鄧維琴，李雄波，張其圣,2，陳功,2，范智義，胡廷，李恒,2,3*

1(四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，四川 成都， 611130)2(四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山， 620030)3(成都市丹丹川菜調(diào)味品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，四川 成都， 611730)4(成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都， 610106)

郫縣豆瓣是以紅辣椒、蠶豆為主要原料，食用鹽、小麥粉等為輔料釀制而成的傳統(tǒng)調(diào)味品。其生產(chǎn)工藝主要包括制曲、甜瓣子發(fā)酵、辣椒醅發(fā)酵及后發(fā)酵生香等階段[1]。原料中豐富的營養(yǎng)成分在甜瓣子發(fā)酵過程中形成各種風(fēng)味物質(zhì)，對成品品質(zhì)有突出貢獻，甜瓣子發(fā)酵是郫縣豆瓣風(fēng)味形成的關(guān)鍵階段。甜瓣子發(fā)酵過程中米曲霉、芽孢桿菌、乳酸菌以及酵母菌是主要發(fā)酵菌株，乳酸菌對豆瓣醬風(fēng)味的呈現(xiàn)有著重要作用[2-6]。

乳酸菌是發(fā)酵食品中常用的益生菌，其發(fā)酵過程中可產(chǎn)生有機酸[7]、芳香化合物[8]、酶[9]以及胞外多糖[10]等多種物質(zhì)，并為發(fā)酵體系提供有機酸、雙乙酰、過氧化氫及細菌素等多種活性物質(zhì)，有效增強感官品質(zhì)、抑制不良微生物、延長產(chǎn)品保質(zhì)期[11-13]。目前，傳統(tǒng)發(fā)酵醬中乳酸菌的篩選和應(yīng)用已成為領(lǐng)域的研究熱點。CUI等[14]從黃豆醬中篩選了28種嗜鹽乳酸菌，利用篩選的嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcushalophilus)結(jié)合酵母菌對黃豆醬進行強化發(fā)酵，可增加產(chǎn)品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量；陳伯林[15]研究發(fā)現(xiàn)在醬油發(fā)酵第6天添加0.25%的乳酸菌進行發(fā)酵，可顯著改善醬油的風(fēng)味，提高醬油中乳酸含量；WANG等[16]發(fā)現(xiàn)在醬醅發(fā)酵第15天接種乳酸菌，醬醅發(fā)酵第45天接種酵母菌，可提高醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量；IWASAKI等[17]研究了氧化鋁陶瓷固定化乳酸菌在醬油發(fā)酵中的應(yīng)用，固定化的嗜鹽片球菌(Pediococcushalophilus)可使醬醅壓榨液中的乳酸含量達到7～9 g/L。

乳酸菌在豆瓣醬-甜瓣子發(fā)酵中的應(yīng)用也逐漸受到學(xué)者的關(guān)注。VEMI等[18]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌添加到蠶豆醬中可提高肽酶、β-葡糖苷酶、胞外多糖、抑菌物質(zhì)等代謝產(chǎn)物的含量，明顯提高蠶豆醬品質(zhì)。李從虎等[19]在甜瓣子發(fā)酵階段接種耐鹽乳酸菌滬釀1.08和酵母菌，甜瓣子中主要呈香物質(zhì)及高級脂肪酸的含量得到顯著提升。乳酸菌強化可加快營養(yǎng)物質(zhì)代謝，促進發(fā)酵，改善甜瓣子風(fēng)味。然而，目前還沒有一種強化甜瓣子發(fā)酵的專用乳酸菌及菌劑。本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵甜瓣子中篩選優(yōu)勢耐鹽乳酸菌，研究其生長特性，并制備乳酸菌劑，研究乳酸菌劑強化發(fā)酵甜瓣子的效果，以期提供一種甜瓣子發(fā)酵專用的乳酸菌劑，為其在甜瓣子發(fā)酵體系的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株篩選原料

傳統(tǒng)發(fā)酵甜瓣子，四川省丹丹郫縣豆瓣公司。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)物

TIANamp Bacteria DNA Kit 試劑盒、無水乙醇、氫氧化鈉溶液、甲醛溶液、乳酸菌選擇性培養(yǎng)基(改良MRS培養(yǎng)基)，上海艾研生物科技有限公司；27F引物、1492R引物、MIX酶、超純水、250 bp Maker、瓊脂糖，上?；鄯f生物科技有限公司；0.05 mol/L HCL溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-500型冷凍干燥機，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；SWDB204SD-01型分離機，北京中船綠洲機器有限公司；752G紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器股份有限公司；DYY-6D電泳儀，北京六一生物科技有限公司；BCD-201MLT冰箱，合肥美菱股份有限公司；PV1189-型發(fā)酵罐，鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司；H2050R-1離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；PHSJ-4型pH計，上海儀電分析儀器股份有限公司；T960A智能梯度PCR儀，杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜儀，Agilent 1260；443D，氨基酸分析儀，德國Sykam。

1.3 試驗方法

1.3.1 產(chǎn)酸能力強的乳酸菌分離鑒定

1.3.1.1 菌株分離

稱取10 g甜瓣子至盛裝有90 mL無菌蒸餾水的錐形瓶中，混勻、逐次稀釋，采用MRS固體培養(yǎng)基(加入2% CaCO3)傾注，每個梯度3個平行，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取疑似乳酸菌形態(tài)的單菌落純化，逐步傳代劃線分離純化至菌株在MRS培養(yǎng)基上大小形態(tài)一致。根據(jù)MRS CaCO3平板中透明圈的大小初步篩選得到4株典型產(chǎn)酸能力強的乳酸菌，分別編號為ND1、ND2、ND3、ND5，于MRS培養(yǎng)基斜面劃線，37 ℃培育24 h，4 ℃保藏。

1.3.1.2 菌株生長曲線測定

分別挑取ND1、ND2、ND3、ND5單菌落接種于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h，得到種子液。分別吸取1 mL ND1、ND2、ND3、ND5的種子液至100 mL無菌MRS肉湯培養(yǎng)基中，菌株接種濃度為107CFU/mL，每組3個平行。定時取樣，測定發(fā)酵液在610 nm條件吸光值。

1.3.1.3 產(chǎn)酸能力測定

分別吸取1 mL ND1、ND2、ND3、ND5的種子液至100 mL無菌MRS肉湯培養(yǎng)基中，菌株接種濃度為107CFU/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h。參照GB/T 12456—2008方法，采用標(biāo)定后的NaOH 溶液(約0.049 mol/L)進行滴定，計算發(fā)酵液總酸含量，同時記錄發(fā)酵終點pH值，每組3個平行。

1.3.1.4 優(yōu)勢菌株形態(tài)及16S rRNA測序

采用MRS培養(yǎng)基平板劃線分離純化后，進行革蘭氏染色顯微鏡觀察形態(tài)，記錄菌落形態(tài)，結(jié)合《伯杰氏細菌鑒定手冊(第8版)》進行初步鑒定。

挑取優(yōu)勢菌株單菌落接入100 mL MRS肉湯培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，采用TIANGEN細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)提取細菌DNA。PCR擴增16S rRNA片段，PCR擴增反應(yīng)的體系為：1 μL 27 F引物，1 μL 1 492 R引物，3 μL DNA模板，MIX酶12.5 μL，超純水12.5 μL，共30 μL。擴增程序為：預(yù)變性94 ℃、4 min，變性94 ℃、1 min，退火60 ℃、45 s，延伸72 ℃、90 s，末端延伸72 ℃、10 min，變性、退火、延伸30次循環(huán)。將擴增物送北京擎科生物有限公司測序，得到的序列通過BLAST比對，采用Mega 5.0建立系統(tǒng)發(fā)育樹進行分子生物學(xué)鑒定。

1.3.2 菌株ND1的生長特性

1.3.2.1 不同鹽度條件生長情況

根據(jù)測定結(jié)果篩選出產(chǎn)酸能力和生長能力最強的菌株ND1進行深入研究。挑取菌株ND1的單菌落接入100 mL MRS培養(yǎng)液中，培養(yǎng)12 h后作為種子液。吸取1 mL種子液加入100 mL不同NaCl濃度的MRS培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中NaCl質(zhì)量分數(shù)分別為3%、5%、8%、10%。接種濃度約為107CFU/mL，37 ℃培養(yǎng)，每組3個平行，定時取樣測定OD610。

1.3.2.2 不同酸性條件生長情況

吸取1 mL菌株ND1種子液于100 mL不同pH值的MRS培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中接種濃度約為107CFU/mL，培養(yǎng)液初始pH值分別為3.5、4、4.5、5、6，每組3個平行，37 ℃培養(yǎng)，定時取樣測定OD610。

1.3.2.3 不同溫度條件生長情況

吸取1 mL ND1種子液于100 mL MRS培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中接種濃度約為107CFU/mL，分別在4、10、20、30、37、45、50 ℃ 條件培養(yǎng)，每組3個平行，定時取樣測定培養(yǎng)液OD610。

1.3.3 乳酸菌劑制備

挑取ND1單菌落接種至30 mL MRS液體培養(yǎng)基中活化，37 ℃培養(yǎng)18 h；將活化液轉(zhuǎn)移至3 L MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h得到種子液。采用500 L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)，調(diào)整MRS液體培養(yǎng)基pH至 6.0，接入3 L種子液，37 ℃培養(yǎng)18 h，發(fā)酵液稀釋10倍后OD610達到1.8左右。發(fā)酵原液低溫離心得到菌體，按1∶1(g∶mL)加入20%海藻糖保護劑后，采用冷凍干燥機干燥48 h得到菌劑。

1.3.4 產(chǎn)香乳酸菌劑中活菌計數(shù)

準(zhǔn)確稱取1.3.3制得的乳酸菌菌劑1 g，與99 mL無菌水(加入適量玻璃珠)充分混勻后，得到10-2g/mL稀釋液。逐次稀釋，選擇適宜濃度的稀釋液進行傾注，混勻，37 ℃培養(yǎng)24 h，計數(shù)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)，并由此計算菌粉中的活菌數(shù)。

1.3.5 乳酸菌劑強化發(fā)酵甜瓣子

將霉豆瓣與鹽水按1∶1比例混合，加入質(zhì)量分數(shù)15%的鹽和適量乳酸菌劑，乳酸菌接種量為107CFU/g，攪拌混勻，37 ℃發(fā)酵60 d。以不添加乳酸菌劑的甜瓣子發(fā)酵組為空白組，試驗組和空白組分別設(shè)置3個平行。

1.3.6 強化發(fā)酵甜瓣子品質(zhì)分析

總酸、氨基酸態(tài)氮含量參考GB 5009.235—2016測定；甜瓣子中氨基酸的測定參考GB5009.124—2016進行測定；甜瓣子中有機酸含量參考GB5009.157—2016測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效乳酸菌的篩選

初篩得到的4株乳酸菌生長曲線如圖1所示。菌株ND1在24 h內(nèi)生長最為迅速，生長量高于其他菌株，而菌株ND3生長速度最緩慢。

圖1 菌株ND1、ND2、ND3、ND5在24 h內(nèi)生長曲線Fig.1 Growth curve of the four strains in 24 h

將菌株ND1、ND2、ND3、ND5接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃發(fā)酵24 h后測定乳酸含量，測定結(jié)果如圖2所示。培養(yǎng)24 h后，菌株ND1發(fā)酵液中乳酸含量為1.296 g/100g，ND2發(fā)酵液乳酸含量為1.263 g/100g，菌株ND3發(fā)酵液乳酸含量為0.977 g/100g，菌株ND5發(fā)酵液乳酸含量為1.211 g/100g。菌株ND1產(chǎn)乳酸能力高于其他菌株。根據(jù)以上結(jié)果篩選得到產(chǎn)酸能力最強，生長繁殖能力最強的菌株ND1為后續(xù)研究菌株。

圖2 菌株ND1、ND2、ND3、ND5產(chǎn)總酸量Fig.2 The concentration of total acid in the fermentationbroth of the four strains注：圖中不同字母代表差異顯著(P<0.05)

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)

將菌株ND1在MRS固體培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，37 ℃培育24 h，觀察其在MRS培養(yǎng)基上的形態(tài)特征，革蘭氏染色后觀察細胞形態(tài)。圖3為其菌落形態(tài)及顯微形態(tài)。菌落呈圓形，乳白色，隆起，邊緣整齊，表面光滑，有光澤，菌落較小。革蘭氏染色呈藍紫色，為革蘭氏陽性菌，顯微鏡下形態(tài)為小球形，對生，四聯(lián)，無芽孢。

圖3 菌落形態(tài)及顯微形態(tài)照片F(xiàn)ig.3 Colonial and cellular morphology of strain ND1

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

進化樹結(jié)果(圖4)顯示菌株ND1與乳酸片球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)ediococcusacidilacticiDSM 20284(AJ305320.1)聚為一個分支，相似度高，再結(jié)合形態(tài)特征，初步鑒定ND1為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。

圖4 菌株ND1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain ND1

2.3 優(yōu)勢菌株ND1的生長特性

2.3.1 優(yōu)勢菌株ND1不同酸性條件下的生長情況

圖5為ND1在不同酸性條件的生長情況，菌株ND1在培養(yǎng)基初始pH為5和6條件下生長速度最快，迅速進入對數(shù)生長期，10 h后進入穩(wěn)定期，此后OD值基本維持穩(wěn)定。初始培養(yǎng)基酸度越大，ND1生長速率越緩慢，在初始pH 3.5～4.5條件下均能良好生長。初始pH值為3.5時，ND1生長極為緩慢，培養(yǎng)8 h后開始緩慢生長，培養(yǎng)24 h 后OD610為0.448。

圖5 菌株ND1不同pH條件下的生長曲線Fig.5 Growth curve of strain ND1 in MRS medium with different pH

2.3.2 優(yōu)勢菌株ND1不同鹽度條件下的生長情況

甜瓣子發(fā)酵鹽度一般為10%～14%(質(zhì)量分數(shù))，因此菌株耐鹽能力對其后期的應(yīng)用極其重要。本試驗篩選的菌株ND1在NaCl濃度為3%、5%、8%條件下均能生長。鹽度越高，菌株生長速度越緩慢，NaCl為10%的條件生長極為緩慢，生長情況如圖6所示。菌株ND1能耐受10%的NaCl，在NaCl濃度為8%的條件下能緩慢生長，在3%和5%條件下長勢與對照組相同，生長量低于對照組。

圖6 菌株ND1不同鹽度下的生長曲線Fig.6 Growth curve of strain ND1 in MRS medium with different concentration of NaCl

2.3.3 優(yōu)勢菌株ND1不同溫度條件下的生長曲線

溫度是影響菌株生長和發(fā)酵甜瓣子的重要因素，目前豆瓣醬發(fā)酵多屬于常溫發(fā)酵(發(fā)酵池溫度從冬天到夏天溫度變化大，在8～40 ℃)，冬天發(fā)酵溫度低導(dǎo)致甜瓣子發(fā)酵速度極其緩慢。因此菌株能否在廣譜溫度條件下生長對菌株在豆瓣醬中的應(yīng)用具有重要意義。圖7是菌株ND1在高溫條件的生長情況，菌株ND1在30、37、45、50 ℃下均能生長，45 ℃條件下生長速度最快。菌株ND1在37 ℃和45 ℃長勢相同，2 h開始進入對數(shù)期，在10 h后進入穩(wěn)定期，穩(wěn)定期生長量最大，OD610約為1.732。圖8為菌株ND1在低溫條件的生長情況，菌株在試驗組低溫條件下均能生長，但生長速度緩慢。菌株ND1在10 ℃和20 ℃培養(yǎng)條件下生長趨勢相同，在9 h開始進入對數(shù)期，在48 h后增長速度變緩，146 h開始進入穩(wěn)定期。菌株ND1在4 ℃培養(yǎng)條件下，遲滯期較長，能緩慢生長。綜上，乳酸片球菌ND1在4～50 ℃條件均能生長，能在廣譜溫度范圍內(nèi)生長。高溫條件更利于菌株ND1的生長，其在37～45 ℃生長速度最快，生長量最大。菌株ND1在低溫(4～20 ℃)條件也能生長，這為菌株在低溫發(fā)酵食品的使用提供了可能性。

圖7 ND1在高溫條件生長曲線Fig.7 Growth curve of strain ND1 in MRS medium at different temperature(high temperature)

圖8 ND1在低溫條件生長曲線Fig.8 Growth curve of strain ND1 in MRS medium at different temperature(low temperature)

2.4 乳酸菌劑制備效果

采用500 L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)18 h，發(fā)酵液稀釋10倍后OD610達到1.8左右。發(fā)酵原液低溫離心得到菌泥，1∶1(g ∶mL)加入10%(質(zhì)量分數(shù))海藻糖保護劑后，采用冷凍干燥機干燥48 h，得到約1.5 kg菌粉，菌粉呈白色粉末狀，乳酸菌活菌數(shù)為1.07×1012CFU/g。發(fā)酵菌劑得率高，活菌濃度大，利于推廣應(yīng)用。

2.5 乳酸菌劑強化發(fā)酵甜瓣子品質(zhì)評價

2.5.1 氨基態(tài)氮和總酸含量分析

添加ND1乳酸菌劑發(fā)酵60 d的甜瓣子氨基態(tài)氮含量為0.804 g/100 g，總酸含量為2.849 g/100g；對照組氨基態(tài)氮含量為0.807 g/100g，總酸含量為2.023 g/100g。ND1乳酸菌劑對氨基態(tài)氮含量的影響較小，而對總酸含量的生成有促進作用，添加ND1菌劑的甜瓣子總酸含量略高于對照組。

2.5.2 氨基酸含量分析

由表1可知，添加ND1乳酸菌劑發(fā)酵的甜瓣子中氨基酸的組成與對照組相似，氨基酸總量(相對百分含量)分別為13.25%和13.12%。谷氨酸、天門冬氨酸、亮氨酸、精氨酸、脯氨酸為主要氨基酸。乳酸菌劑強化不影響甜瓣子發(fā)酵體系氨基酸的組成。

表1 乳酸菌劑ND1發(fā)酵甜瓣子中氨基酸含量統(tǒng)計 單位：%

注：t檢驗P<0.05表示樣品間差異顯著，不同字母代表差異顯著(下同)

2.5.3 有機酸含量分析

由表2可知，乳酸菌劑ND1促進有機酸的形成，ND1強化發(fā)酵組有機酸總量為27.08 mg/g，而空白組有機酸總量為19.63 mg/g。甜瓣子中乙酸、乳酸、蘋果酸、丁二酸、檸檬酸為主要的有機酸，以乙酸含量最為突出，分別為15.00和9.50 mg/g。乳酸菌劑ND1強化發(fā)酵甜瓣子對乙酸、乳酸、蘋果酸的增強作用最明顯，其中乳酸含量由空白組的1.86 mg/g增加到2.17 mg/g，蘋果酸由空白組的2.15 mg/g增加到3.71 mg/g，乙酸含量由空白組的9.50 g/mg增加到15.00 mg/g。

表2 乳酸菌劑ND1發(fā)酵甜瓣子中有機酸含量統(tǒng)計 單位：mg/g

3 討論

乳酸菌是發(fā)酵醬中重要的有益微生物。目前，乳酸菌尤其是四聯(lián)球菌被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵醬的增香，可明顯提高醬中有機酸、乙酸、甲酸、糠醛、糠醇等風(fēng)味物質(zhì)的含量[20]。WU 等[21]采用四聯(lián)球菌強化發(fā)酵豆瓣醬，豆瓣醬中氨基態(tài)氮、酸類、醇類等揮發(fā)性成分均有所提高，而亞硝酸鹽含量減少了39.4%。關(guān)統(tǒng)偉等[24]研究表明乳酸片球菌在甜瓣子發(fā)酵過程中相對含量較高，是甜瓣子發(fā)酵過程中優(yōu)勢細菌。乳酸片球菌一般能耐受9%～10%的鹽，耐鹽能力較強[25]。乳酸片球菌可通過代謝葡萄糖、果糖、甘露糖等物質(zhì)產(chǎn)有機酸，增強風(fēng)味，還能產(chǎn)生胞外多糖[26]。乳酸片球菌能合成片球菌素，被廣泛的用作天然抑菌劑[27-28]。乳酸片球菌的環(huán)境適應(yīng)能力更強，生長速度更快，因此采用乳酸片球菌用于甜瓣子強化發(fā)酵具有明顯優(yōu)勢。

本研究篩選得到的乳酸片球菌ND1具有良好的溫度、酸度、鹽度適應(yīng)性，其生長能力及環(huán)境耐受能力明顯高于目前已報道的發(fā)酵醬中篩選出的乳酸菌[29]。菌株ND1在低溫條件(4～10 ℃)也能緩慢生長，這為菌株在低溫發(fā)酵食品的使用提供了可能性[30]。乳酸片球菌ND1在發(fā)酵罐中易培養(yǎng)，發(fā)酵得到的乳酸菌菌劑活菌數(shù)可達1.07×1012CFU/g。產(chǎn)品得率較高，利于其在甜瓣子發(fā)酵企業(yè)的推廣應(yīng)用。將乳酸片球菌ND1菌劑添加于甜瓣子發(fā)酵階段，甜瓣子的有機酸含量得到明顯提高，尤其是乙酸、蘋果酸、乳酸的含量得到明顯提升。因此，甜瓣子中乳酸片球菌ND1菌劑的添加可達到調(diào)控產(chǎn)品有機酸組成及風(fēng)味的目的。

4 結(jié)論

從傳統(tǒng)發(fā)酵甜瓣子中篩選得到1株產(chǎn)酸能力強、生長迅速的乳酸片球菌ND1。乳酸片球菌ND1具有良好的溫度、鹽度、酸度適應(yīng)性，其生長能力及環(huán)境耐受能力明顯高于已報道的發(fā)酵醬中篩選出的乳酸菌。菌株繁殖能力強，擴大培養(yǎng)制備菌劑活菌得率高，為其推廣應(yīng)用提供了優(yōu)勢。利用乳酸片球菌ND1菌劑強化發(fā)酵甜瓣子，可有效提高有機酸尤其是乙酸、蘋果酸、乳酸的含量。采用乳酸片球菌強化發(fā)酵甜瓣子具有明顯優(yōu)勢，菌劑制備高活菌數(shù)的方法為其工業(yè)推廣應(yīng)用提供了保障。