王澤鳳

新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院藥學(xué)部，河南 新鄉(xiāng) 453000

復(fù)脈口服液由黃芪、黨參、當(dāng)歸等藥材組成，具有益氣養(yǎng)血、化瘀復(fù)脈效果，可用于治療胸痹心悸，同時(shí)對(duì)心慌、氣短、乏力、頭暈、脈促結(jié)代等癥狀具有改善效果。本次研究通過正交試驗(yàn)確定該口服液制備工藝，并對(duì)其成分進(jìn)行薄層定性鑒別及定量分析研究，旨在為復(fù)脈口服液質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 制備

1.1 材料與儀器

1.1.1 處方：黃芪20 g、黨參15 g、當(dāng)歸12 g、白芍12 g、桃仁12 g、赤芍12 g、葛根20 g、杏仁9 g、石菖蒲15 g、炙甘草10 g。

1.1.2 試劑：濃硫酸（分析純）、6%苯酚、80%苯酚、5%三氯乙酸、15%三氯乙酸、6 mol/L鹽酸、6 mol/L氫氧化鈉、標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖、60%乙醇、乙酸乙酯、吡啶、醋酸、苯胺、臨苯二甲酸、黃芪甲苷對(duì)照品、阿魏酸對(duì)照品、芍藥苷對(duì)照品、苦杏仁苷對(duì)照品、葛根素對(duì)照品、β-細(xì)辛醚對(duì)照品、甘草酸對(duì)照品。

1.1.3 儀器：Sartorous十萬分之一電子分析天平（型號(hào)：CP225D）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（型號(hào)：RE-52A，上海亞榮生化儀器廠）、紫外可見分光光度計(jì)（型號(hào)：Evolution201，美國(guó)Thermo公司）、高速離心機(jī)（型號(hào)：JW-2018H，安徽嘉文儀器裝備有限公司）、電子恒溫水浴鍋（型號(hào)：HH-S4型）、薄層成像儀（型號(hào)：ViSuALiZER2，瑞士卡瑪公司）、薄層色譜自動(dòng)點(diǎn)樣儀（型號(hào)：AS30，德國(guó)Biostep公司）。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 測(cè)定藥材浸泡時(shí)間及吸水量：按處方比例稱取相應(yīng)藥材，以水浸泡，水量沒過所有藥材，分別浸泡0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h、5 h，測(cè)定各時(shí)點(diǎn)藥材吸水量，當(dāng)吸水量無明顯變化時(shí)認(rèn)為藥材浸泡完全。藥材吸水量=（藥材濕重-藥材干重）/藥材干重。當(dāng)藥材浸泡2 h后吸水量趨于穩(wěn)定，浸泡4 h后吸水量不再變化。

1.2.2 確定正交試驗(yàn)因素水平：按處方比例稱取相應(yīng)藥材，加水浸泡2 h，采用水煎煮法。以料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為試驗(yàn)因素，分別選擇3個(gè)水平，見表1。

表1 因素水平

1.2.3 濃縮提取液：應(yīng)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)濃縮提取液，加熱提取液至沸騰，使溶媒分子逸出，再將其冷凝后排出，將提取液濃縮至一定體積的樣品。

1.2.4 測(cè)定指標(biāo)性成分含量：采用苯酚—硫酸法測(cè)定樣品中總多糖含量（黃芪多糖、黨參多糖、當(dāng)歸多糖、白芍多糖、桃仁多糖、赤芍多糖、葛根多糖、杏仁多糖、石菖蒲多糖、甘草多糖）。稱取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖20 mg于容量瓶，加蒸餾水至 500 ml，分別吸取 0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1 ml、1.2 ml、1.4 ml、1.6 ml、1.8 ml后各自加蒸餾水補(bǔ)至 2 ml，加入6%苯酚1 ml，搖勻，加入濃硫酸5 ml，冷卻，沸水浴顯色，冷卻，于490 nm測(cè)光密度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣品1g加15%三氯乙酸1 ml研磨，再加少許5%三氯乙酸研磨，取上清液于離心管，再加少許5%三氯乙酸研磨，取上清液，重復(fù)3次，最后將所要樣液倒入離心管，離心后取上清液，水浴2 h，冷卻后定容取樣，于490 nm測(cè)光密度。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量，并記錄。

1.2.5 確定制備工藝：列出正交試驗(yàn)表，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析?？芍崛∫嚎偠嗵呛坑绊懽畲蟮氖荂（提取次數(shù)），其次是A（料液比），最后是B（提取時(shí)間）。結(jié)合正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析結(jié)果，確定最佳制備工藝為A3B2C3，即料液比為12,10,10提取3次，每次提取2 h，見表2、表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2 質(zhì)量控制分析

2.1 薄層色譜分析

根據(jù)上述最佳制備方案制取復(fù)脈口服液樣品，采用薄層色譜法測(cè)定樣液中黃芪甲苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、阿魏酸、芍藥苷、苦杏仁苷、葛根素、β-細(xì)辛醚、甘草酸含量。取樣品液10μl，應(yīng)用薄層點(diǎn)樣儀點(diǎn)樣，采用乙酸乙酯—吡啶—醋酸—水（7:3:0.2:1.4）展開劑展開，取出吹干，應(yīng)用苯胺—臨苯二甲酸顯色劑顯色，應(yīng)用薄層掃描儀于370 nm下掃描行定量分析。

2.2 線性關(guān)系

稱取黃芪甲苷對(duì)照品、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品、阿魏酸對(duì)照品、芍藥苷對(duì)照品、苦杏仁苷對(duì)照品、葛根素對(duì)照品、β-細(xì)辛醚對(duì)照品、甘草酸對(duì)照品各10 mg，加60%乙醇溶液10 ml定容，制作混合對(duì)照品液。分別吸取混合對(duì)照品液 0.5 ml、1 ml、1.5 ml、2 ml、2.5 ml、3 ml至容量瓶，加60%乙醇溶液至10 ml定容，點(diǎn)樣、展開、顯色、掃描。測(cè)得y（峰面積），與x（進(jìn)樣質(zhì)量，μg）行線性回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上訴8種化合物線性關(guān)系良好（r＞0.99）。同時(shí)逐級(jí)稀釋混合對(duì)照品液，測(cè)得各化合物檢測(cè)限為0.02 μg～0.12μg，定量限為0.06μg～0.38μg，見表4。

表4 幾種化合物線性回歸結(jié)果、檢測(cè)限、定量限

2.3 精密度試驗(yàn)

同一混合對(duì)照品液在同一張板點(diǎn)8個(gè)樣、展開、顯色、掃描得峰面積，測(cè)同板精密度；同一混合對(duì)照品液在8張板上點(diǎn)樣、展開、顯色、掃描得峰面積，測(cè)異板精密度。結(jié)果顯示同板精密度試驗(yàn)峰面積RSD為2.7%～6.2%，異板精密度試驗(yàn)峰面積RSD為5.9%～8.3%，精密度良好。見表5。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1份復(fù)脈口服液樣品，進(jìn)行薄層色譜分析，顯色后0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min應(yīng)用薄層色譜掃描儀測(cè)量峰面積，以各化合物峰面積RSD為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察穩(wěn)定性。結(jié)果顯示各化合物峰面積RSD為0.5%～2.4%，穩(wěn)定性良好。見表5。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取8份復(fù)脈口服液樣品，分別進(jìn)行8次薄層色譜分析，計(jì)算各化合物含量，以8次測(cè)量各化合物含量結(jié)果RSD為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察重復(fù)性。結(jié)果顯示各化合物含量RSD為2.1%～6.4%，重復(fù)性良好，見表5。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

取8份復(fù)脈口服液樣品，每份2 ml，分別加入黃芪甲苷對(duì)照品、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品、阿魏酸對(duì)照品、芍藥苷對(duì)照品、苦杏仁苷對(duì)照品、葛根素對(duì)照品、β-細(xì)辛醚對(duì)照品、甘草酸對(duì)照品2 mg，應(yīng)用薄層色譜分析，測(cè)得各化合物含量?；厥章?（測(cè)定含量-供試液理論含量）/加入對(duì)照品量×100%。進(jìn)行3次測(cè)驗(yàn)取平均值，結(jié)果顯示各化合物回收率為93.4%～99.7%，回收率良好，見表5。

3 討論

中藥材在煎煮前需先浸潤(rùn)藥材，以便有效成分滲透至水中［2］。本次研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)脈口服液處方藥材浸泡2 h后吸水量趨于穩(wěn)定，浸泡4 h后吸水量不再變化，綜合考慮工效等因素，建議煎煮前浸泡藥材2 h。中藥生產(chǎn)濃縮方式普遍采用蒸發(fā)濃縮，包括常壓蒸發(fā)濃縮及減壓蒸發(fā)濃縮［3］。本次研究提取液體積較大，常壓蒸發(fā)濃縮耗時(shí)長(zhǎng)且所需溫度高，因此采用減壓蒸發(fā)濃縮。經(jīng)過正交試驗(yàn)，比較不同制備工藝下提取液中總多糖含量，最終本次研究確定該口服液最佳制備工藝為在料液比12,10,10基礎(chǔ)上提取3次，每次提取2 h。

黃芪主要藥理有效成分有黃芪皂苷、黃芪多糖、黃酮類等，具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗病毒等作用，同時(shí)可通過調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞的功能狀態(tài)，從而影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，因其多重功效，在心腦血管疾病中多有應(yīng)用［4］。黨參主要藥理有效成分有黨參皂苷、黨參多糖等，對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、羥自由基、超氧陰離子具有清除能力，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、擴(kuò)張血管、增強(qiáng)造血功能等作用［5］。當(dāng)歸主要藥理有效成分有當(dāng)歸多糖、苯酞類二聚體、阿魏酸等，可顯著提高造血干細(xì)胞的增殖、分化，并延緩其衰老，具有免疫促進(jìn)、造血功能等作用［6］。白芍主要藥理有效成分有芍藥苷、白芍苷R1、白芍多糖等，可促進(jìn)NO合成釋放，舒張血管平滑肌，增加心肌營(yíng)養(yǎng)性血流量，且能促進(jìn)人骨髓成纖維樣基質(zhì)細(xì)胞系（human bone marrow fibroblastoid stromal cellline，HFCL）由G0/G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)HFCL的能量代謝，具有補(bǔ)血、抗炎、抗氧化、改善微循環(huán)等作用［7］。桃仁主要藥理有效成分有氰苷、苦杏仁苷、壬酸等，可調(diào)節(jié)脂類代謝，抑制血清中乳酸脫氫酶、肌酸磷酸激酶升高，改善心肌損傷，具有抗凝、抗血栓、改善血流動(dòng)力學(xué)等作用［8］。赤芍主要藥理有效成分有赤芍總苷、亞油酸乙酯、棕櫚酸乙酯等，可調(diào)節(jié)多種心肌酶、超氧化物歧化酶、脂質(zhì)氧化產(chǎn)物水平，維持細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境平衡，抑制凋亡基因、促凋亡基因表達(dá)，保護(hù)心肌功能，還可降低血液粘度、血小板聚集、纖維蛋白原量、紅細(xì)胞聚集指數(shù)等，延長(zhǎng)凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血酶原時(shí)間，具有保肝、擴(kuò)血管、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤、抗內(nèi)毒素、神經(jīng)保護(hù)、心臟保護(hù)等作用［9］。葛根主要藥理有效成分有葛根素、大豆苷、葛根多糖等，具有擴(kuò)血管、抗心律失常等作用［10］。杏仁主要藥理成分有苦杏仁苷、脂肪油、蛋白質(zhì)等，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用［11］。石菖蒲主要藥理成分有木脂素、細(xì)辛醚，可抑制心肌損傷標(biāo)記物如過氧化物酶、心肌肌鈣蛋白等的表達(dá)及活性，可增強(qiáng)心肌功能，具有降脂、抗炎、抗腫瘤、免疫增強(qiáng)、心臟保護(hù)等作用［12］。炙甘草主要藥理成分有甘草酸、甘草苷等，具有抗心律失常、抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用［13］。

綜合分析復(fù)脈口服液組方各中藥材的主要藥理成分后，將黃芪甲苷、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、阿魏酸、芍藥苷、苦杏仁苷、葛根素、β-細(xì)辛醚、甘草酸作為質(zhì)量控制分析指標(biāo)，本次研究亦證明水性藥液中含有上述有效成分。薄層色譜分析具有簡(jiǎn)單、低成本、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，且能同時(shí)進(jìn)行多樣本分析，不同化合物能以不同顏色顯示，且具有較高分離度，便于區(qū)分［14］。同時(shí)本次研究證明薄層色譜分析法，研究證明該方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均較好，可用于復(fù)脈口服液質(zhì)量控制。通過薄層色譜分析顯示最佳工藝制備的復(fù)脈口服液樣液有效成分穩(wěn)定且回收率高，質(zhì)量較好。后續(xù)可進(jìn)行相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以探究該藥物具體療效與作用機(jī)制。