劉佳璐，鄭維，范若辰，權(quán)春善

(1.大連民族大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院；b.生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116600；2.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連116024)

0引言

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，是導(dǎo)致奶牛乳房炎的主要病原菌之一[1-4]，其中的SaeRS雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控多種毒力因子的表達(dá)，由傳感器組氨酸激酶SaeS和響應(yīng)調(diào)節(jié)劑SaeR以及脂蛋白SaeP、膜蛋白SaeQ等兩種輔助蛋白組成。SaeP與SaeQ以及SaeS共同形成三元復(fù)合物[5-6]，該三元復(fù)合物可以激發(fā)SaeS磷酸酶活性，對(duì)SaeR蛋白進(jìn)行磷酸化，使下游的Sae操縱子表達(dá)，最終激發(fā)多種毒力因子生成。SaeP蛋白表達(dá)量較低，限制了Sae系統(tǒng)的深入研究。本課題以優(yōu)化SaeP蛋白表達(dá)條件為目的，通過改變重組載體構(gòu)建方式和誘導(dǎo)溫度等方式，確定最優(yōu)SaeP表達(dá)條件，提高SaeP蛋白的表達(dá)量，推動(dòng)SaeRS系統(tǒng)的整體研究，為研究金黃色葡萄球菌致病機(jī)理提供理論依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)

1.1材料與試劑

1.1.1菌種和質(zhì)粒

金黃色葡萄球菌、p ET-28a、Tuner(DE3)、C43(DE3)、BL21(DE3)-pLysS以及BL21(DE3)-RIL均由本實(shí)驗(yàn)室保存。含有saep基因的質(zhì)粒pET-28a-saep由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。Trans5αChemically Competent Cell（目錄號(hào)：CD201）和BL21(DE3)Chemically Competent Cell（BL21(DE3)目錄號(hào)：CD601）。

1.1.2主要試劑

Nco I，Xho I，T4 DNA Ligase，Dpn I，DL2,000 DNA Marker，Blue Plus II Protein Marker(14-120 ku)，WB封閉液（in PBS）、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，基因組提取試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒，Axyprep PCR清潔試劑盒，配制培養(yǎng)基用酵母提取物、胰蛋白胨，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3溶液與培養(yǎng)基的配制

1 mmol/L IPTG的配制：將2.38 g IPTG溶解于水中，定容至100 mL。

LB培養(yǎng)基配方（1 L）：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g，定容至1 L。配制固體培養(yǎng)基則再加入20 g的瓊脂粉。配制完成后將p H值調(diào)節(jié)至7.0，使用時(shí)根據(jù)需要添加抗生素。

SOB培養(yǎng)基配方（1 L）：蛋白胨20 g、酵母提取物5 g、氯化鈉0.5 g加入950 mL水溶解后，加入濃度為0.25 mol/L的KCl溶液10 mL，用NaOH調(diào)節(jié)p H值到7.0，定容至1 L，高壓滅菌20 min。(該溶液使用前加入5 mL滅菌的濃度為0.002 mol/L的MgCl2溶液)。

SOC培養(yǎng)基：將SOB培養(yǎng)基高壓滅菌后，降低溫度到60℃以下時(shí)，加入20 mL用0.22μm濾膜過濾除菌的濃度為1 mol/L葡萄糖溶液，即為SOC培養(yǎng)基。

1.1.4 4種感受態(tài)細(xì)胞的制備

采用氯化鈣法[7]將Tuner(DE3)、C43(DE3)、BL21(DE3)-pLysS以及BL21(DE3)-RIL制作成相應(yīng)的感受態(tài)細(xì)胞。

In the first experiment,we demonstrate the performance of the proposed algorithm under different angular distributed functions.The parameters of two ID sources areandThe numberof snapshots is set as T=500 and the Signal-to-Noise Ratio(SNR)is equal to 5 dB.We perform the algorithm in three cases:

1.2方法

1.2.1重組質(zhì)粒pET-28a-saep的構(gòu)建

通過酶切酶連的方式重新構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET-28a-sae p。選取酶切位點(diǎn)為Nco I和Xho I，引物設(shè)計(jì)序列見表1。重組質(zhì)粒構(gòu)建完成后，通過雙酶切的方法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。

通過無限克隆法(Restriction Free Cloning，RF法)構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET-28a-saep。用RF-Cloning設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)序列見表1。通過PCR儀對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，并且將目的基因與質(zhì)粒pET-28a相連，完成重組質(zhì)粒pET-28a-saep的構(gòu)建。通過對(duì)重組質(zhì)粒pET-28a-saep的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳驗(yàn)證。

引物的合成以及檢測(cè)結(jié)果正確的質(zhì)粒的測(cè)序工作均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。SDS-PAGE分析以及Western blot檢測(cè)。通過Western Blot實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，再通過SDS-PAGE蛋白電泳將兩種方法構(gòu)建的重組蛋白進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2.3宿主菌的優(yōu)化

將重組質(zhì)粒p ET-28a-saep分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)、Tuner(DE3)、C43(DE3)、BL21(DE3)-p LysS以及BL21(DE3)-RIL中，均勻涂布于帶有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，培養(yǎng)10 h，再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，OD 600達(dá)到0.6時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG。30℃誘導(dǎo)8 h后，分別取5種不同宿主的菌液進(jìn)行超聲破碎后，離心30 min，取上清作為樣品加入進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.4誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化

根據(jù)本文2.2.2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇最適宜的宿主菌BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化。將已經(jīng)轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pET-28a-saep的BL(DE3)接種LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10 h，再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD 600達(dá)到0.6時(shí)加入IPTG，至終濃度分別為0，0.5，0.9，1.3和1.5 mmol/L，30℃誘導(dǎo)8 h，分別取5種不同誘導(dǎo)劑濃度的菌液進(jìn)行超聲破碎后，離心30 min取上清作為樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

根據(jù)上述2.2.3中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將誘導(dǎo)劑終濃度定為0.5 mmol/L，進(jìn)行下一步誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化。將溫度按梯度分為16，20，24，28以及30℃（原誘導(dǎo)溫度），誘導(dǎo)時(shí)間分為8，12，24 h，分別進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，具體誘導(dǎo)溫度與誘導(dǎo)時(shí)間的設(shè)置如表2所示。

表2誘導(dǎo)時(shí)間及溫度設(shè)置

按實(shí)驗(yàn)計(jì)劃進(jìn)行活化、轉(zhuǎn)接、誘導(dǎo)、收菌和破碎，離心后取上清作為樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Quantity One軟件進(jìn)行蛋白定量分析，采用2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析（P≤0.05）。

表1引物序列

1.2.2構(gòu)建方式的優(yōu)化

將兩種方式構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入BL21(DE3)宿主中，涂布于含卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，培養(yǎng)10 h，將菌液以1%的接種量接種于50 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min進(jìn)行培養(yǎng)，OD 600達(dá)到0.6時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG。30℃誘導(dǎo)8 h后，將菌液進(jìn)行超聲破碎后離心30 min，取上清作為樣品，進(jìn)行

2結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒的構(gòu)建和驗(yàn)證

2.1.1酶切酶連法構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-saep驗(yàn)證結(jié)果

圖1為酶切酶連法構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET-28a-saep雙酶切鑒定電泳結(jié)果圖。由圖1可以看出，重組質(zhì)粒條帶大小與預(yù)期相符，且雙酶切后出現(xiàn)與目的基因條帶大小一致的電泳條帶，質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果正確，認(rèn)定酶切酶連法成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。

圖1酶切酶連法構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-saep雙酶切鑒定電泳結(jié)果

2.1.2 RF法構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET-28a-saep驗(yàn)證結(jié)果

由圖2可以看出，以重組質(zhì)粒pET-28a-saep為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能夠擴(kuò)增出單一且分子量大小符合預(yù)期的目的條帶。質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果正確，認(rèn)定通過RF法成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。圖2中，1～3為saep基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖2 PCR產(chǎn)物的驗(yàn)證結(jié)果

2.2重組蛋白表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果

重組質(zhì)粒pET-28a-saep轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)的誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，未添加IPTG誘導(dǎo)的產(chǎn)物與添加IPTG誘導(dǎo)后的產(chǎn)物在大約16 ku位置存在顯著差異。Western blot結(jié)果如圖3所示，表達(dá)產(chǎn)物能夠與帶有組氨酸標(biāo)簽的抗體結(jié)合，從而顯現(xiàn)出一條清晰的條帶，大小符合預(yù)期。

2.3構(gòu)建方式的優(yōu)化結(jié)果

由圖4(a)可知，RF法與酶切酶連法構(gòu)建的重組蛋白相對(duì)表達(dá)量有明顯差異。通過Quantity One和SPSS軟件對(duì)其進(jìn)行分析可知，全菌體蛋白狀態(tài)對(duì)比下，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示RF法構(gòu)建全菌體蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯高于酶切酶連法構(gòu)建全菌體蛋白的相對(duì)表達(dá)量，更利于后續(xù)純化工作的進(jìn)行。鎳離子親和層析純化后的酶切酶連法構(gòu)建重組表達(dá)蛋白進(jìn)一步損失，而RF法構(gòu)建重組蛋白SaeP的相對(duì)表達(dá)量大幅提高，所以選擇RF法構(gòu)建的重組質(zhì)粒p ET-28a-saep繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究。

2.4宿主菌的優(yōu)化結(jié)果

通過Quantity One和SPSS軟件對(duì)重組蛋白SaeP的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。由圖4(b)可知，通過RF法構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET-28a-saep以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌時(shí)相對(duì)表達(dá)量高于其他宿主菌，占菌體蛋白的19.9%，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌與其他宿主菌相比，具有顯著差異，所以選擇以大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。重組蛋白的表達(dá)量受基因自身性質(zhì)、表達(dá)載體宿、主菌以及培養(yǎng)條件等多種因素的影響，通過對(duì)比不同宿主菌對(duì)于重組SaeP蛋白的表達(dá)量，以確定較為適合的宿主菌,提高了表達(dá)效率[8-11]。

圖3重組表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE蛋白電泳圖及WesternBlot結(jié)果

2.5誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化結(jié)果

通過Quantity One和SPSS軟件對(duì)重組蛋白SaeP的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，如圖4(c)所示，重組蛋白的相對(duì)表達(dá)量在IPTG終濃度為0～0.5 mmol/L范圍內(nèi)，成上升趨勢(shì)，當(dāng)IPTG終濃度達(dá)到0.5 mmol/L時(shí)重組SaeP蛋白的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到峰值，占菌體蛋白的20.16%。誘導(dǎo)劑IPTG的濃度與蛋白表達(dá)速率相關(guān)，在一定范圍內(nèi)提高IPTG的濃度會(huì)提高蛋白的表達(dá)量，但濃度進(jìn)一步提高后，相對(duì)表達(dá)量反而有所減少，說明IPTG具有一定的細(xì)胞毒性，濃度過高不利于菌株的生長并且抑制細(xì)胞活性，所以適當(dāng)降低IPTG的濃度可能更利于重組蛋白的表達(dá)[11-13]。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)重組蛋白相對(duì)表達(dá)量與其他濃度相比，具有顯著差異，所以在本實(shí)驗(yàn)中，選擇濃度為0.5 mmol/L作為誘導(dǎo)重組蛋白SaeP的誘導(dǎo)劑濃度。

2.6誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果

圖4誘導(dǎo)條件優(yōu)化結(jié)果

通過Quantity One和SPSS軟件對(duì)重組蛋白SaeP的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。由圖4(d)可知，在誘導(dǎo)條件為16℃誘導(dǎo)8 h，16℃誘導(dǎo)12 h，16℃誘導(dǎo)24 h及24℃誘導(dǎo)8 h相對(duì)表達(dá)量較高，通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)低溫誘導(dǎo)條件下重組蛋白表達(dá)效果更好。低溫條件下菌體生長速率下降，很大程度上避免了菌體失活與質(zhì)粒穩(wěn)定性下降等問題，低溫誘導(dǎo)能夠提高外源蛋白穩(wěn)定性和可溶性，從而增加了重組蛋白的表達(dá)量[14]。重組SaeP蛋白在16℃條件下誘導(dǎo)8 h后，并沒有隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長而明顯增加。推測(cè)原因是隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，菌體內(nèi)蛋白酶對(duì)重組蛋白的降解量增加，并且誘導(dǎo)時(shí)間過長產(chǎn)生的氨基酸會(huì)抑制目的蛋白的合成，所以長時(shí)間的誘導(dǎo)不利于重組蛋白的表達(dá)[15-16]。所以選擇16℃誘導(dǎo)8 h為重組SaeP蛋白的誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間。

3結(jié)論

本研究通過改變重組載體構(gòu)建方式、宿主菌、誘導(dǎo)劑終濃度、誘導(dǎo)時(shí)間誘導(dǎo)溫度等，對(duì)金黃色葡萄球菌SaeP蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高SaeP蛋白的表達(dá)量。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無限克隆方法獲得的表達(dá)載體在各條件的試驗(yàn)中，表達(dá)量均高于酶切酶連方法所得到的表達(dá)載體，因此條件優(yōu)化部分全部以無限克隆方法得到的表達(dá)載體為主要研究對(duì)象。成功優(yōu)化金黃色葡萄球菌SaeP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件，最佳表達(dá)條件為：通過無限克隆法建重組質(zhì)粒，以BL21(DE3)為轉(zhuǎn)化宿主，IPTG濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為16℃，誘導(dǎo)時(shí)間為8 h，金黃色葡萄球菌SaeP蛋白的最高表達(dá)量占總蛋白的35.14%，較原誘導(dǎo)條件提高25.49%，為促進(jìn)金黃色葡萄球菌的Sae系統(tǒng)對(duì)于毒力因子生成研究的提供支持。