAAGCCTTTTTGAGG-3’， 下 游 引 物 ： 5’-AAAAGTACACCAGACAAGTG-3’；內(nèi)參GAPDH上游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA-3’，下游引物：5’-TTGAGGTCAATGAAGGGGTC-3’。采用 Western blot檢測(cè)組織中FOXD1蛋白的表達(dá)。使用細(xì)胞裂解液嚴(yán)格按照蛋白裂解步驟提取總蛋白，將50 μg提取的總蛋白樣品經(jīng)過(guò)SDS PAGE電泳轉(zhuǎn)印至PVDF膜，隨后加一抗（FOXD1，稀釋比例為1:1 000）4℃下孵育過(guò)夜，最后加二抗（HRP標(biāo)記的IgG，稀釋比例為1:5 000）37℃下孵育2 h，ECL法顯色。以β-actin為內(nèi)參，采用凝膠成像分析軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.4 沉默F(xiàn)OXD 1對(duì)SW1116細(xì)胞生物學(xué)行為的影響分析

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 采用含10%熱滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)SW1116細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。根據(jù)FOXD1序列設(shè)計(jì)siRNA FOXD1（siRNA序列：5’-GCGAGATCTGCGAGTTCATCA-3’，上海生工合成）和siRNA Control序列（序列：5’-GGCAATTACAAAATTTGATCA-3’，上海生工合成），并構(gòu)建至pGLV3載體。將培養(yǎng)細(xì)胞分為沉默F(xiàn)OXD1組和對(duì)照組，分別將Lipofectamine 2000脂質(zhì)體與FOXD1 shRNA質(zhì)粒、對(duì)照Control-shRNA混勻，按照轉(zhuǎn)染試劑操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以正常細(xì)胞為對(duì)照，采用RT-PCR檢測(cè)沉默效率達(dá)到92.16%。

1.4.2 轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染后48 h，測(cè)定采用RT-PCR和Western blot檢測(cè)FOXD1的表達(dá)情況。每組均設(shè)置6個(gè)重復(fù)。

1.4.3 MTT法測(cè)定SW1116細(xì)胞增殖情況 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW1116細(xì)胞，將單個(gè)細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL含103個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于0 h、24 h、48 h、72 h和96 h分別加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄MTT，150 μL DMSO作用30 min，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下的吸光度（OD值），繪制細(xì)胞增殖曲線。每組重復(fù)檢測(cè)6次。

1.4.4 Transwell檢測(cè)結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞的侵襲力取100 μL稀釋好的基質(zhì)膠均勻覆蓋于Transwell小室底部。取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW1116細(xì)胞，用0.2%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL。取100 μL稀釋好的細(xì)胞懸液加于上室，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h，取出Transwell小室，甲醇固定30 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)，共計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取平均值。每組重復(fù)檢測(cè)6次。

1.4.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞的遷移力取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW1116細(xì)胞接種到96孔板，常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層，棄去培養(yǎng)基，用滅菌的移液槍頭在皿底劃一直線，洗滌3次，常規(guī)培養(yǎng)，于顯微鏡下觀察劃痕處細(xì)胞生長(zhǎng)情況，根據(jù)劃痕寬度計(jì)算細(xì)胞遷移率。每組重復(fù)檢測(cè)6次。

1.4.6 檢測(cè)SW1116細(xì)胞的細(xì)胞凋亡情況 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW1116細(xì)胞，制作細(xì)胞涂片，嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒說(shuō)明操作染色。經(jīng)4%多聚甲醛固定，加入含0.1%TritonX-100的PBS冰浴2 min，洗滌2次，加入50 μL TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育60 min，加入100 μL打孔液，室溫避光孵育10 min，加入100 μL DAPI，室溫避光孵育10 min，洗滌3次，封片后置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。每組重復(fù)檢測(cè)6次。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，符合偏態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用M（QL，QU）表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行比較。采用Graphpad prism 5軟件進(jìn)行生存分析，采用Kaplan-Meier曲線描述生存情況，分別以3年總生存率和3年無(wú)病生存率作為觀察終點(diǎn)，采用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FOXD 1蛋白在結(jié)腸癌組織與癌旁正常組織中的表達(dá)

與癌旁正常組織相比，結(jié)腸癌組織中FOXD1蛋白和mRNA的表達(dá)量上調(diào)（均P＜0.05）。見(jiàn)圖1、表1。

圖 1FOXD 1蛋白在結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

表 1FOXD 1在結(jié)腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.2 FOXD 1 mRNA的表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

FOXD1 mRNA的表達(dá)與結(jié)腸癌患者的年齡、性別、腫瘤直徑無(wú)關(guān)（均P＞0.05），與腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 FOXD 1 mRNA的表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌患者預(yù)后生存的影響

FOXD1 mRNA在結(jié)腸癌癌組織中的表達(dá)量為1.51（1.29，1.76），將患者分為FOXD1 mRNA高表達(dá)組（≥1.51）和FOXD1 mRNA低表達(dá)組（＜1.51），每組各36例。結(jié)腸癌癌組織中FOXD1 mRNA高表達(dá)患者3年總生存率和3年無(wú)病生存率均低于FOXD1 mRNA低表達(dá)患者（Log-rankχ2=4.385、4.567，P=0.036、0.033）。見(jiàn)圖2。

2.4 結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果和增殖情況

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，沉默F(xiàn)OXD1組SW1116細(xì)胞FOXD1的蛋白和mRNA表達(dá)量下降（P＜0.05），轉(zhuǎn)染成功。MTT實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)OXD1組各時(shí)間點(diǎn)的SW1116細(xì)胞數(shù)量均少于對(duì)照組（均P＜0.05）。見(jiàn)圖3、表3。

2.5 各組SW1116細(xì)胞的侵襲力和遷移力情況

與對(duì)照組相比，沉默F(xiàn)OXD1組SW1116細(xì)胞的侵襲力和遷移率下降（均P＜0.05）。見(jiàn)圖4、表4。

表 2 FOXD 1 mRNA的表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

圖 2 FOXD 1 mRNA的表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

圖 3SW1116細(xì)胞FOXD 1蛋白的表達(dá)和細(xì)胞增殖情況

表 3SW1116細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果

圖 4 SW1116細(xì)胞的侵襲和遷移力（×400）

表 4 SW1116細(xì)胞的侵襲力和遷移率情況

2. 6 各組SW1116細(xì)胞的凋亡情況

沉默F(xiàn)OXD1組SW1116細(xì)胞凋亡率為（14.35±2.38）%，對(duì)照組為（5.76±0.76）%，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.422，P＜0.001）。見(jiàn)圖5。

圖 5SW1116細(xì)胞的凋亡情況（×400）

3 討論

結(jié)腸癌治療的關(guān)鍵在于早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早期手術(shù)根治。尋找特異性的分子標(biāo)識(shí)物用以輔助評(píng)估病情發(fā)展具有重要意義。FOXD1是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)控機(jī)體相關(guān)的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為[6]。腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均為臨床常用的評(píng)估結(jié)腸癌患者病情發(fā)展的指標(biāo)，與患者的預(yù)后相關(guān)[7]。李恒愛(ài)等[8]分析了622例結(jié)直腸癌患者的生存資料，發(fā)現(xiàn)手術(shù)方式、TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均為影響患者預(yù)后生存的獨(dú)立因素。Pan等[9]的研究顯示，F(xiàn)OXD1的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征相關(guān)，其低表達(dá)患者具有更高的生存率。本研究中，F(xiàn)OXD1在結(jié)腸癌癌組織中表達(dá)量上調(diào)，且其mRNA表達(dá)量與結(jié)腸癌患者的腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示FOXD1的異常高表達(dá)可能與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，此外，F(xiàn)OXD1 mRNA高表達(dá)患者的3年總生存率和無(wú)病生存率下降，提示FOXD1可能對(duì)結(jié)直腸癌患者的預(yù)后評(píng)估具有一定的潛在指導(dǎo)價(jià)值。

研究顯示，F(xiàn)OXD1同源蛋白FOXD3、FOXD4等均可通過(guò)多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)大腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，提示FOXD1可能通過(guò)某種機(jī)制參與調(diào)控結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展[10-11]。腫瘤細(xì)胞的惡性增殖加速了癌癥的發(fā)展，是影響患者預(yù)后的主要原因[12]。本研究中，沉默F(xiàn)OXD1后，結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活性下降，細(xì)胞凋亡率增加，提示FOXD1可能具有促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡的作用。腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散的基礎(chǔ)，也是影響惡性腫瘤患者預(yù)后的主要原因[13]。Tao等[14]的研究顯示，F(xiàn)OXD1可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)其惡性生物學(xué)行為。Wu等[15]的研究顯示，F(xiàn)OXD1可能通過(guò)調(diào)節(jié)RAC1B基因的表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。Gao等[16]的研究顯示，F(xiàn)OXD1基因沉默后可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)凋亡，有望作為膠質(zhì)瘤靶向治療的新基因。本研究中，沉默F(xiàn)OXD1后，結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力下降，提示FOXD1可能通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞的相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，促進(jìn)結(jié)腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，影響患者預(yù)后，與前述文獻(xiàn)[13-16]內(nèi)容相符。

綜上所述，F(xiàn)OXD1在結(jié)腸癌癌組織中表達(dá)量上調(diào)，且其表達(dá)量與患者腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，F(xiàn)OXD1 mRNA高表達(dá)患者的3年總生存率和無(wú)病生存率下降，沉默F(xiàn)OXD1基因后結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力受到抑制，細(xì)胞凋亡程度升高。本研究為FOXD1在結(jié)腸癌中的應(yīng)用提供了一定的理論支持，但FOXD1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的具體機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步深入研究。