盧 麗，劉 青，丁 博，李志勇*，李波平，關(guān)麗軍，謝湘娜

(1.廣州海關(guān) 廣東省動植物與食品進出口技術(shù)措施研究重點實驗室,廣東 廣州 510623;2.廣州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 511436)

櫻桃酸甜可口、營養(yǎng)豐富，備受國人青睞。它們在廣東及香港地區(qū)被直譯為“車?yán)遄印?，即英語單詞“Cherry”(櫻桃)的音譯，但并非指中國櫻桃，而指產(chǎn)于美國、加拿大、智利等美洲國家的個大、皮厚的進口櫻桃。櫻桃色澤鮮艷、晶瑩美麗，加之果實富含糖、蛋白質(zhì)、維生素及鈣、鐵、磷、鉀等多種元素，使其成為一種價值較高的特色進口水果之一。2014年中國已成為櫻桃進口量第三大國，櫻桃進口額世界第一[1]。

中國目前也有車?yán)遄庸麡涞囊N，山東、大連的部分品種櫻桃在外觀上與進口車?yán)遄踊疽粯樱y以肉眼區(qū)分。不法商家為獲得更大的市場利益，以次充好以及假冒產(chǎn)地的情況時有發(fā)生，嚴(yán)重影響了行業(yè)的健康發(fā)展及消費者利益。因此，高價值特色農(nóng)產(chǎn)品原產(chǎn)地鑒別技術(shù)的研究越來越多引起研究者的關(guān)注。

近年來，利用現(xiàn)代分析技術(shù)對農(nóng)產(chǎn)品進行產(chǎn)地鑒別有較多報道[2-4]。礦物元素指紋圖譜技術(shù)可通過分析不同來源生物體中礦物元素的組成和含量，再利用方差分析、聚類分析和判別分析等數(shù)理統(tǒng)計方法篩選出有效指標(biāo)，進而建立判別模型和數(shù)據(jù)庫，實現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品的溯源和確證[3]。目前，用于產(chǎn)地溯源的礦物元素分析方法有電感耦合等離子體質(zhì)譜法(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)和電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(Inductively coupled plasma-optical emission spectroscopy,ICP-OES)[5-21]。本文利用ICP-MS和ICP-OES測定櫻桃中51種元素含量，并基于化學(xué)計量學(xué)中主成分分析(Principal component analysis,PCA)和偏最小二乘法-判別分析(Partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)法建立了美國、加拿大、中國3個產(chǎn)地櫻桃的判別模型。該技術(shù)的建立可為規(guī)范中國櫻桃消費市場，提高相關(guān)部門的反欺詐監(jiān)管水平，維護消費者權(quán)益，具有良好的社會和經(jīng)濟效益。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

92份櫻桃樣品分別來自美國(50個)、中國(31個)和加拿大(11個)。其中11個加拿大及20個美國樣品為廣州機場口岸進口，其余為廣州大型超市、百果園水果超市或淘寶原產(chǎn)地購買而得。

濃硝酸(UP級，質(zhì)量分?jǐn)?shù)68%，蘇州晶瑞公司)；實驗用水為超純水(電阻率>18.2 MΩ·cm,20 ℃)；43種ICP-MS多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液IV-ICP-MS-71A(10 μg/mL,iNORGANic Ventures)；多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液IV-CCS-5(100 mg/L,iNORGANic Ventures)；16種元素ICP-MS混標(biāo)(100 mg/L,O2si)；定制3種元素ICP-MS稀土內(nèi)標(biāo)混標(biāo)Re、Rh、In(100 μg/mL)均購自上海安譜實驗科技股份有限公司。鋰(100 μg/mL，中國計量科學(xué)研究院)；鈉、鎂、磷、鉀、鈣(1 000 μg/mL，中國計量科學(xué)研究院)；生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10021(GSB-12豆角)和GBW10020(GSB-11柑橘葉)均購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)。含有Ba、Be、Ce、Co、Li、Mg、Rh、U的調(diào)諧液(10 μg/mL)購于美國珀金埃爾默儀器公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pro Blends 5勻漿機(飛利浦)；MS 303TS/02型電子天平(美國梅特勒-托利多公司)；Milstone超級微波消解儀(意大利Milestone公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore公司)；Perkinelmer SPB·50-48石墨消解儀、PE ELAN-DRC-e電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、PE 5300電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(美國PE公司)。實驗所用消化管為石英材質(zhì)，盡量不使用玻璃材質(zhì)器具。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集2018年5月～8月，收集廣州機場口岸進口的美國和加拿大產(chǎn)區(qū)櫻桃樣品，同時在廣州永旺、百佳、CASMIA TASTE等大型超市或淘寶原產(chǎn)地，以約每周一次的頻率購買美國或國產(chǎn)櫻桃樣品。

將收集到的櫻桃樣品先用去離子水洗凈，瀝干水分，去核，將果肉放入勻漿機攪拌成勻漿，待測。

1.3.2 樣本消解及元素含量測定參考GB 5009.268-2016食品中多元素檢測方法[22]，準(zhǔn)確稱取1.0 g櫻桃勻漿樣品于石英消化管中，加入3 mL濃硝酸，放入超級微波消解儀中，采用程序升溫法進行超級微波消解，待消解完成后，再放入石墨消解儀以130 ℃加熱趕酸約2 h，最后用去離子水轉(zhuǎn)移樣品，定容至25 mL。采用同樣方法制備試劑空白和質(zhì)控樣品。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理用SIMCA軟件對數(shù)據(jù)進行主成分分析(PCA)和線性判別分析(PLS-DA)，比較不同產(chǎn)地櫻桃中礦物元素的差異顯著性，建立櫻桃產(chǎn)地判別模型，鑒別櫻桃產(chǎn)地來源并驗證產(chǎn)地判別效果。

2 結(jié)果與討論

采用ICP-MS和ICP-OES測定櫻桃樣品中Be、B、Na、Mg、Al、Si、P、K、Ca、Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、Ga、Ge、As、Se、Sr、Y、Zr、Nb、Mo、Ag、Cd、Sn、Sb、Cs、Ba、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Pb、Th、U、Tl共51種礦物元素的含量。其中，Na、Mg、P、K、Ca用ICP-OES檢測，其它元素用ICP-MS檢測，均采用外標(biāo)法定量。ICP-MS用內(nèi)標(biāo)元素Rh和In保證儀器的穩(wěn)定性，每個樣品重復(fù)測定3次。用生物成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10021(GSB-12豆角)和GBW10020(GSB-11柑橘葉)作為質(zhì)控樣，對質(zhì)控樣中沒有參考值的元素Ga、Zr和Nb以及特殊元素Al和Si進行6次平行測定的加標(biāo)回收試驗，作為測試方法準(zhǔn)確性的判定依據(jù)。

2.1 方法準(zhǔn)確度及精密度

GBW10021(GSB-12豆角)和 GBW10020(GSB-11柑橘葉)測試結(jié)果見表1。由表1可見，除了鋁和硅2種元素檢測值低于證書給定值外，其他各待測元素的測定值與標(biāo)準(zhǔn)證書值相吻合，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不大于10.33%。硅和鋁因其存在形式和元素本身的性質(zhì)，在只用硝酸不加氫氟酸的微波消解條件下難以全部以游離態(tài)離子溶出，故只檢出酸可溶性硅和鋁的含量。采用加標(biāo)回收的方法驗證Al和Si以及生物成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺少的Ga、Zr、Nb。這5種元素6次平行測試的加標(biāo)回收率為90.6%～99.4%，RSD為2.5%～9.0%。從質(zhì)控樣及加標(biāo)回收檢測結(jié)果可知，該方法測定櫻桃樣品中51種元素具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。

表1 生物成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書值及檢測結(jié)果(n=3)

(續(xù)表1)

Elements(10-6)GBW10021(GSB-12 beans)certificate valueMeasured valueRSD/%GBW10020(GSB-11 citrus leaves)certificate valueMeasured valueRSD/%Si?(0.27)0.049 59.470.41±0.080.045 013.8Sm??29±428.96.4380±7752.18Sn(0.2)0.1879.083.8±0.53.821.08Sr55±352.42.50170±101750.76Tb??4.1±0.53.641.9411±19.610.75Th0.055±0.0100.059 47.230.14±0.020.1281.45Ti21±419.60.5138±1028.30.89Tl??4.2±0.83.481.1460±8560.26Tm??1.8±0.31.545.533.8±0.92.970.78U??90±585.52.1845±1038.71.02V0.51±0.060.5104.001.16±0.131.102.16Y0.155±0.0170.1493.420.42±0.040.4003.23Yb??11±29.165.3825±523.01.67Zn32±231.79.1118±216.10.11

*indicate the unit is 10-2，**indicate the unit is 10-9

2.2 不同產(chǎn)地櫻桃溯源模型的建立

2.2.1 不同國家櫻桃樣品的分布情況農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源鑒定研究中，樣品的來源真實性問題決定產(chǎn)地溯源鑒定模型的準(zhǔn)確性，其評估方法主要有地理標(biāo)簽標(biāo)記和樣品成分分析兩種方法，本文采用樣品成分分析法評估櫻桃樣品來源的真實性。研究選擇植物生長過程中必需的大量元素Mg和Ca以及微量元素Mn、Fe和Zn為代表元素，依據(jù)櫻桃樣品中此5種元素含量來評估美國、加拿大和中國產(chǎn)地來源的樣品代表性問題，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分布描述方法之一的QQ圖，判斷3個產(chǎn)地來源樣品是否符合正態(tài)分布，以評估櫻桃樣品的來源真實性問題?；?1個中國樣品、50個美國樣品和11個加拿大樣品中Mg、Ca、Mn、Fe和Zn元素含量，發(fā)現(xiàn)3個國家樣品中礦物質(zhì)含量數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，以植物大量必需元素Ca和微量必需元素Fe的QQ圖進行解釋(圖1)。由圖可知，中國、美國和加拿大三地區(qū)來源的櫻桃樣品中必需元素的含量數(shù)據(jù)呈線性關(guān)系，該規(guī)律表明3個國家來源的櫻桃樣品呈正態(tài)分布趨勢，由此推測從國內(nèi)海關(guān)口岸、市場及櫻桃生產(chǎn)基地購買的樣品具有一定代表性，樣品的來源真實性比較可靠，可用于產(chǎn)地溯源模型的鑒定研究。

圖1 不同國家櫻桃樣品中典型代表大量必需元素Ca與微量必需元素Fe含量的QQ圖分布

2.2.2 不同產(chǎn)區(qū)樣品礦物元素含量分析對中國、美國和加拿大來源的櫻桃樣品進行ICP-OES和ICP-MS分析，51種礦物質(zhì)元素含量見表3。櫻桃樣品中大量必需元素Mg、Si、P、K和Ca，以及微量必需元素B、Na、Fe、Mn、Cu、Zn的含量均在1 mg/kg以上，而Mo和Ni兩種微量必需元素含量比較低，尤其是Mo元素，除了加拿大櫻桃的Mo含量在22 μg/kg左右外，其余兩產(chǎn)地櫻桃中Mo含量均低于10 μg/kg。櫻桃樣品中非必需元素中除Al外，其余非必需元素含量均較低。進一步研究發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)櫻桃樣品中單一必需元素含量在相同的數(shù)量級范圍內(nèi)，因此單一元素含量信息無法判別樣品的產(chǎn)地來源，需開展多元素含量分析，構(gòu)建櫻桃樣品的產(chǎn)地溯源鑒定模型。

表3 不同地區(qū)櫻桃樣品中礦物元素含量

*indicate the unit is mg/kg;-:no detected

圖2 PCA 判別模型

2.2.3 PCA主成分分析由表3可見，同一元素在不同國家間以及同一地區(qū)不同批次間樣品標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，表明選擇此51種元素作為研究對象時，單一元素因素組內(nèi)和組間差異顯著，不能通過某1個或幾個元素進行產(chǎn)地來源的鑒定，需根據(jù)櫻桃中51種元素含量分布情況，進行多元統(tǒng)計分析來鑒別櫻桃產(chǎn)地。將不同產(chǎn)地櫻桃中51種元素含量數(shù)據(jù)進行主成分分析(PCA)，結(jié)果見圖2。由圖可見，除2個美國櫻桃和2個加拿大櫻桃樣品離群外，中國與美國、加拿大兩國產(chǎn)地來源的櫻桃具有不同的聚集效應(yīng)，因美國與加拿大地域相近，其櫻桃樣品分布區(qū)域相同，而中國與兩者的地理位置相距甚遠(yuǎn)，使得櫻桃樣品分布區(qū)域顯著不同。由此可通過櫻桃中金屬元素含量分布情況，進行櫻桃產(chǎn)地來源判別。另外，4個中國產(chǎn)地櫻桃樣品分布到美國加拿大區(qū)域，推測可能是產(chǎn)地信息標(biāo)記錯誤。

圖3 PLS-DA 判別模型

圖4 PLS-DA 模型的元素VIP值分布情況

圖5 優(yōu)化后PLS-DA產(chǎn)地溯源鑒定模型

2.2.4 PLS-DA判別分析為進一步優(yōu)化櫻桃產(chǎn)地溯源的判別模型，將93個櫻桃樣品的51種元素含量進行偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)，構(gòu)建不同產(chǎn)地櫻桃的PLS-DA鑒定模型(圖3)。由圖可知，與PCA鑒定模型相似，PLS-DA模型中不同國家產(chǎn)地來源櫻桃樣品也具有一定聚類效應(yīng)；其中美國和加拿大櫻桃樣品有一定區(qū)分，但無法顯著區(qū)分；而中國櫻桃可顯著區(qū)分美國、加拿大兩國。與PCA模型一樣，也有4個中國櫻桃樣品分布到美國加拿大區(qū)域之內(nèi)，推測可能是樣品來源信息標(biāo)記錯誤導(dǎo)致。

51種元素含量信息顯示PLS-DA模型變量參數(shù)比較多，需優(yōu)化減少模型的變量參數(shù)。本研究通過變量對模型的重要性指標(biāo)(VIP)來優(yōu)化模型的變量數(shù)目，以減少金屬元素變量(圖4)。由圖4可知，以VIP>1的元素為顯著變量，確定PLS-DA模型的顯著變量元素有Pr、Nd、Ce、Y、Co、Mo、Mn、Dy、Gd、Ni、Ho、Sm、Sr、Er、Ga、U、Na、Yb、Be和Zn。其中Mo、Mn、Zn是植物必需營養(yǎng)元素，Co和Na是植物可能必需營養(yǎng)元素,Pr、Nd、Ce、Y、Dy、Gd、Ho、Sm、Er、Yb為稀土元素,Be和Sr為堿金屬元素。由此可知，在16個植物必需元素中，櫻桃對其中的Mo、Mn、Zn 3個必需營養(yǎng)元素吸收差異顯著，對鈉和鈷2個可能必需營養(yǎng)元素吸收差異顯著；此外，櫻桃對10個稀土元素的吸收差異也比較顯著。以此20個顯著元素變量構(gòu)成的PLS-DA鑒定模型分析結(jié)果見圖5。

由圖3和圖5可知，PLS-DA產(chǎn)地溯源鑒定模型中元素變量參數(shù)優(yōu)化前后，產(chǎn)地溯源鑒定模型結(jié)果基本一致，由此推測此20種元素變量為主要貢獻率成分，在后續(xù)櫻桃樣品PLS-DA產(chǎn)地溯源模型構(gòu)建過程中，僅需檢測分析此20種元素的含量信息，即可構(gòu)建櫻桃樣品產(chǎn)地溯源鑒定模型。

2.2.5 不同產(chǎn)地櫻桃產(chǎn)地溯源模型中主成分貢獻率元素以PLS-DA模型分析所得20種顯著性的元素含量數(shù)據(jù)進行PCA分析(圖6)。研究表明，PCA產(chǎn)地溯源鑒定模型與PLS-DA結(jié)果一致，說明挑選出的20種顯著性元素含量信息均可應(yīng)用于兩種模型鑒定中國與美國、加拿大兩地的櫻桃樣品。由圖6B可見，美國和加拿大2個產(chǎn)地櫻桃樣品的溯源鑒定模型中主成分貢獻率元素為Mo、Ga、Sr和U；而中國產(chǎn)地櫻桃樣品的溯源鑒定模型中主成分貢獻元素為Pr、Nd、Ce、Y、Co、Mn、Dy、Gd、Ni、Ho、Sm、Er、Na、Yb、Be和Zn，其中又以稀土元素為主，這可能與櫻桃樣品來源有關(guān)，中國櫻桃樣品主要來源于稀土元素礦產(chǎn)資源主要分布地區(qū)之一的山東省，導(dǎo)致山東櫻桃樣品中稀土元素含量較高，與美國、加拿大兩國櫻桃樣品相比，中國櫻桃中稀土元素含量比較顯著。

圖6 優(yōu)化后櫻桃樣品的PCA產(chǎn)地溯源鑒定模型的分析結(jié)果

優(yōu)化后櫻桃產(chǎn)地溯源鑒定PCA模型中20種元素的第一主成分和第二主成分的方差貢獻率如下：

t[1]=0.184Be+0.075Na+0.230Mn+0.256Co+0.234Ni+0.152Zn-0.126Ga-0.149Sr+0.284Y-0.112Mo+0.298Ce+0.298Pr+0.292Nd+0.248Sm+0.263Gd+0.279Dy+0.247Ho+0.241Er+0.183Yb-0.090U;

t[2]=-0.012Be+0.024Na-0.282Mn-0.173Co-0.240Ni-0.177Zn-0.552Ga-0.218Sr-0.112Y-0.040Mo-0.048Ce-0.095Pr-0.105Nd+0.107Sm+0.102Gd-0.018Dy+0.057Ho+0.188Er+0.360Yb+0.249U。

圖7 優(yōu)化后櫻桃樣品的PCA產(chǎn)地溯源鑒定模型的三維示意圖

采用優(yōu)化后PCA鑒定模型的第一主成分和第二主成分以及中國、美國和加拿大櫻桃構(gòu)成三維PCA模型(圖7)，結(jié)果顯示，3個產(chǎn)區(qū)三維圖與二維圖一樣，均可顯示出中國產(chǎn)地櫻桃顯著不同于美國和加拿大。

2.3 產(chǎn)地溯源PLS-DA模型對未知產(chǎn)地櫻桃樣品的識別率

選擇2018年和2019年收集的20個櫻桃樣品作為鑒別模型的盲樣驗證樣品，分別是6個加拿大樣品(1個2019年樣品)、8個美國樣品(3個2019年樣品)和6個中國樣品(2個2019年樣品)，利用構(gòu)建的2018年櫻桃樣品PLS-DA產(chǎn)地溯源鑒定模型預(yù)測判斷20個樣品的產(chǎn)地來源。結(jié)果顯示，該模型可正確鑒定5個加拿大產(chǎn)地樣品，4個美國樣品和5個中國樣品；對加拿大、美國、中國3個產(chǎn)地樣品識別率分別為83.3%、50%、83.3%。進一步分析發(fā)現(xiàn)，PLS-DA產(chǎn)地溯源鑒定模型對2019年收集來源的1個加拿大樣品、3個美國樣品和1個中國樣品，預(yù)測識別錯誤；由此可知，櫻桃的產(chǎn)地溯源模型識別率還與樣品的年份密切相關(guān)。

3 結(jié) 論

采用ICP-MS和ICP-OES多元素分析技術(shù)，對美國、加拿大、中國3個產(chǎn)地92個櫻桃中的51種元素進行了測定，根據(jù)試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分布描述方法之一的QQ圖，判斷三產(chǎn)地來源的樣品符合正態(tài)分布，確立櫻桃樣品的來源真實可靠，并進行PCA和PLS-DA分析，成功建立了判別模型，并通過PLS-DA模型的VIP值優(yōu)化櫻桃樣品中元素變量數(shù)目，將模型變量降至20種元素；發(fā)現(xiàn)中國產(chǎn)地來源的櫻桃樣品中稀土元素含量顯著高于美國、加拿大。該方法基本可滿足對美國、加拿大和中國產(chǎn)區(qū)櫻桃的產(chǎn)地溯源要求。