李 鳳，張含智，康經(jīng)武

(1.西安文理學(xué)院 化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710065；2.上海市食品藥品檢驗所,上海 201203；3.中國科學(xué)院上海有機化學(xué)研究所 生命有機化學(xué)國家重點實驗室，上海 200032)

蛋白質(zhì)糖基化是一類重要的翻譯后修飾過程，糖蛋白中的糖鏈結(jié)構(gòu)不僅影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)，如折疊、穩(wěn)定性和溶解性等，還在細胞識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞粘合以及免疫應(yīng)答等多種細胞過程中具有重要作用[1]。在這些糖蛋白中，N-糖鏈的還原端通過糖肽鍵連接到肽鏈的天冬酰胺(Asn)殘基上，而O-糖鏈連接到肽鏈的絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)殘基上。免疫球蛋白是血清中高豐度的糖蛋白，也是一類重要的免疫效應(yīng)分子。人體血清中抗體的主要成分——免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)由兩條重鏈和兩條輕鏈組成[2]。糖鏈對抗體的穩(wěn)定性至關(guān)重要，可調(diào)節(jié)或者協(xié)調(diào)抗體的功能以及生物活性[3]，通過優(yōu)化重組單克隆抗體(Monoclonal antibody，MAb)糖基化作用來改善藥效是一個重要的研究領(lǐng)域[4]。研究表明自身免疫性疾病以及癌癥中IgG糖基化發(fā)生改變的原因?qū)斫膺@類疾病的分子發(fā)生機制，以及尋找合適的藥物靶標(biāo)都非常有意義[5]。

血清作為人體最重要的體液，在臨床診斷和疾病的監(jiān)控中應(yīng)用廣泛，其中糖蛋白的糖基化與疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[6]。目前，基于抗體的免疫化學(xué)測試在癌癥的診斷和監(jiān)測中應(yīng)用較為廣泛，如卵巢癌的CA125，乳腺癌的CA19-9或者CA15-3等[7]。但這些測試在癌癥早期檢測中的特異性和靈敏度均較差，仍需尋找與疾病密切相關(guān)的糖鏈應(yīng)用于臨床[8]。因此，建立糖蛋白中糖鏈的分析方法對尋找與疾病相關(guān)的生物信息具有重要的現(xiàn)實意義。Callewaert教授利用DNA測序儀建立了糖蛋白中N-糖鏈的分析平臺，發(fā)展了GlycoirrhoTest方法應(yīng)用于慢性肝臟疾病的診斷，該方法的特異性為86%，敏感性為79%，與臨床Fibrotest診斷方法相結(jié)合則可將特異性提高到100%[9]。Rudd教授與Waters公司合作建立的高效、自動化糖分析平臺，也成功應(yīng)用于臨床人血清樣品生物標(biāo)志物的研究中。分析發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，乳腺癌患者血清樣本的N-糖鏈唾液酸化程度、分支結(jié)構(gòu)以及巖藻糖化程度明顯增加[10]。

糖蛋白N-糖鏈常用的分離鑒定方法包括液相色譜、毛細管電泳(CE)、質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)等[11-13]。其中CE具有分離效率高、樣品消耗少等優(yōu)點，在復(fù)雜糖鏈結(jié)構(gòu)表征中具有很大的應(yīng)用潛力。Guttman課題組長期致力于將CE應(yīng)用于糖鏈的結(jié)構(gòu)分析中，實現(xiàn)了糖蛋白類抗體藥物N-糖鏈的結(jié)構(gòu)鑒定[14]。王文波等利用毛細管電泳對原研抗CD20人鼠嵌合單抗和4個生物類似藥的N-糖鏈進行分析[15]。本課題組將激光誘導(dǎo)熒光毛細管電泳(CE-LIF)用于中藥多糖中單糖組成的定性定量分析，并建立了人血清N-糖鏈的指紋圖譜[16]。但對于復(fù)雜的生物樣本，蛋白種類繁多，動態(tài)范圍極廣，對低豐度的糖蛋白N-糖鏈進行結(jié)構(gòu)分析困難較大。本文采用離線二維色譜，將弱陰離子交換色譜與CE-LIF相結(jié)合，實現(xiàn)了不同唾液酸化程度的N-糖鏈的分離。并將糖苷外切酶測序分別應(yīng)用于中性N-糖鏈和不同唾液酸化程度N-糖鏈的結(jié)構(gòu)鑒定中，最終確定了IgG的18種糖型。將其應(yīng)用于人血清中N-糖鏈的指紋圖譜結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)人血清中的主要中性N-糖鏈與IgG中的中性N-糖鏈結(jié)構(gòu)非常類似，同時發(fā)現(xiàn)人血清中含量最豐富的是含有兩個唾液殘基的糖鏈，其中兩天線的N-糖型FA2G2S2含量最高。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

P/ACE MDQ CE系統(tǒng)配LIF檢測器(美國Beckman Coulter公司)，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長520 nm。Agilent 1260液相色譜系統(tǒng)配有紫外光度檢測器(VWD)和熒光檢測器(FLD)；Agilent 7820A氣相色譜儀。彈性石英毛細管柱50 μm i.d.，360 μm o.d.(Polymicro Technologies，USA)；聚乙烯醇(PVA)中性涂層毛細管柱(實驗室自制)。

肽N-糖苷酶F(PNGase F)試劑盒、唾液酸酶、β1-4 半乳糖苷酶購于美國紐英倫生物技術(shù)有限公司(New England Biolabs，USA)。α-L-巖藻糖苷酶(來源于牛腎)、免疫球蛋白G(IgG)、正常人血清、甲酸銨、乙酸銨、碳酸氫銨、二硫蘇糖醇(DTT)、二甲亞砜(DMSO)、三乙胺、甲酸、乙酸(HAc)、三氟乙酸(TFA)、聚乙二醇(Mw20000)、聚乙烯醇(PVA)、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、葡聚糖混合物(Dextran ladder)、1 mol/L 氰基硼氫化鈉溶液(溶劑為四氫呋喃)、氰基硼氫化鈉(Na2BH3CN)、聚酰胺固相萃取小柱(DPA-6S)、胎球蛋白(Fetuin)購自于Sigma-Aldrich。 Sep-Pak C18固相萃取小柱購自Waters。多孔石墨化碳柱(Graphitized carbon cartridge,PGC小柱)購自Grace 。8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三鈉鹽(APTS)購于美國Invitrogen。APTS標(biāo)記的葡聚糖混合物(Glyko?APTS-(Maltodextrin Ladder))購自Agilent。乙腈、甲醇、超濾管(0.5 mL，3 kDa MWCO)購自美國Merck。實驗用水為18 MΩ·cm超純水(Millipore超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司)。所有溶液使用前需用0.22 μm濾膜過濾。

1.2 樣品前處理

1.2.1 N-糖鏈的制備由于N-糖鏈與蛋白質(zhì)的天冬酰胺殘基連接，需將其從糖蛋白上酶解后再進行分析。IgG酶解方法如下：在100 μL 100 mmol/L碳酸氫銨溶液(含有5 mmol/L DTT)中配制IgG糖蛋白溶液(蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL)，于100 ℃和25 ℃交替加熱20 s，重復(fù)6次；冷卻至室溫，加入 2 μL(1 000 U)PNGase F酶，于37 ℃水浴酶解過夜，真空離心，濃縮至干備用。人血清樣品酶解方法如下：首先用3 kDa 超濾管處理去除血清樣品中的低分子量組分，然后將人血清樣品5 μL(蛋白質(zhì)量濃度 10 mg/mL)參考PNGase F試劑盒的操作流程進行如下處理，首先加入10 μL 2% 十二烷基苯磺酸鈉(SDS)于60 ℃下孵育10 min，依次加入5 μL 4% 乙基苯基聚乙二醇(NP-40)以及2 μL PNGase F，37 ℃水浴酶解過夜。加入一定體積的預(yù)冷乙醇，使乙醇最終含量為75%，混勻后于-20 ℃靜置0.5 h，13 400 r/min離心15 min。取上清液，真空離心，濃縮至干備用。

1.2.2 N-糖鏈的純化酶切后的樣品溶于0.5 mL 5%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙腈(含0.1% TFA)中，通過PGC小柱純化N-糖鏈：固相萃取柱先用 4 mL 80%乙腈(含0.1% TFA)活化，上樣后用2 mL 5%乙腈(含0.1% TFA)沖洗，最后用1.0 mL 40%乙腈(含0.1% TFA)洗脫樣品，回收洗脫液，真空離心，濃縮至干備用。

1.2.3 N-糖鏈的熒光衍生2-氨基苯甲酰胺(2-AB)熒光衍生：用DMSO-HAc(7∶3，體積比)配制50 g/L 2-AB和60 g/L NaBH3CN混合溶液，取5 μL該混合溶液加入樣品中，于37 ℃放置過夜后完成衍生反應(yīng)。

APTS熒光衍生：用15%(體積分?jǐn)?shù))乙酸配制20 mmol/L的 APTS溶液，在糖鏈樣品中加入2 μL該APTS溶液以及2 μL 1 mol/L NaBH3CN的四氫呋喃(THF)溶液，于37 ℃放置過夜后完成衍生反應(yīng)。

1.2.4 衍生后N-糖鏈純化2-AB和APTS衍生后的樣品均可通過固相萃取小柱DPA-6S純化。先用 4 mL 95%乙腈平衡小柱，上樣后用95%乙腈(含50 mmol/L三乙胺)沖洗，最后用1 mL 50 mmol/L三乙胺水溶液洗脫樣品，回收洗脫液，真空離心，濃縮至干備用。

1.2.5 熒光標(biāo)記N-糖鏈的酶切將從50 μg蛋白樣品(IgG或人血清)中制得的N-糖鏈以HPLC分離，得到不同唾液酸程度的組分。APTS熒光標(biāo)記并純化后，離心濃縮干燥，溶解在50 μL 50 mmol/L乙酸銨緩沖溶液(pH 5.5)中，依次加入2 μL唾液酸酶、2 μLα-L-巖藻糖苷酶、2 μLβ1-4 半乳糖苷酶進行單一或混合酶切，酶切后的樣品真空離心濃縮至干，加入50 μL超純水溶解后，進行CE-LIF分析。

1.3 PVA 涂層柱的制備

配制6% PVA溶液，超聲脫氣10 min。截取4 m，50 μm i.d.的毛細管柱，在氮氣作用下，向毛細管柱通入6% PVA溶液，持續(xù)2 h，然后去除未與毛細管表面結(jié)合的PVA，最后將其置于氣相色譜儀的恒溫箱中，以5 ℃/min的速率程序升溫至145 ℃，保持5 h。

1.4 CE條件

PVA涂覆毛細管柱50 cm(有效長度39.5 cm)；分離電壓：20 kV；壓力進樣：0.3 psi×5 s；柱溫為25 ℃；背景電解質(zhì)為25 mmol/L 乙酸銨(pH 4.75)和0.4% PEG 20000。

1.5 HPLC條件

色譜柱為Asahipak ES-502N(7.6 mm×100 mm，9 μm)；流動相：A為20% 乙腈水溶液，B為含250 mmol/L 甲酸銨(pH 4.5)的20%乙腈水溶液。梯度洗脫：0～10 min，2.5% B；10～36 min，2.5% ～67.5% B。流速：0.8 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；熒光檢測，激發(fā)波長為330 nm，發(fā)射波長為420 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 IgG中N-糖鏈的結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 離線二維色譜鑒定IgG的唾液酸化程度本文采用離線二維色譜的分離模式。第一維是弱陰離子交換色譜(Anion exchange chromatography，AEC)，選用Asahipak ES-502N色譜柱，以親水性聚乙烯醇為載體基質(zhì)，表面鍵合二乙胺乙基官能團，通過鹽的梯度洗脫將所有N-糖鏈按照所含唾液酸的個數(shù)(0～4)進行分離;對相同唾液酸個數(shù)的組分，分別制備后，進一步通過APTS熒光衍生進行第二維的CE-LIF分析。由于糖鏈進行CE-LIF分析前，需采用APTS進行熒光衍生，而衍生試劑含有4個磺酸根，與弱陰離子交換色譜分離模式不兼容，可通過以下操作解決：(1)先用中性衍生試劑2-AB熒光衍生，對色譜條件進行優(yōu)化，確定最優(yōu)條件下不同唾液酸糖鏈的保留時間；(2)未衍生的糖鏈以上述相同的色譜條件進行分離，按照已確定的保留時間窗口制備得到不同唾液酸程度的糖鏈產(chǎn)品；(3)制備的糖鏈經(jīng)過反相C18固相萃取小柱脫鹽后，以APTS熒光衍生，再進行CE-LIF分離。在色譜條件優(yōu)化時，以標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白胎球蛋白(Fetuin)N-糖鏈的唾液酸個數(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn)進行IgG中N-糖鏈的歸屬。

圖1 弱離子交換色譜分析IgG中N-糖鏈熒光衍生產(chǎn)物

圖2 CE-LIF分離不同唾液酸化程度的IgG的N-糖鏈

如圖1所示，以Fetuin中N-糖鏈的保留時間為參考標(biāo)準(zhǔn)歸屬IgG糖鏈的唾液酸化程度。實驗發(fā)現(xiàn)，IgG中含量最豐富的是中性糖鏈(占總量的90%)，同時也含有少量單唾液酸(Monosialylated，S1)以及二唾液酸(Disialylated，S2)的糖型。對不同唾液酸程度的N-糖鏈進行制備，熒光衍生后進行CE-LIF分析。如圖2所示，制備后各組分的熒光強度明顯上升，有利于后續(xù)采用糖苷外切酶酶切測序進行結(jié)構(gòu)鑒定。

2.1.2 CE-LIF結(jié)合糖苷外切酶酶解鑒定IgG的糖型糖蛋白N-糖鏈中的常見組成單糖類型包括甘露糖(Man)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖(Gla)、巖藻糖(Fuc)和唾液酸(Sia)。同時所有N-糖鏈都有一個由3個甘露糖和2個N-乙酰葡萄糖胺組成的核心五糖結(jié)構(gòu)，即GlcNAc2Man3。N-糖鏈的結(jié)構(gòu)解析選擇針對不同單糖、不同糖苷鍵特異性的糖苷外切酶酶切進行，通過建立酶陣列分析即利用CE-LIF測定依次特異性切除單糖后剩余的寡糖結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)自上而下的酶解消化(Top-down digestion)。具體而言，就是對去除端部單糖(如唾液酸、巖藻糖、半乳糖或N-乙酰氨基葡萄糖)后得到的糖鏈進行CE-LIF分析，重復(fù)上面的過程直至只剩下核心五糖結(jié)構(gòu)。通過比較分析酶切前后所有的CE譜圖，考察酶切引起的色譜峰遷移時間的改變，將整個糖鏈結(jié)構(gòu)進行重建實現(xiàn)自下而上的結(jié)構(gòu)歸屬(Bottom-up identification)。

如圖3所示，對IgG中的中性糖鏈進行結(jié)構(gòu)歸屬。采用上述分析策略，以β1-4半乳糖苷酶和α-L-巖藻糖苷酶進行單一或混合酶切。結(jié)果表明，兩種酶完全酶切后，分別得到含量稍高的兩天線型N-糖鏈以及平分型GlcNAc的N-糖鏈(圖3d)。實驗發(fā)現(xiàn)，從核心巖藻糖兩天線的糖型FA2G2中去除α1-6巖藻糖引起的葡萄糖單元數(shù)(即GUs值)變化為1.08，而從類似糖型FA2BG2中去除α1-6巖藻糖引起的GUs值變化為0.89。這是由于在CE分離中，酶切前后GUs的變化除與酶切去掉的單糖個數(shù)有關(guān)，還與糖鏈的主體結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因為寡糖的電泳淌度由待分析物的流體力學(xué)體積所決定[17]。

在鑒定中性N-糖鏈結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，進一步對單唾液酸組分進行分析，發(fā)現(xiàn)其最主要的組分是FA2G2S1和含有分叉型GlcNAc的類似物。其中FA2[3]G1異構(gòu)體的含量相對較高，而中性組分中這類糖型的含量相對較低(圖3A，a;圖4)。文獻發(fā)現(xiàn)，IgG中α1-6連接的甘露糖殘基與CH2結(jié)構(gòu)域的多肽存在較強的相互作用，而α1-3的甘露糖延伸至重鏈以外的空間[18]。所以α1-3天線的半乳糖發(fā)生唾液酸化更有利，蛋白更加穩(wěn)定。采用bottom-up策略對單唾液酸糖鏈組分和二唾液酸糖鏈組分進行歸屬(圖4)，結(jié)果顯示其主要含有的糖鏈類型是FA2G2S3以及FA2BG2S3。

圖3 糖苷外切酶測序分析IgG中性糖鏈的CE-LIF色譜圖(A)和結(jié)構(gòu)示意圖(B)

圖4 CE-LIF結(jié)合外切酶測序分析單唾液酸(A)和二唾液酸(B)IgG的N-糖鏈

圖5 IgG中18種糖型的CE-LIF色譜圖

圖6 弱陰離子交換色譜分析人血清中N-糖鏈

相比于親水相互作用色譜(HILIC)方法，CE-LIF可以較容易地實現(xiàn)異構(gòu)體FA2[6]G1與FA2[3]G1的分離。可能是因為，HILIC的主要分離原理是基于待分析物的親水性差別，而CE-LIF的分離效果與待分離組分的流體力學(xué)體積相關(guān)，可以更好地實現(xiàn)異構(gòu)體的分離[10]。通過將離線二維色譜與糖苷外切酶測序相結(jié)合，CE-LIF方法共分離鑒定了IgG中的18種糖型(圖5)，所鑒定的糖型包括Wuhrer課題組討論的IgG中常見的16種糖型，證明該方法與文獻報道的結(jié)果較一致[19]。與色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相比，部分含量較低的高甘露糖糖型未被鑒定，說明本方法的靈敏度還有待進一步提高[20]。但基于毛細管電泳的方法成本更低，容易實現(xiàn)高通量檢測，在生物制藥行業(yè)具有重要的應(yīng)用潛力。

2.2 離線二維色譜鑒定人血清中N-糖蛋白的唾液酸化程度

將離線二維色譜與糖苷外切酶分析相結(jié)合，對CE-LIF分離得到的人血清電泳圖中的N-糖鏈進行結(jié)構(gòu)歸屬。先通過弱陰離子交換對血清中的N-糖鏈進行制備，分別得到Neutral、S1、S2、S3以及S4 5個組分的糖鏈混合物，其組分內(nèi)具有相同的唾液酸化程度(圖6)。5個組分間唾液酸化程度糖鏈的相對量為S1∶S2∶S3∶S4=4.7∶20.9∶6∶1。對這5個組分唾液酸酶酶切前后的情況進行CE-LIF分析(圖7)，并以IgG中N-糖鏈作為標(biāo)準(zhǔn)，對CE-LIF中豐度較高的組分進行結(jié)構(gòu)歸屬，發(fā)現(xiàn)其中含量最高的是FA2G2S2。實驗發(fā)現(xiàn)人血清糖蛋白的中性N-糖鏈結(jié)構(gòu)與IgG非常類似，這與文獻報道的IgG是人血清中含量最高的免疫球蛋白一致[17]。

圖7 CE-LIF分析人血清中不同唾液酸化程度的N-糖鏈

3 結(jié) 論

本文將弱陰離子交換色譜以及毛細管電泳的二維分離平臺應(yīng)用于IgG以及人血清中N-糖鏈的結(jié)構(gòu)鑒定。采用“bottom-up”的策略對IgG中的糖鏈結(jié)構(gòu)進行鑒定，發(fā)現(xiàn)酶切前后GUs的變化即寡糖的電泳淌度，與糖鏈的流體力學(xué)體積密切相關(guān)。通過將離線二維色譜與糖苷外切酶測序結(jié)合，采用CE-LIF共分離鑒定了IgG中18種糖型。將上述策略進一步應(yīng)用于人血清中N-糖鏈的分析，發(fā)現(xiàn)不同唾液酸化程度糖鏈的相對量為S1∶S2∶S3∶S4=4.7∶20.9∶6∶1。同時，研究表明人血清中含量最豐富的是二唾液化的糖型，其中兩天線的FA2G2S2含量最高。本文實現(xiàn)了人血清中N-糖鏈指紋圖譜的初步結(jié)構(gòu)分析，在發(fā)現(xiàn)糖蛋白類生物標(biāo)志物中具有較大的應(yīng)用潛力。