季珂萌，成俊萍,2，王勇杰，張潤(rùn)祥，白熙，唐小川，王曉麗*

(1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005；2. 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西 南寧 530021)

近年來(lái)，卵母細(xì)胞的冷凍研究越來(lái)越受到研究者關(guān)注。冷凍保護(hù)劑對(duì)于卵母細(xì)胞的冷凍效果、細(xì)胞損傷情況至關(guān)重要，因此對(duì)于冷凍保護(hù)液配方的研究層出不窮，目前還沒(méi)有可以讓國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究學(xué)者統(tǒng)一使用的配方。而且卵母細(xì)胞保存過(guò)程仍存在許多缺陷。冷凍保存可降低卵母細(xì)胞質(zhì)量，使卵母細(xì)胞透明帶變硬，這些損傷可導(dǎo)致低受精率和發(fā)育潛力[1]。透明帶(zona pellucida，ZP)在受精、早期胚胎發(fā)育和著床過(guò)程中起著重要作用[2]，最早出現(xiàn)在初級(jí)卵泡中，由卵母細(xì)胞和卵泡細(xì)胞共同分泌。ZP特征反映了卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力[3-4]，與成熟期和受精期相關(guān)[5]。卵母細(xì)胞透明帶厚度(zona pellucida thickness，ZPT)、透明帶厚度變量(zona pellucida thickness variance，ZPTV)和透明帶雙折射(zona pellucida birefringence，ZPB)是檢測(cè)卵母細(xì)胞透明帶的主要參數(shù)[6-8]。本研究通過(guò)比較卵母細(xì)胞的存活率、受精率、卵裂率和囊胚形成率，探討了四種冷凍保護(hù)液配方在小鼠卵母細(xì)胞中的應(yīng)用效果。此外，還檢測(cè)了ZPT、ZPTV、ZPB和超微結(jié)構(gòu)，以進(jìn)一步評(píng)估卵母細(xì)胞玻璃化的損傷。為改進(jìn)玻璃化冷凍方法，提高玻璃化冷凍復(fù)蘇后卵母細(xì)胞受精率提供研究思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4～5周齡雌性昆明白小鼠購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 玻璃化冷凍載體(cryoleaf)的制備

以0.25 mL普通麥管為材料，將麥管有棉塞的部分剪去，然后一分為二。取其中一根麥管，在其一端用解剖刀剪成約20 mm長(zhǎng)、2 mm寬的矩形薄片。

1.1.3 操作液

卵巢及卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體操作液：M2液。卵母細(xì)胞操作液及培養(yǎng)液：M199+5%FBS(胎牛血清)。

1.1.4 玻璃化冷凍液體

基礎(chǔ)液(HM)：TCM199+20%FCS；FS：0.3 g·mol/L聚蔗糖+0.5 mol/L蔗糖+HM；EDFS液：EG∶DMSO∶FS=1.5∶1.5∶7(V/V)的比例混勻。4組冷凍保護(hù)液配方如表1。

表1 4種冷凍液配方

組別平衡液冷凍液1HM+7.5%EG+7.5%DMSOHM+15%EG+15%DMSO+0.5 mol/L Su2HM+7.5%EG+7.5%DMSO+0.5 mol/L SuHM+15%EG+15%DMSO+0.5 mol/L Su3HM+10%EG+10%DMSOHM+20%EG+20%DMSO+0.5 mol/L Su4HM+10%EG+10%DMSOEDFS液

注:HM∶EG∶DMSO體積比V∶V∶V

解凍液①：HM+1mol/L Su；解凍液②：HM+0.5mol/L Su；解凍液③：HM

1.2 方法

1.2.1 卵母細(xì)胞采集

飼喂于25 ℃、自然采光條件下的4～5周齡的雌性小鼠，注射PMSG 10 IU/只，48 h后注射hCG 10 IU/只，13～16h后在輸卵管膨大部中收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)。將COCs移入含300 IU/mL透明質(zhì)酸酶的M2液中，在37 ℃恒溫臺(tái)上輕輕吹打數(shù)次，收集形態(tài)正常有第一極體的卵母細(xì)胞于卵母細(xì)胞操作液中洗凈后供實(shí)驗(yàn)用。

1.2.2 體外受精

取雄性小鼠附睪，擠刮出精液于平衡8 h的受精液 HTF液滴中，置于培養(yǎng)箱10 min，使精子分散上浮。然后用寬徑槍頭吸取液面精子移入下一個(gè)平衡好的HTF液中，放入培養(yǎng)箱1.5～2 h使精子獲能。將精子懸液用HTF液稀釋，觀察受精活力并將濃度調(diào)至(1～2.5)×106個(gè)/mL。卵母細(xì)胞洗凈后移入稀釋后的精子懸液中，放入培養(yǎng)箱中5～6 h后，顯微鏡下觀察，卵母細(xì)胞內(nèi)看到第二極體和雙原核出現(xiàn)則表示已受精。將受精成功的卵母細(xì)胞用操作液洗兩次后移入培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)16～24后觀察卵裂情況；5～7 d后觀察囊胚情況。

1.2.3 卵母細(xì)胞玻璃化冷凍-解凍

冷凍：將試驗(yàn)所需的溶液及器具于37 ℃溫箱中充分平衡。將卵母細(xì)胞移入預(yù)處理液中平衡5 min后，移入玻璃化冷凍液，在1 min內(nèi)將卵母細(xì)胞移到cryoleaf上，并盡量吸走多余的冷凍液，迅速投入液氮中冷凍保存。解凍：將cryoleaf從液氮中取出后，迅速將其前段浸入解凍液①中1 min，在顯微鏡中回收卵母細(xì)胞后移入解凍液②中3 min，最后移入卵母細(xì)胞培養(yǎng)液。洗凈后，挑選形態(tài)正常的卵母細(xì)胞置于卵母細(xì)胞培養(yǎng)液放入CO2培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2，濕度100%)中培養(yǎng)10 min。

1.2.4 電鏡樣品制備及觀察

各組卵母細(xì)胞經(jīng)戊二醛前固定和四氧化鋨后固定，用二甲胂酸鈉水洗，乙醇梯度脫水，六甲基二硅胺烷干燥和真空干燥，最后采取多次短時(shí)的方式進(jìn)行離子噴鍍，在掃描電子顯微鏡(SEM，VEGA3 TESCAN)下觀察采集圖像。

1.2.5 ZPT和ZPB檢測(cè)

各組透明帶ZPB和ZPT檢測(cè)方法如文獻(xiàn)[7]所述；ZPTV計(jì)算 ZPTV=(透明帶最厚值-透明帶平均厚度值)/透明帶平均厚度值×100

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

ZPT、ZPTV和ZPB結(jié)果以(平均值±SEM)表示，SPSS軟件根據(jù)方差齊性選擇檢驗(yàn)方法比較各組間的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同玻璃化冷凍保護(hù)液對(duì)卵母細(xì)胞的影響

卵母細(xì)胞分組后，除對(duì)照組外，各組分別經(jīng)過(guò)玻璃化冷凍及復(fù)蘇，發(fā)現(xiàn)解凍后的卵母細(xì)胞有部分出現(xiàn)胞質(zhì)輕微固縮、破碎或過(guò)度脹大，細(xì)胞透明帶脫落，體外受精后部分卵母細(xì)胞分裂不均勻或沒(méi)有分裂(如圖1)。恢復(fù)培養(yǎng)2 h后，體外受精，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，如表2所示，1-4組玻璃化冷凍復(fù)蘇后存活率和受精率均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。1組存活率顯著高于4組(P<0.05)，受精率顯著高于2組(P<0.05)，其余各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，卵裂率及囊胚率各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但均低于對(duì)照組，且1組均高于其他冷凍液組。因此選用對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育潛力損傷最小的1組(HM+7.5%(DMSO+EG)，HM+15%(DMSO+EG)+0.5 mol/L Su)進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

a:正常卵母細(xì)胞；b:解凍后透明帶脫落；c:均勻卵裂；d:卵裂不均勻

圖1 玻璃化冷凍對(duì)卵母細(xì)胞形態(tài)的影響

表2 不同玻璃化冷凍保護(hù)液對(duì)小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響(n=3)

組別卵母細(xì)胞數(shù)存活率/%受精率/%卵裂率/%囊胚率/%18486.90±0.20a69.86±0.15a74.51±0.03ab60.53±0.02ab210976.15±0.14ab54.22±0.12b73.33±0.03ab57.58±0.07ab38383.13±0.03ab55.07±0.07ab65.79±0.09a56.00±0.96ab49174.73±0.10b67.65±0.04ab76.09±0.09ab51.43±0.02a對(duì)照組97100±0.00c87.63±0.03c82.35±0.02b72.86±0.05b

注：同一列中具有不同上標(biāo)為顯著差異，P<0.05。下同

2.2 玻璃化冷凍對(duì)透明帶厚度、厚度變量和雙折射分值的影響

選用2.1中對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育潛力損傷最小的冷凍液，分別檢測(cè)對(duì)照組、冷凍液處理組(過(guò)冷凍液，不經(jīng)冷凍程序)和冷凍組卵母細(xì)胞透明帶ZPB和ZPT，并計(jì)算ZPTV。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，見(jiàn)表3，冷凍組的ZPT值、ZPB值顯著大于對(duì)照組和冷凍液處理組(P<0.05)，冷凍液處理組的ZPT和ZPB與對(duì)照組相比差異不顯著。三組的ZPTV差異不顯著。

表3 玻璃化冷凍對(duì)小鼠卵母細(xì)胞ZPT、ZPTV和ZPB的影響

組別卵母細(xì)胞數(shù)透明帶厚度/μm厚度變量ZPTV雙折射分值ZPB對(duì)照組1565.77±0.60a13.27±0.491.22±0.21a處理組805.74±0.33a14.16±0.731.31±0.41a冷凍組656.05±0.10b14.54±0.950.30±0.38b

通過(guò)對(duì)上述結(jié)果進(jìn)一步用Pearson法分析，見(jiàn)表4，ZPT與ZPB相關(guān)關(guān)系顯示出ZPT值隨ZPB增大而減小r=-0.299(P<0.05)，兩者呈負(fù)相關(guān)；ZPTV與ZPB之間無(wú)相關(guān)關(guān)系。

表4 卵母細(xì)胞ZPT、ZPTV和ZPB之間的相關(guān)性

ZPTZPTVZPBPearson correlation-0.299-0.026Sig.(2-tailed)0.0000.725Data NO.301301

2.3 玻璃化冷凍卵母細(xì)胞透明帶超微結(jié)構(gòu)的變化

將各組卵母細(xì)胞處理后在掃描電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)大部分卵母細(xì)胞透明帶完整的包裹卵母細(xì)胞，表面十分粗糙，呈粗網(wǎng)狀或不規(guī)則窗孔狀(如圖2a-b)，部分卵母細(xì)胞透明帶雖然完整，但表面較平滑，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)已不清晰，只見(jiàn)小而淺的小孔(如圖2c-d)；一些卵母細(xì)胞出現(xiàn)透明帶呈熔融狀，表面凹凸不平但不粗糙，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)融化消失(如圖2e-f)，甚至出現(xiàn)卵母細(xì)胞透明帶破裂，與卵母細(xì)胞分離，脫落(如圖2g-h)。

經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，如表5所示，發(fā)現(xiàn)三組中冷凍組的粗ZP率最低(44.8%對(duì)92.9%和84.8%)(P<0.05)，而光滑ZP率最高(31.0%對(duì)7.4%和9.1%)(P<0.05)。同時(shí)，冷凍液處理組和冷凍組的ZP熔融率也高于對(duì)照組。

a-b:正常卵母細(xì)胞粗糙透明帶表面，c-d:卵母細(xì)胞透明帶表面部分光滑，e-f: 卵母細(xì)胞透明帶熔融狀，g-h:卵母細(xì)胞透明帶部分脫落

圖2 玻璃化冷凍對(duì)卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

表5 玻璃化冷凍對(duì)卵母細(xì)胞透明帶超微結(jié)構(gòu)的影響

組別卵母細(xì)胞數(shù)粗ZP/%光滑ZP/%熔融ZP/%破裂ZP/%對(duì)照組2792.9 (25/27)a7.4 (2/27)a0 (0/27)a0 (0/27)處理組3384.8 (28/33)a9.1 (3/33)a6.1 (2/33)ab0 (0/33)冷凍組2944.8 (13/29)c31.0 (9/29)c17.2 (5/29)bc6.9 (2/29)

3 討論

卵母細(xì)胞玻璃化冷凍研究雖然取得了顯著進(jìn)展，然而冷凍復(fù)蘇后卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力仍低于新鮮卵母細(xì)胞[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，乙二醇(EG)的滲透性最好毒性最低，而二甲基亞砜(DMSO)的玻璃化能力較強(qiáng)。目前，綜合冷凍保護(hù)劑的冷凍保護(hù)效果和細(xì)胞毒性，EG和DMSO聯(lián)合使用的冷凍液保護(hù)配方較為廣泛[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，使用15%EG、15%DMSO、0.5 M蔗糖和20%胎牛血清對(duì)大鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化冷凍復(fù)蘇后，可以獲得最佳的存活率和卵裂率，但透明帶精子穿透率低，皮質(zhì)顆粒胞吐率高[1]。本研究也發(fā)現(xiàn)，HM+7.5%(DMSO+EG)，HM+15%(DMSO+EG)+0.5 mol/L Su冷凍液配方對(duì)小鼠卵母細(xì)胞發(fā)育潛力影響較小。其原因可能是在細(xì)胞冷凍的平衡過(guò)程中，防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰或暴露在高溶質(zhì)濃度的溶液中造成細(xì)胞損傷[11]。盡管如此，卵母細(xì)胞損傷仍然存在，這可能與冷凍保護(hù)劑濃度高引起的細(xì)胞毒素以及冷凍過(guò)程中環(huán)境溫度過(guò)低引起的各種卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[12]。

ZPT是通過(guò)透明帶評(píng)估卵母細(xì)胞質(zhì)量的指標(biāo)之一，有試驗(yàn)證實(shí)，ZPT小的卵母細(xì)胞更容易受精[5]。ZPTV是一個(gè)反映透明帶厚薄均勻程度的指標(biāo)，值越大說(shuō)明透明帶厚薄越不均勻。ZPTV較大的胚胎妊娠率較高，因此ZPTV也是一個(gè)通過(guò)透明帶評(píng)估卵母細(xì)胞及胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛力的重要指標(biāo)之一。在本研究中發(fā)現(xiàn)，冷凍組ZPT顯著高于對(duì)照組和處理組，但ZPTV與其他兩個(gè)組差異不顯著。此結(jié)果表明，玻璃化冷凍主要使得卵母細(xì)胞透明帶變厚，進(jìn)而使得冷凍復(fù)蘇后卵母細(xì)胞受精率降低；同時(shí)，玻璃化冷凍不會(huì)影響透明帶厚薄均勻程度，可見(jiàn)玻璃化冷凍復(fù)蘇的卵母細(xì)胞成功受精后的妊娠率所受影響不大，這也與其他人的研究結(jié)果相符[13]。此外，處理組的ZPT和ZPTV均和對(duì)照組差異不顯著，反映出冷凍保護(hù)液不影響透明帶的厚度及厚度變量，據(jù)此推斷玻璃化冷凍后卵母細(xì)胞透明帶厚度的變化主要是由冷凍低溫環(huán)境造成的。

ZPB與其大分子結(jié)構(gòu)相關(guān)，ZPB的變化意味著透明帶的大分子結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化。研究證實(shí)，ZPB與體外受精率及囊胚形成有關(guān)，且ZPB越大發(fā)育潛力越好[14-15]。本研究結(jié)果可見(jiàn)冷凍組ZPB顯著低于處理組和對(duì)照組，處理組和對(duì)照組之間差異不顯著，由此可知，玻璃化冷凍過(guò)程中的低溫環(huán)境對(duì)透明帶大分子結(jié)構(gòu)造成了不良影響，使得ZPB降低，表明這種不良影響引起玻璃化冷凍復(fù)蘇的卵母細(xì)胞體外受精率及囊胚形成率降低。Bogliolo等[16]用Raman射線探究玻璃化冷凍對(duì)透明帶分子結(jié)構(gòu)的變化，證實(shí)了玻璃化冷凍復(fù)蘇后的卵母細(xì)胞透明帶結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。在本研究中，用掃描電鏡檢測(cè)ZP發(fā)現(xiàn)，玻璃化冷凍復(fù)蘇后卵母細(xì)胞透明帶結(jié)構(gòu)發(fā)生部分改變，而新鮮卵母細(xì)胞和只經(jīng)歷冷凍程序沒(méi)有液氮冷凍的卵母細(xì)胞間差異不顯著，這個(gè)研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相一致。

進(jìn)一步分析ZPT、ZPTV和ZPB的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)ZPT和ZPB之間存在顯著負(fù)相關(guān)，而ZPTV和ZPB之間相關(guān)性不顯著。可以推斷，玻璃化冷凍對(duì)卵母細(xì)胞透明帶的分子結(jié)構(gòu)有顯著影響，這種影響可能導(dǎo)致透明帶厚度整體變大而不是局部變厚，這些變化均導(dǎo)致透明帶與精子的作用受到影響，進(jìn)而使得卵母細(xì)胞玻璃化冷凍復(fù)蘇后受精率下降。而根據(jù)處理組和對(duì)照組之間差異不顯著的結(jié)果，可推斷玻璃化冷凍對(duì)卵母細(xì)胞物理特性的影響不是冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞毒性，可能是低溫環(huán)境或者其他不良因素造成的。此外，ZPT和ZPB間存在的相關(guān)性也側(cè)面證實(shí)ZPT作為評(píng)估卵母細(xì)胞及胚胎質(zhì)量指標(biāo)的可靠性，在ZPB測(cè)量存在一定困難的條件下，ZPT從一定程度上也能體現(xiàn)ZPB所能指示的結(jié)果。