潘秀花 白 力 謝福川 江曉聰 藍(lán)玉宏 肖 偉

宮頸癌屬于1種女性惡性腫瘤，在臨床極為常見(jiàn)，在發(fā)展中國(guó)家中，其發(fā)病率位居第一位[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，其5年生存率維持在約55%。目前，臨床普遍認(rèn)為[2]，放療在宮頸癌的治療中發(fā)揮著極為重要的作用，尤其是在中晚期宮頸癌的治療中。雖然近年來(lái)，醫(yī)學(xué)界在一定程度上改善了放療技術(shù)設(shè)備，比如，應(yīng)用了計(jì)算機(jī)、后裝治療技術(shù)、高能射線(xiàn)等，但是并沒(méi)有在極大程度上改進(jìn)宮頸癌的療效，同時(shí)也沒(méi)有在極大程度上提升患者的生存率，發(fā)生這一現(xiàn)象的原因主要為沒(méi)有控制局部腫瘤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[3]，腫瘤細(xì)胞乏氧是沒(méi)有控制局部腫瘤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要誘發(fā)因素，腫瘤細(xì)胞對(duì)放射線(xiàn)敏感性在其持續(xù)性增長(zhǎng)浸潤(rùn)等因素下降低，放療副反應(yīng)對(duì)有效治療劑量的增加造成了限制，對(duì)放療治療療效造成了不良影響。實(shí)驗(yàn)證實(shí)[4-5]，和乏氧條件相比，有氧條件下細(xì)胞具有顯著較高的敏感性，腫瘤細(xì)胞對(duì)放射治療敏感性降低的主要原因?yàn)榇嬖诜ρ跫?xì)胞。HIF-1a和VEGF均與腫瘤血管的發(fā)生密切相關(guān)，阻斷HIF-1a從而使誘導(dǎo)VEGF的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)減少，可抑制腫瘤血管的生成及腫瘤生長(zhǎng)。本研究探討了宮頸鱗癌患者組織中HIF-1α和VEGF的表達(dá)及在放療中的意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2016年8月至2018年8月我院宮頸鱗癌單純放療患者60例，隨機(jī)分為2組：一組緩解組(30例)，一組未緩解組(30例)。緩解組患者年齡45～60歲，平均(47.4±7.6)歲。在腫瘤大小方面，20例≤4 cm，10例>4 cm；在臨床分期方面，17例為ⅡB期，13例為ⅢA～B期；在病理分級(jí)方面，8例為高分化，12例為中分化，10例為低分化。未緩解組患者年齡46～60歲，平均(48.2±7.5)歲。在腫瘤大小方面，19例≤4 cm，11例>4 cm；在臨床分期方面，16例為ⅡB期，14例為ⅢA～B期；在病理分級(jí)方面，9例為高分化，10例為中分化，11例為低分化。兩組患者的一般資料比較差異均不顯著(P>0.05)。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料均詳細(xì)；②均經(jīng)病理診斷為宮頸鱗癌；③均接受放療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①活檢前接受過(guò)放化療治療；②缺乏完整的臨床資料；③合并其他嚴(yán)重疾病。

1.3 方法

1.3.1 治療方法 采用高能X線(xiàn)治療機(jī)對(duì)兩組患者進(jìn)行體外放療，放療技術(shù)采用三維適形放療或三維適形調(diào)強(qiáng)放療，劑量為95%PGTVn： 6 000 cGy/25次，95%PTV：4 500～5 000 cGy/25次，內(nèi)照射采用高劑量率192銥后裝治療5～6次，A點(diǎn)劑量在3 000～3 600 cGy之間。

1.3.2 檢測(cè)方法 購(gòu)買(mǎi)北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的兔抗人HIF-1α多克隆抗體，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的兔抗人VEGF單克隆抗體，日本Olympus公司生產(chǎn)的Olympus顯微鏡。數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)為motic Med 6.0。運(yùn)用免疫組化EM-vision二步法檢測(cè)兩組患者組織中HIF-1α和VEGF的表達(dá)，用10%福爾馬林固定標(biāo)本，常規(guī)脫水石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為3～4 μm。逐步脫蠟至水，用PBS進(jìn)行10 min洗滌，共3次。用0.01的枸櫞酸修復(fù)液進(jìn)行15 min微波修復(fù)，涼至室溫。室溫下在3%過(guò)氧化氫中進(jìn)行10 min作用。用PBS進(jìn)行10 min的洗滌，共3次。再次用PBS進(jìn)行10 min的洗滌，共3次。將兔抗人HIF-1α抗體和兔抗人VEGF抗體加入，工作濃度分別為1∶300、1∶100。在4 ℃的溫度下過(guò)夜。用PBS進(jìn)行10 min的洗滌，共3次。將通用型二抗添加其中，在37 ℃的溫度的溫箱中放置25 min。用PBS進(jìn)行10 min的洗滌，共3次。顯色，在此過(guò)程中將新鮮配置的DAB顯色液充分利用起來(lái)，用流水進(jìn)行10 min的沖洗，用蘇木精進(jìn)行5～10 min的復(fù)染，用流水進(jìn)行1 min的返藍(lán)，依次脫水、透明、封固，之后封片，在此過(guò)程中將中性樹(shù)膠充分利用起來(lái)。顯微鏡下對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷并采圖。

1.4 結(jié)果判定

HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，則胞核或胞質(zhì)上定位，高倍鏡下(×400)將5個(gè)視野從每張切片中隨機(jī)選取出來(lái)，對(duì)200個(gè)細(xì)胞/視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，共計(jì)1000個(gè)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<1%、1%～10%、11%～50%、>51%分別評(píng)定為-、+、++、+++[6]；VEGF陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，在胞質(zhì)上定位，依據(jù)切片中著色細(xì)胞數(shù)量比率分類(lèi)，<5%、6%～25%、26%～50%、>51%分別評(píng)定為-、+、++、+++[7]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)數(shù)資料用率表示，用χ2檢驗(yàn)。用Pearson相關(guān)性分析分析相關(guān)性，應(yīng)用SPSS 21.0，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般資料比較

兩組患者的一般資料比較差異均不顯著(P>0.05)(表1)。

2.2 兩組患者HIF-1α表達(dá)比較

60例患者中，HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性47例，陽(yáng)性率為78.3%，其中未緩解組患者的HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性率[90.0%(27/30)]，顯著高于緩解組[66.7%(20/30)](P<0.05)。具體見(jiàn)表2。

2.3 兩組患者VEGF表達(dá)比較

60例患者中，VEGF表達(dá)陽(yáng)性39例，陽(yáng)性率為65.0%，其中未緩解組患者的VEGF表達(dá)陽(yáng)性率[80.0%(24/30)]顯著高于緩解組[50.0%(15/30)](P<0.05)。具體見(jiàn)表3。

表1 兩組患者的一般資料比較(例，%)

表2 兩組患者HIF-1α表達(dá)情況比較(例，%)

表3 兩組患者VEGF表達(dá)比較(例，%)

2.4 兩組患者HIF-1α和VEGF表達(dá)的相關(guān)性分析

未緩解組患者HIF-1α與VEGF表達(dá)呈顯著正相關(guān)關(guān)系(γ=0.958，P<0.05)，但緩解組患者的HIF-1α與VEGF表達(dá)無(wú)相關(guān)性(γ=0.670，P>0.05)。

3 討論

近年來(lái)，臨床不斷深入地研究了腫瘤，相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[8-10]，在生長(zhǎng)過(guò)程中，腫瘤特別是實(shí)體惡性腫瘤極易有缺氧現(xiàn)象發(fā)生。缺氧細(xì)胞會(huì)放射治療、化學(xué)治療，因此亟待臨床將1個(gè)可靠的代表缺氧的標(biāo)志尋找出來(lái)來(lái)對(duì)治療的合理性進(jìn)行評(píng)價(jià)?，F(xiàn)階段，相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[11-12]，腫瘤細(xì)胞局部缺氧主要對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)的產(chǎn)生進(jìn)行誘導(dǎo)，其屬于1種轉(zhuǎn)錄因子，在特異性低氧狀態(tài)下將活性發(fā)揮出來(lái)，其組成成分為α亞基、β亞基，HIF-1α是HIF-1α特有的，HIF-1β是HIF-1的組成性表達(dá)。HIF-1α屬于1種氧調(diào)節(jié)蛋白，對(duì)HIF-1活性具有決定性作用。細(xì)胞中的HIF-1α在缺氧等應(yīng)激條件下被激活，使機(jī)體、組織、細(xì)胞將一系列適應(yīng)性反應(yīng)產(chǎn)生，從而對(duì)供氧平衡進(jìn)行維持，在多種腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化中參與，為腫瘤生長(zhǎng)提供良好的前提條件。

豐富的營(yíng)養(yǎng)供給在惡性腫瘤的持續(xù)性生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用，在惡性腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移中，對(duì)新生血管生成進(jìn)行誘導(dǎo)是1個(gè)前提條件，如果未生成血管，那么原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)厚度到約107個(gè)細(xì)胞就不再增大，或生長(zhǎng)不會(huì)超過(guò)1～2 mm3。腫瘤組織中血管生成將重要的基礎(chǔ)條件提供給了氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向腫瘤組織進(jìn)入、將代謝產(chǎn)物向組織細(xì)胞外運(yùn)出、腫瘤細(xì)胞向靶器官遷移。血管生成確定則腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，腫瘤細(xì)胞能夠?qū)⒈姸嗟难苌梢蜃臃置诔鰜?lái)。其中，現(xiàn)階段，VEGF作為1種血管生成促進(jìn)因子最為關(guān)鍵，在腫瘤血管生成的參與調(diào)控因子中，其占有重要地位，能夠和血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合，為內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)提供良好的前提條件，促進(jìn)血管通透性的增加，進(jìn)而為血管生成提供良好的前提條件[13-14]。

腫瘤組織局部缺氧會(huì)將VEGF基因的表達(dá)水平上調(diào)，該作用和HIF-1α關(guān)系密切，在基因水平上，活化的HIF-1α對(duì)VEGF表達(dá)進(jìn)行直接調(diào)控，能夠增強(qiáng)VEGF的穩(wěn)定性，同時(shí)促進(jìn)VEGF轉(zhuǎn)錄活性的增加，為腫瘤血管形成提供良好的前提條件，使其對(duì)缺氧環(huán)境進(jìn)行適應(yīng)，同時(shí)抵抗放化療。此外，腫瘤血管形成將良好的條件創(chuàng)造給了腫瘤的不斷增大、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、局部浸潤(rùn)。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明[15]，在宮頸癌放射治療過(guò)程中，HIF-1α和VEGF可能發(fā)揮著主要作用，在預(yù)測(cè)宮頸癌放射治療療效及患者預(yù)后的過(guò)程中，可以將其作為1個(gè)參考指標(biāo)。同時(shí)，在宮頸癌治療中，HIF-1α和VEGF也可能能夠作為新參考指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，60例患者中，HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性47例，陽(yáng)性率為78.3%，其中未緩解組患者的HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性率90.0%(27/30)顯著高于緩解組66.7%(20/30)(P<0.05)。60例患者中，VEGF表達(dá)陽(yáng)性39例，陽(yáng)性率為65.0%，其中未緩解組患者的VEGF表達(dá)陽(yáng)性率80.0%(24/30)顯著高于緩解組50.0%(15/30)(P<0.05)。未緩解組患者的HIF-1α和VEGF的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，但緩解組患者的患者的HIF-1α和VEGF的表達(dá)無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，和上述相關(guān)醫(yī)學(xué)研究結(jié)果一致。

總之，宮頸鱗癌放療緩解患者組織中HIF-1α和VEGF的表達(dá)陽(yáng)性率顯著低于放療未緩解患者。