薛曉萌, 劉 健

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

肥胖由于其發(fā)病率高成為了全世界范圍內(nèi)的流行性疾病[1-2],脂肪組織是一個與機體能量調(diào)控相關(guān)的內(nèi)分泌器官,脂肪組織與肥胖密切相關(guān),因此從脂肪組織的角度去考察肥胖發(fā)生的相關(guān)機制是充分合理的[3-4]。

甲羥戊酸途徑是一種重要的代謝途徑,它是以乙酰輔酶A為原料合成甲羥戊酸,之后甲羥戊酸可以轉(zhuǎn)變成甾醇(例如膽固醇)以及類異戊二烯基團(如焦磷酸法尼酯FPP和香葉基香葉酯GGPP)[5-6]。這些類異戊二烯基團可用于一些參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的蛋白(尤其是小GTP結(jié)合蛋白)的翻譯后修飾,并且對于體內(nèi)的細胞生長/分化、基因的表達、蛋白的糖基化以及細胞骨架的組裝十分重要[7-8]。香葉草基合成酶(Geranylgeranyl bisphosphate synthase，GGPPS)是參與甲羥戊酸途徑的酶,它是產(chǎn)生異戊二烯化基團的關(guān)鍵酶。GGPPS通過消耗FPP合成GGPP,精確調(diào)控細胞內(nèi)FPP和GGPP的含量,進而調(diào)控細胞內(nèi)各種小G蛋白的異戊二烯化修飾從而參與到細胞進程中[9-10]。

Loxp/Cre重組酶系統(tǒng)在新型基因打靶中獲得廣泛應(yīng)用[11-12]。該系統(tǒng)由2個部分組成:①Loxp位點是一段長34 bp的DNA序列,它是重組酶的識別位點;② Cre重組酶是一種由343個氨基酸組成的單體蛋白,可以引發(fā)Loxp位點的DNA重組。當靶基因序列位于2個Loxp位點之間時,在Cre重組酶的作用下該DNA序列就可以被敲除或發(fā)生序列倒置[13]。本文選擇Loxp/Cre重組酶系統(tǒng)構(gòu)建脂肪組織GGPPS特異性缺失的小鼠模型,為研究肥胖發(fā)生的機制提供了新的切入點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

本實驗所用鼠尾DNA提取試劑盒購于南京諾維贊生物科技有限公司；2×ES Taq master mix購于康為世紀公司;Trans 2K plus DNA marker購于北京全式金生物科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Invitrogen;Trizol RNA提取試劑盒、Oligo d(T)、 dNTP、定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)試劑SYBR Green Mixture均購于Takara公司。所用引物序列見表1所列，均購于生工生物工程有限公司。

表1 本文所用引物序列

1.1.2 實驗小鼠

本實驗所用到的SPF級Ggpps-floxed型和aP2-Cre小鼠,購自南京模式動物研究所。選擇Ggpps-floxed的小鼠與aP2-Cre的小鼠進行雜交,然后對小鼠子代進行基因鑒定。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的DNA提取

剪取1～2 mm的鼠尾置于1.5 mL的EP管內(nèi),加入50 μL的消化液(48 μL Lysis buffer+2 μL protease)后放入70 ℃烘箱消化3～4 h。消化完成后放入100 ℃水浴鍋中5 min使蛋白酶滅活,10 000g下4 ℃離心5 min,取上清即為小鼠的DNA,于-20 ℃保存。

1.2.2 小鼠的基因鑒定

以小鼠的DNA為模板,建立20 μL體系(2×ES Taq Master Mix 10 μL,GGPPS和Cre的上下游引物各0.8 μL,雙蒸水7.9 μL,模板0.5 μL)進行PCR,Loxp的PCR程序如下:① 94 ℃、2 min,1個循環(huán)；② 94 ℃、30 s，61 ℃、30 s，72 ℃、1 min，共30個循環(huán)；③ 72 ℃、7 min, 1個循環(huán)。Cre的PCR程序如下:① 94 ℃、2 min，1個循環(huán)；② 94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、50 s，共30個循環(huán)；③ 72 ℃、7 min, 1個循環(huán)。得到的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳110 V,30 min。Loxp、Cre的DNA條帶分別為650、480 bp。

1.2.3 組織RNA提取以及定量PCR

稱取100 mg小鼠的白色脂肪組織,20 mg棕色脂肪組織以及其他組織(如腦、肝臟、腎臟、肌肉等),按Trizol RNA提取試劑盒提供的方法提取總RNA。利用Invitrogen 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA并于-20 ℃保存。

1.2.4 組織蛋白提取以及Western blot

100 mg小鼠脂肪組織加入500 μL的RIPA裂解液于冰上研磨充分后于搖床上放置30～60 min, 1 000g下4 ℃離心30 min,取上清即為組織蛋白。利用BSA濃度測定的方法測定組織蛋白的濃度,之后進行Western blot。

1.2.5 統(tǒng)計學處理

實驗結(jié)果用SPSS統(tǒng)計學軟件進行方差分析,所有數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標準差)表示,雙側(cè)P<0.05為統(tǒng)計學意義上的顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 Loxp/Cre重組酶系統(tǒng)

Loxp/Cre重組酶系統(tǒng)是目前常用的條件性基因打靶技術(shù),當目的基因的DNA序列位于2個Loxp位點之間時,Cre重組酶就會識別該位點并將2個Loxp位點之間的DNA序列敲除。而脂肪組織中特異表達的啟動子為aP2,利用帶有aP2啟動子的Cre小鼠就可以獲得脂肪組織基因缺失的小鼠模型,如圖1所示,當目的基因位于2個Loxp位點之間時,Cre重組酶就可以識別這2個Loxp位點,從而將這2個位點間的靶基因敲除。

圖1 Loxp/Cre重組酶系統(tǒng)敲除靶基因GGPPS

2.2 GGPPS特異性缺失小鼠模型的構(gòu)建

本文利用鼠尾DNA提取試劑盒提取了小鼠的DNA,并利用PCR進行DNA片段的擴增,進行瓊脂糖凝膠電泳,如圖2a所示。

在650 bp處有Loxp單條帶,則代表小鼠的基因組中同時插入的2個Loxp位點基因,如圖2b所示。

圖2 脂肪組織GGPPS特異性缺失小鼠的基因鑒定

若在450 bp處有Cre基因的條帶,則代表小鼠的基因組中插入了Cre基因。若小鼠的基因組中同時具有2個Loxp位點基因以及Cre基因,則為脂肪組織GGPPS特異性缺失的小鼠Ad Ggpps KO,即GGPPS-/-型。

2.3 小鼠模型構(gòu)建的驗證

2.3.1 mRNA水平的驗證

為了初步探究所建小鼠模型是否建立成功,分別提取正常小鼠GGPPS+/+型和基因缺失的GGPPS-/-型小鼠的3種脂肪組織以及肝臟、肌肉、腎臟、大腦、肺等組織的RNA,之后利用定量PCR的技術(shù)對小鼠組織中GGPPS的mRNA水平進行檢測,結(jié)果如圖3所示。圖3中，SAT為皮下脂肪組織；EAT為附睪脂肪組織；BAT為棕色脂肪組織。從圖3可以看出,與GGPPS+/+型的小鼠相比,GGPPS-/-型小鼠的脂肪組織中,GGPPS的mRNA水平明顯降低,而其他組織(例如肝臟、肌肉、腎臟、大腦等)中GGPPS的mRNA表達量無變化。

圖3 脂肪組織和非脂肪組織中GGPPS的mRNA表達情況

2.3.2 蛋白水平的驗證

分別提取GGPPS+/+型和GGPPS-/-型小鼠的脂肪組織以及非脂肪組織的蛋白,利用Western blot去檢測小鼠組織中GGPPS的蛋白表達水平,如圖4、圖5所示。從圖4、圖5可以看出,與GGPPS+/+型小鼠相比,在GGPPS-/-型小鼠的非脂肪組織中,GGPPS的蛋白表達水平?jīng)]有變化,而脂肪組織中GGPPS的蛋白表達水平顯著降低。由此證明脂肪組織GGPPS特異性缺失的小鼠模型建立成功。

圖4非脂肪組織中GGPPS的蛋白表達水平以及定量的結(jié)果

圖5 脂肪組織中GGPPS的蛋白表達水平以及定量的結(jié)果

3 討 論

脂肪組織分泌的脂肪因子(例如脂聯(lián)素、瘦素、白介素16等)參與機體中許多重要的細胞代謝進程,與肥胖以及相關(guān)代謝疾病的發(fā)生密切相關(guān)。這些脂肪因子作為大分子物質(zhì),其在體內(nèi)的分泌和運輸需要借助于機體中的囊泡運輸體系。在大分子物質(zhì)的囊泡運輸過程中,小G蛋白的翻譯后異戊二烯化修飾與之密切相關(guān)。在甲羥戊酸途徑中,GGPPS作為調(diào)控活化的異戊二烯化基團產(chǎn)生的關(guān)鍵酶,與異戊二烯化基團的產(chǎn)生密切相關(guān),并由此影響到參與囊泡運輸?shù)男蛋白的翻譯后修飾。因此在脂肪組織中,GGPPS與脂肪因子的分泌可能存在一定的聯(lián)系,從而影響到與脂肪因子相關(guān)的代謝進程。

Cre重組酶穩(wěn)定的性質(zhì)使Loxp/Cre重組酶系統(tǒng)具有快速高效的特點。利用Loxp/Cre重組酶系統(tǒng)構(gòu)建脂肪組織GGPPS特異性缺失的小鼠模型,為之后研究GGPPS與脂肪因子囊泡運輸以及與脂肪因子相關(guān)的代謝疾病的發(fā)生機制奠定了基礎(chǔ)。