劉愛(ài)東，馬 征，龐久玲，劉時(shí)飛，閆 豐

(1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科，河北 唐山 063000；2. 唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)校區(qū)，河北 唐山 063000；3.唐山市工人醫(yī)院 病理科，河北 唐山 063000)

結(jié)腸腺癌的前期病變是腸黏膜的上皮內(nèi)瘤變，尤其是高級(jí)別病變，可以發(fā)展為浸潤(rùn)性的腺癌。腫瘤進(jìn)展過(guò)程中常伴有間質(zhì)的淋巴管生成[1]，D2-40被認(rèn)為是標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞最特異性的蛋白，淋巴管生成因子可以誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，進(jìn)而形成淋巴管[2]，形成管腔后為腫瘤播散提供直捷通路。近年學(xué)者關(guān)注淋巴管生成的影響因素?；|(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)不僅與轉(zhuǎn)移有關(guān)，還與淋巴管生成有關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶-11(MMP-11)是家族中的重要成員[3]。本研究關(guān)注MMP-11在結(jié)腸腺癌中的表達(dá)特征，分析其臨床意義及預(yù)后價(jià)值，探討其與MLVD的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1病例選擇 2014年1月至2014年10月在華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院確診為結(jié)腸腺癌的患者58例，患者均行根治術(shù)，年齡31～86歲，平均(59.2±15.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理醫(yī)師復(fù)核切片確診，符合WHO中病理診斷標(biāo)準(zhǔn)；②術(shù)前未行針對(duì)腫瘤的治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①多原發(fā)癌患者；②林奇綜合征；③家屬不同意觀察和隨訪者。選擇腫瘤組織作為觀察組，選擇距腫物邊緣>4 cm的正常結(jié)腸黏膜組織作為對(duì)照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合2013年修訂的《赫爾辛基宣言》的要求，患者或家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2MMP-11和D2-40檢測(cè) 應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)兩組中MMP-11和D2-40的表達(dá)，試劑均購(gòu)自蘇州睿贏生物技術(shù)公司。應(yīng)用DAB染色。操作嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，做好質(zhì)量控制。

1.3MMP-11和MLVD判定 MMP-11陽(yáng)性部位是細(xì)胞質(zhì)，選擇MMP-11染色較為集中且典型的3個(gè)區(qū)域(熱點(diǎn)區(qū)，400倍)進(jìn)行觀察，每個(gè)視野觀察陽(yáng)性細(xì)胞百分比和著色強(qiáng)度，取平均值。陽(yáng)性細(xì)胞百分比：0%、≤25%、>25%～50%、>50%～75%、>75%依次評(píng)為0、1、2、3、4 分。著色強(qiáng)度：無(wú)、淡黃、棕黃、棕褐依次評(píng)為 0、1、2、3 分。二者相加，分?jǐn)?shù)范圍為0～7分。以≤3分為陰性，>3分為陽(yáng)性。D2-40陽(yáng)性部位是淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性著色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇計(jì)為一個(gè)陽(yáng)性MLVD。選擇3個(gè)淋巴管分布較集中的區(qū)域(熱點(diǎn)區(qū)，400倍)進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。

1.4Western blot方法 對(duì)結(jié)腸腺癌新鮮組織中VEGF-C的表達(dá)應(yīng)用Western Blot進(jìn)行檢測(cè)。內(nèi)參應(yīng)用GAPDH。VEGF-C購(gòu)自武漢博士德生物工程技術(shù)公司。首先提取蛋白，測(cè)量蛋白濃度后嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟操作，并應(yīng)用化學(xué)發(fā)光劑顯影?；叶确治鰬?yīng)用Image J V1.47H軟件，以蛋白與GAPDH的比值作為半定量結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0分析，行卡方檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析及K-M生存分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MMP-11陽(yáng)性率、MVLD值 兩組中MMP-11表達(dá)的陽(yáng)性率、MVLD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1，圖1～2。

2.2MMP-11陽(yáng)性率和MLVD值在不同臨床病理特征分組中表達(dá) 結(jié)腸腺癌中MMP-11陽(yáng)性率、MLVD值與脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)深度相關(guān)。而與性別和年齡無(wú)明顯相關(guān)性。見(jiàn)表2，圖3。

2.3MMP-11和MLVD相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示MMP-11和MLVD具有正相關(guān)性(r=0.49,P=0.028)。見(jiàn)圖4。

表1 兩組MMP-11陽(yáng)性率、MVLD值的比較

表2 結(jié)腸腺癌MMP-11陽(yáng)性率和MLVD值在不同臨床特征分組中表達(dá)的比較

圖1 MMP-11的表達(dá)(IHC SP，×200)a.MMP-11在結(jié)腸腺癌中陽(yáng)性表達(dá)；b.MMP-11在正常結(jié)腸黏膜組織中陰性表達(dá)圖2 腫瘤間質(zhì)的微淋巴管(箭頭為D2-40陽(yáng)性的淋巴管，IHC SP，×200倍) 圖3 腫瘤脈管浸潤(rùn)(HE，×200)

圖4 MMP-11和MLVD的相關(guān)性分析

2.4MMP-11與生存時(shí)間的關(guān)系 本組患者均進(jìn)行術(shù)后5年(60個(gè)月)生存時(shí)間的隨訪。截止時(shí)間為2019年10月31日。其中術(shù)后5年時(shí)點(diǎn)死亡30例，生存25例，失訪3例(失訪患者計(jì)為刪失值)。其中死亡患者術(shù)后生存時(shí)間為4～60個(gè)月。以MMP-11評(píng)分為3分為臨界值，并應(yīng)用K-M生存分析顯示MMP-11的表達(dá)與生存時(shí)間有關(guān)，即MMP-11陽(yáng)性患者的預(yù)后差(χ2=3.80，P=0.038)。見(jiàn)圖5。

圖5 MMP-11的表達(dá)與生存時(shí)間的關(guān)系

2.5觀察組中MMP-11與VEGF-C的相關(guān)性分析 應(yīng)用Western blot檢測(cè)觀察組中VEGF-C的表達(dá)，表達(dá)范圍是0.7～3.6，平均2.3。Pearson相關(guān)分析顯示MMP-11與VEGF-C具有正相關(guān)性(r=0.54,P=0.011)。見(jiàn)圖6、7。

圖6 MMP-11與VEGF-C的相關(guān)性分析

圖7 Western blot檢測(cè)腫瘤組織中VEGF-C的表達(dá)

3 討 論

MMP-11發(fā)現(xiàn)較早，但是應(yīng)用和研究的相對(duì)較少，主要是MMP-11和經(jīng)典的MMPs的功能不同有關(guān)。MMP-11不直接對(duì)膠原和基底膜進(jìn)行降解，而是通過(guò)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的水解后形成活性酶發(fā)揮作用[4]。MMP-11在上皮源性惡性腫瘤表達(dá)升高。MMP-11是一種可分泌的蛋白，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MMP-11后可以釋放到周?chē)M織及血清中，血清中能檢測(cè)到MMP-11的表達(dá)，其與組織中的表達(dá)具有相似性[5]。Hsin等[6]在口腔鱗癌中觀察MMP-11的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MMP-11與不同臨床病理特征存在相關(guān)性，認(rèn)為MMP-11是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的重要因子，其可能對(duì)預(yù)測(cè)腫瘤的生物學(xué)行為和預(yù)后有重要價(jià)值。MMP-11的表達(dá)與乳腺癌的預(yù)后有關(guān)，其高表達(dá)預(yù)示著腫瘤呈現(xiàn)高轉(zhuǎn)移的狀態(tài)[7]。MMP-11與MMP-14的作用具有相似性，MMP-14可能是MMP-11的下游因子，MMP-11的部分功能是通過(guò)誘導(dǎo)MMP-14分泌實(shí)現(xiàn)的，其中包括促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、脈管生成及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。研究顯示高遷移性腫瘤間質(zhì)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖較為活躍，間質(zhì)中觀察到較豐富的淋巴管生成，結(jié)腸腺癌屬于此類(lèi)腫瘤。這種新生的淋巴管可以與腫瘤細(xì)胞相鄰，對(duì)腫瘤細(xì)胞淋巴道播散更直接。VEGF-C是重要的淋巴管生成因子，其與VEGF-D有共同作用，能促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[8-9]。D2-40是目前標(biāo)記淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞最特異性的抗體，新增殖淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞呈單細(xì)胞性、扁平狀和簇狀，在淋巴液的物理性沖擊作用下，形成管腔，逐漸具有淋巴循環(huán)的功能[10]。

本研究基于結(jié)腸腺癌術(shù)后組織進(jìn)行MMP-11的檢測(cè)，結(jié)果客觀，實(shí)用性強(qiáng)。結(jié)果顯示MMP-11在腫瘤中高表達(dá)，與脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)深度相關(guān)，提示MMP-11異常表達(dá)參與腫瘤的形成和進(jìn)展。在此過(guò)程中伴隨著MLVD的協(xié)同變化。MMP-11具有癌基因樣的作用，MMP-11在上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變過(guò)程中的意義不明顯，而在腫瘤形成的后期作用較為顯著，即MMP-11高表達(dá)是腫瘤形成后的中、晚期事件。Hsin等[11]在腫瘤轉(zhuǎn)移的研究中發(fā)現(xiàn)MMP-11高表達(dá)，認(rèn)為MMP-11的功能與Fak/Src通路的活化有關(guān)，MMP-11是腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的重要促進(jìn)因子。結(jié)果顯示MMP-11與MLVD、MMP-11與VEGF-C間均具有正相關(guān)性，由于VEGF-C具有較強(qiáng)的促進(jìn)淋巴管生成的作用[12]，因此MMP-11可能是通過(guò)VEGF-C介導(dǎo)腫瘤間質(zhì)淋巴管生成的，這種作用明確出MMP-11對(duì)間質(zhì)微淋巴管形成的調(diào)節(jié)具有間接性，也有研究認(rèn)為這種作用與MMP-11對(duì)絲氨酸蛋白酶聚集后的集中分解有關(guān)[6]。MMP-11對(duì)淋巴管生成的調(diào)控作用與家族中MMP-2、MMP-14的作用相似。MMP-11可以通過(guò)直接磷酸化而使下游的因子活化，如AKT和VEGF，使脈管內(nèi)皮細(xì)胞的增生能力提高，也使腫瘤的侵襲能力更強(qiáng)[13]。MMP-11在作用過(guò)程中能調(diào)節(jié)幾種不同的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，如病灶黏附性的改變、鳥(niǎo)苷三磷酸酶的活化、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子通路激活等[14]。本研究結(jié)果顯示MMP-11與腫瘤的生存時(shí)間有關(guān)，提示MMP-11高表達(dá)可能提示結(jié)腸腺癌預(yù)后差。Nonsrijun等[13]在前列腺腺癌中發(fā)現(xiàn)MMP-11過(guò)表達(dá)患者的預(yù)后不良，這與本研究結(jié)論一致。但是MMP-11對(duì)預(yù)后判斷的價(jià)值及臨界值的選定尚需要后續(xù)研究進(jìn)行多中心、大樣本及多因素的分析后證實(shí)。

總之，結(jié)腸腺癌中MMP-11的表達(dá)升高，間質(zhì)中MLVD增高，對(duì)病變的發(fā)生和進(jìn)展有重要作用。MMP-11和VEGF-C、MLVD有明顯的正向協(xié)同作用。MMP-11可能對(duì)判斷腫瘤的預(yù)后有一定價(jià)值。