丁 麗， 吳 旸， 李 培， 林東昉

腸球菌屬革蘭陽性菌，廣泛存在于環(huán)境以及人、動(dòng)物消化道內(nèi)，能夠在高鹽（6.5% NaCl）、堿性（pH 9.6）、40%膽汁培養(yǎng)基、10～45 ℃等環(huán)境下生長，對多種環(huán)境具有高度耐受性，有助于其在不同的宿主內(nèi)定植并在環(huán)境中持久存在。根據(jù)腸球菌利用糖類及其分子生物學(xué)特征可將腸球菌分為糞腸球菌、屎腸球菌、鳥腸球菌和堅(jiān)韌腸球菌等[1]。腸球菌是一種重要的條件致病菌，能夠造成嚴(yán)重的腹腔感染、尿路感染以及血流感染等。根據(jù)2018年中國CHINET 細(xì)菌耐藥監(jiān)測結(jié)果顯示，腸球菌在革蘭陽性菌引起的醫(yī)院感染中排第二位，僅次于金黃色葡萄球菌[2]。由于腸球菌對頭孢菌素類藥物天然耐藥，對氨基糖苷類藥物敏感性亦不高，治療腸球菌感染的藥物選擇空間小。腸球菌感染的致病機(jī)制復(fù)雜，其中毒力因子是主要的機(jī)制之一，相關(guān)的毒力因子主要包括腸球菌表面蛋白Esp、明膠酶GelE、絲氨酸激酶SprE、聚集性物質(zhì)asa1及細(xì)胞溶素（cytolysin）等[3-6]。另外生物膜作為細(xì)菌一種獨(dú)特的毒力因子，參與致病過程，在應(yīng)對外界環(huán)境壓力、持續(xù)性感染中都起重要的作用。近年來，在許多腸球菌感染中觀察到生物膜，包括泌尿道感染、傷口感染、胃腸道感染和感染性心瓣膜炎[7-8]。生物膜相關(guān)的腸球菌感染不僅難以根除，而且還作為細(xì)菌進(jìn)一步傳播的源頭和耐藥基因的儲庫。

雖然這些毒力因子在腸球菌致病過程中的重要性顯著，但目前國內(nèi)關(guān)于細(xì)菌生物膜形成和調(diào)控機(jī)制的研究仍然較少。本文報(bào)道了臨床無菌體液分離腸球菌生物膜形成能力及其毒力基因攜帶率，分析生物膜的形成能力與毒力基因間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院2015－2017年臨床分離腸球菌，標(biāo)本來源于血、膽汁和腹水等，已剔除同一患者相同來源重復(fù)標(biāo)本。OG1RF（生物膜陽性菌株）作為生物膜形成能力陽性對照。

1.2 主要試劑與儀器

腦心浸液瓊脂（BHIA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）購自英國OXOID公司，1%結(jié)晶紫染料購自北京索萊寶科技有限公司，Taq酶購自天根生化科技有限公司，瓊脂糖、電泳系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 結(jié)晶紫染色法 參照文獻(xiàn) [9]中的方法檢測腸球菌生物膜形成能力并稍作修改。將凍存菌株接種于哥倫比亞血瓊脂平皿，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取菌落于0.9% NaCl 3 mL，制備0.5麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，隨后用TSB將菌懸液1∶200稀釋，制備含菌TSB液體培養(yǎng)基1 mL，將制備好的含菌液體培養(yǎng)基接種至Costa3599 96孔板中，每孔200 μL，每株菌3個(gè)復(fù)孔，37℃靜置培養(yǎng)24 h。24 h后棄去菌液，用1×PBS輕輕洗去浮游菌，每孔加入PBS 200 μL，清洗3遍；晾干后每孔用200 μL甲醇，固定10 min；棄去甲醇后，每孔加入100 μL結(jié)晶紫染料，染色15 min；流水沖洗后晾干，加入200 μL 33%乙酸脫色10 min，隨后用酶標(biāo)儀測量光密度D570nm。OG1RF作為陽性對照菌株，不加菌液的肉湯作為陰性對照。

1.3.2 DNA模板制備 將凍存菌株轉(zhuǎn)種至哥倫比亞血瓊脂平皿， 37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取菌落至已注入500 μL TE （pH 8.0） 的1.5 mL Eppendorf離心管，調(diào)節(jié)菌液濁度至2麥?zhǔn)蠁挝唬?00 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心10 min后取上清液備用。

1.3.3 生物膜相關(guān)基因檢測 采用表1中引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[10-11]，檢測臨床分離株中的esp、gelE、sprE、asa1、cylA、cylB、cylM基因。PCR體系為25 μL，引物終濃度為1 μmol/L，DNA模板2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min ；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠，電壓6 V/cm電泳25 min后染色讀取結(jié)果。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primers used in PCR assay

1.3.4 明膠酶活性檢測 參照文獻(xiàn) [13]中的方法并稍作修改，將分離物接種到含有12%明膠營養(yǎng)肉湯的管中。37 ℃溫育24～72 h，4 ℃冷藏15 min后讀取結(jié)果。產(chǎn)生明膠酶的細(xì)菌即使在冷藏之后也會(huì)使培養(yǎng)基液化，陰性測試顯示冷藏后的完整明膠培養(yǎng)基。

1.3.5 結(jié)果分析 使用GraphPad Prism 6對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，糞腸球菌毒力基因攜帶率與生物膜陽性率之間的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用GraphPad Prism 6、Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪 圖。

2 結(jié)果

2.1 臨床分離腸球菌來源分布

共收集1 1 2 株腸球菌菌株，其中5 2 株（46.43%）為糞腸球菌， 60株（53.57%）為屎腸球菌，菌株來源及分布情況見表2。

表2 112 株腸球菌來源及分布情況Table 2 The source of 112 enterococcal strains[n（ %）]

2.2 細(xì)菌生物膜形成能力分析

參照文獻(xiàn)報(bào)道，利用D570nm值將生物膜劃分為：陰性 （D570nm＜0.5），弱陽性（0.5≤D570nm＜1）， 中等陽性（1≤D570nm＜2）以及強(qiáng)陽性（D570nm≥2）。 OG1RF作為陽性對照，文獻(xiàn)報(bào)道D570nm范圍為0.5～1。結(jié)果見表3、表4。研究結(jié)果顯示：糞腸球菌相比屎腸球菌更易形成生物膜，兩者陽性率分別為63.46%和13.33%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。其中，38.46%糞腸球菌可形成中等陽性至強(qiáng)陽性的生物膜。

表3 52 株糞腸球菌形成生物膜的能力Table 3 The capacity of biofilm formation in 52 strains of E. faecalis

表4 60 株屎腸球菌形成生物膜的能力Table 4 The capacity of biofilm formation in 60 strains of E. faecium

2.3 毒力基因篩查

通過PCR方法，在52株糞腸球菌分離株中分別檢測了esp、gelE、sprE、asa1、fsrA、fsrB、fsrC以及細(xì)胞溶素基因cylA、cylB、cylM的攜帶率，見圖 1。因本研究中屎腸球菌生物膜陽性菌株較少，故篩查最常見的兩種毒力基因?yàn)閑sp和gelE，基因攜帶率分別為65.00% 和10.00%。

2.4 毒力基因與生物膜相關(guān)性分析

在52株糞腸球菌分離株中，esp、asa1、cylA、cylB、cylM和fsrB的基因攜帶率在糞腸球菌生物膜陽性和陰性菌株之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），攜帶這些基因的菌株更易形成生物膜。而gelE、sprE、fsrA、fsrC基因攜帶率在糞腸球菌生物膜陽性和陰性菌株之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表 5。

圖1 2015－2017 年華山醫(yī)院糞腸球菌毒力基因攜帶率Figure 1 Frequency of virulence genes in E. faecalis isolates from 2015 to 2017 in Huashan Hospital

表5 糞腸球菌毒力基因與生物膜形成能力之間的相關(guān)性分析Table 5 Correlation between virulence genes and capacity of biofilm formation in E. faecalis

2.5 明膠酶活性分析

對臨床分離糞腸球菌進(jìn)行明膠酶活性測定，共有1 5 株能夠液化明膠，推測能夠產(chǎn)生明膠酶。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)明膠酶陽性率在腸球菌生物膜陽性和陰性菌株之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.054 1）。

3 討論

研究結(jié)果顯示，糞腸球菌形成生物膜的能力高于屎腸球菌，分別為63.46%與13.33%（P＜0.001），低于歐洲地區(qū)報(bào)道的腸球菌生物膜陽性率（60%～90%），高于我國Zheng等[12]報(bào)道的47.2%陽性率。腸球菌形成生物膜的能力可能具有地域差異。本研究中，血液分離出的糞腸球菌生物膜陽性率為25.00%，膽汁分離出的糞腸球菌陽性率為17.30%，腹水分離出的糞腸球菌生物膜陽性率為19.23%，不同標(biāo)本來源的糞腸球菌在生物膜形成能力方面的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

糞腸球菌被認(rèn)為是留置醫(yī)療器械感染最常見的腸球菌菌種。Esp是一種細(xì)胞壁相關(guān)蛋白，已被證實(shí)是導(dǎo)致泌尿道細(xì)菌定植、細(xì)菌持續(xù)存在和生物膜形成的重要因素。Duprè等[14]研究顯示屎腸球菌esp攜帶率較糞腸球菌更高（71.9%比60%）。本研究結(jié)果與之相符，屎腸球菌esp攜帶率為65.00%（39/60），糞腸球菌esp攜帶率為40.38%（21/52）。有研究顯示esp對生物膜形成具有影響，在糞腸球菌尿路感染（UTI）模型中，Esp缺陷菌株顯示初始附著減少[15]，膀胱定植減少，這是因?yàn)镋sp可結(jié)合纖維蛋白原和膠原等配體，并且這些配體存在于膀胱中[16]。本研究也證實(shí)esp基因的攜帶率在糞腸球菌生物膜陽性和陰性菌株之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），然而生物膜表型在糞腸球菌和屎腸球菌中的差異性，提示屎腸球菌中esp可能不是其生物膜形成的主要因素。

gelE在不同來源的分離株中廣泛存在，但各種研究顯示該基因通常沉默，并且歸因于體內(nèi)和體外條件之間的差異，或者不存在表達(dá)所需的其他基因。本研究中，糞腸球菌的gelE、sprE與生物膜表型之間不存在相關(guān)性，這與Saffari等[17]報(bào)道的結(jié)果相同，與Zheng等[12]報(bào)道的結(jié)果相反，這可能與標(biāo)本來源不同有關(guān)，本研究中標(biāo)本全部來自無菌體液，而Zheng等[12]研究中的菌株主要分離自尿液（203/240）。

細(xì)胞溶素在動(dòng)物感染腸球菌模型中被證實(shí)與心內(nèi)膜炎以及眼內(nèi)炎有關(guān)，由cylA、cylB、cylM等基因編碼。本研究檢測了糞腸球菌中cylA、cylB、cylM基因攜帶率，分別為46.15%、48.08%、50.00%，分析結(jié)果顯示，這3種基因攜帶率在糞腸球菌生物膜陽性和陰性菌株之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），攜帶cylA、cylB、cylM基因的菌株更易形成生物膜。另外，本研究顯示asa1和fsrB基因攜帶率在糞腸球菌生物膜陽性和陰性菌株之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

近年來，學(xué)者們一直在研究耐藥與毒力、生物膜之間的關(guān)系。有報(bào)道顯示紅霉素耐藥腸球菌相較敏感菌株更易形成生物膜[18]。本研究并未發(fā)現(xiàn)紅霉素耐藥與生物膜陽性率之間的相關(guān)性，但發(fā)現(xiàn)esp、cylA、cylB、cylM基因的攜帶率在高濃度慶大霉素、紅霉素耐藥和敏感菌株之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表），具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究探討。

總之，本研究顯示糞腸球菌較屎腸球菌更易形成生物膜；在糞腸球菌分離株中發(fā)現(xiàn)多種毒力基因與生物膜形成相關(guān)，這提示生物膜的形成并不是由單一基因調(diào)控，而是由多個(gè)基因多系統(tǒng)調(diào)控。本文報(bào)道的腸球菌臨床分離株生物膜和毒力基因的比較分析結(jié)果，可作為進(jìn)一步研究腸球菌感染發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)。