黃 海，陳 梅，馬 麗，李景平

深圳市南山區(qū)西麗人民醫(yī)院，廣東 深圳 518000

子癇前期(Preeclampsia，PE)是妊娠期特發(fā)的多系統(tǒng)類型疾病，是一種因血管痙攣致器官灌注量低于內(nèi)皮激活的繼發(fā)疾病。該疾病對圍生期母嬰安全造成極大威脅而作為產(chǎn)科病理學(xué)的重點研究項目，現(xiàn)有研究未能較好闡明該病的發(fā)病機(jī)制，對子癇前期的早診治產(chǎn)生不良影響。CD44為最主要的淋巴細(xì)胞歸巢受體，其在淋巴細(xì)胞再循環(huán)、活化及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，影響母體與胎兒的免疫平衡?，F(xiàn)有研究認(rèn)為胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡及Fas/FasL調(diào)控系統(tǒng)的表達(dá)與子癇前期發(fā)生存在聯(lián)系，較少研究提出CD44在子癇前期產(chǎn)婦淋巴細(xì)胞中的表達(dá)與淋巴細(xì)胞凋亡相關(guān)性，本研究本研究通過對我院子癇前期產(chǎn)婦及正常產(chǎn)婦胎盤淋巴細(xì)胞凋亡及CD44表達(dá)水平來探索其與子癇前期的相關(guān)性，現(xiàn)將本次研究報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以深圳市南山區(qū)西麗人民醫(yī)院2016年6月1日-2017年11月30日住院分娩的無產(chǎn)科合并癥及內(nèi)外科合并癥產(chǎn)婦120例為研究對象，其中子癇前期產(chǎn)婦60例為研究組，正常產(chǎn)婦60例為對照組。子癇診斷標(biāo)準(zhǔn)：以《實用婦產(chǎn)科學(xué)》［1］中有關(guān)子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床診斷，同時排除除子癇前期外其他產(chǎn)科合并癥與內(nèi)外科合并癥。選擇標(biāo)準(zhǔn)：所有產(chǎn)婦均無其他產(chǎn)科合并癥且為單胎妊娠，研究組產(chǎn)婦須符合子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有產(chǎn)婦均對研究干預(yù)知情同意并簽署知情同意書。排除存在其他妊娠合并癥、可影響胎盤淋巴細(xì)胞凋亡及CD44表達(dá)水平合并癥產(chǎn)婦。所納入的產(chǎn)婦中，研究組年齡范圍（23～34）歲，平均年齡（28.76±3.59）歲，孕周數(shù)（37～40）歲，平均孕周數(shù)（37.97±0.93）周，對照組年齡范圍（23～33）歲，平均年齡（28.31±3.62）歲，孕周數(shù)（37～40）歲，平均孕周數(shù)（37.84±0.73）周。兩組一般資料無明顯差異，P＞0.05，具有對比價值。本研究內(nèi)容經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 方法

1.2.1 實驗器材：淋巴細(xì)胞分離液（級別：BR，密度：1.077±0.002 g/ml，PH（25℃）：6.5～7.5）；一步法RNA抽提試劑盒（規(guī)格：500 ml/100 ml）；RT-PCR試劑盒（規(guī)格：P4251-100G）；全蛋白提取試劑盒（型號：BC3640-50T）。

1.2.2 操作方法：于產(chǎn)婦入院完成各項檢查確定符合研究標(biāo)準(zhǔn)后進(jìn)行外周EDTA抗凝血及胎盤母體面中央絨毛組織樣本采集，采集完成后使用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞備用。

CD44 mRNA表達(dá)水平檢測方法：以RNA抽提試劑盒抽提總RNA并在Gene bank中查得CD44的基因系列，借助Primer 3.0軟件進(jìn)行引物與探針設(shè)計，采用RT-PCR通用試劑盒檢測CD44的mRNA水平。

CD44蛋白水平檢測方法：使用蛋白提取試劑盒提取淋巴細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行電泳凝膠的制備。電泳完成后切割膠條，轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡5 min，共3次。提前剪裁膠條同面積的濾紙與NC膜，放入轉(zhuǎn)膜液中持續(xù)10 min。按照順序安裝轉(zhuǎn)膜裝置，量NC膜、凝膠與濾紙精準(zhǔn)對齊，清除旗袍并加壓500 g物品，碳板中多余液體予以吸干。接通電源后以1 mA/cm2的橫流轉(zhuǎn)移1.5 h，完成后取模取待測膜條進(jìn)行免疫印跡法。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶進(jìn)行染色，50 s后在進(jìn)行脫色，雙蒸水清晰，風(fēng)干并在兩層濾紙間保存。免疫反應(yīng)：洗膜（0.01M PBS，5 min/次，共3次），加包被液于室溫環(huán)境下平穩(wěn)搖晃2 h。扔去包被液再洗洗膜，5 min/次，共3次。加入CD44單抗，使用0.01M PBS稀釋至合適比例并覆蓋膜，4℃溫度條件下放置＞12 g。陰性對照將一抗替換為1%BSA，余下步驟同實驗組。0.01M PBS分別洗膜，5 min/次，共4次。加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（同上稀釋法），室溫下平穩(wěn)搖動2 h。棄二抗，用0.01M PBS洗膜，5 min/次，共4次。加入顯色液，避光狀態(tài)下顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng)。

淋巴細(xì)胞凋亡檢測方法：染色：取約2.0×106淋巴細(xì)胞，加入適量的Annexin V-FITC和PI試劑，室溫避光孵育30 min，加入預(yù)冷的PBS液離心洗滌2次，以除去未結(jié)合的多余抗體成分，采用1%的多聚甲醛溶液重懸細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)：將上述染色后的細(xì)胞標(biāo)本上流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞凋亡率（凋亡細(xì)胞：PI陰性Annexin V陽性的細(xì)胞）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS19.0處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（)表示，組間比較采用t檢驗；以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組產(chǎn)婦的胎盤淋巴細(xì)胞凋亡率與CD44表達(dá)水平對比

結(jié)果顯示，研究組產(chǎn)婦的CD44表達(dá)水平與淋巴細(xì)胞凋亡率均高于對照組，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.454，2.100）；P＜0.05，提示CD44表達(dá)水平與胎盤淋巴細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)正相關(guān)性，CD44水平與子癇前期的發(fā)生存在一定相關(guān)性，見表1。

表1 兩組產(chǎn)婦的胎盤淋巴細(xì)胞凋亡率與CD44表達(dá)水平對比（） %

表1 兩組產(chǎn)婦的胎盤淋巴細(xì)胞凋亡率與CD44表達(dá)水平對比（） %

組別研究組（n=30）對照組（n=30）t P胎盤淋巴細(xì)胞凋亡率15.72±2.24 13.24±2.07 4.454 0.000 CD44表達(dá)水平38.03±6.21 25.14±4.23 2.100 0.020

3 討論

現(xiàn)有研究認(rèn)為胎盤淺著床，血管重鑄障礙、免疫異常、凋亡過度、滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤能力異常等與子癇的發(fā)生具有較強(qiáng)關(guān)聯(lián)性［2］。正常妊娠的維持，有賴于胎兒母體間免疫平衡的建立與穩(wěn)定，而這種平衡一旦失調(diào)，即可導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生［3］。母胎界面的蛻膜內(nèi)有絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞、免疫細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞組成的相互影響、相互制約的網(wǎng)絡(luò)狀免疫微環(huán)境。其淋巴細(xì)胞中，大顆粒淋巴細(xì)胞（NK）的比例高達(dá)45%，且處于特定的功能狀態(tài)。CD44是最主要的淋巴細(xì)胞歸巢受體，參與淋巴細(xì)胞的再循環(huán)，淋巴細(xì)胞活化及炎癥反應(yīng)，并在母胎免疫耐受中起重要作用。目前普遍認(rèn)為，胎盤淺著床和血管重鑄障礙是子癇前期發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，而這兩者都與細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤能力降低有關(guān)［4］。淋巴細(xì)胞凋亡異?？蓪?dǎo)致母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡異常，致使細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞向子宮內(nèi)膜侵入不良—“淺著床”和血管重鑄障礙，繼而導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生。在張亞明［5］的研究中提出調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平較低，對Th1細(xì)胞增殖抑制力減小，從而促使Th1/Th2的平衡偏向Th1,使其不能對胚胎抗原產(chǎn)生免疫抑制保護(hù)作用，外周血中NK細(xì)胞升高影響滋養(yǎng)細(xì)胞的正常功能，產(chǎn)生血管重鑄障礙從而促發(fā)子癇前期。這與本研究中子癇前期產(chǎn)婦的胎盤淋巴細(xì)胞凋亡率高存在一致性，免疫反應(yīng)增強(qiáng)而淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，凋亡增多，研究組產(chǎn)婦的CD44表達(dá)水平與淋巴細(xì)胞凋亡率均高于對照組，提示CD44表達(dá)水平與胎盤淋巴細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)正相關(guān)性，CD44水平與子癇前期的發(fā)生存在一定相關(guān)性。

綜上所述，胎盤淋巴細(xì)胞凋亡率與CD44表達(dá)水平呈現(xiàn)正相關(guān)性，正常產(chǎn)婦的胎盤淋巴細(xì)胞凋亡率低且CD44表達(dá)水平低，CD44表達(dá)高水平在預(yù)測子癇前期中具有一定參考價值。