徐小潔，余 鴻

（1.南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 南通 226016；2.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000）

宮內(nèi)缺氧是胚胎發(fā)育中的常見問題，神經(jīng)細(xì)胞對缺氧極為敏感（尤其在胚胎發(fā)育期），致使出生后出現(xiàn)智力障礙、腦性癲癇、癱瘓等嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前，國內(nèi)外關(guān)于宮內(nèi)缺氧對神經(jīng)系統(tǒng)的影響機(jī)制及腦內(nèi)一些神經(jīng)遞質(zhì)的表達(dá)變化報道甚少。因此，探討宮內(nèi)缺氧對海馬CA3區(qū)突觸體素（SYN）和Jmjd6的表達(dá)變化及對幼年大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

小鼠抗SYN購自美國Millipore公司，兔抗Jmjd6購自Abcam（Hong Kong）Ltd，羊抗小鼠及羊抗兔均購自北京中杉金橋公司，Leica RM2245電動切片機(jī)購自德國Leica公司，Morris水迷宮跟蹤系統(tǒng)購自成都泰盟公司，三氣培養(yǎng)箱購自美國REVCO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

選擇健康成年雌性SD大鼠14只（第三軍醫(yī)大學(xué)滕鑫生物技術(shù)有限公司提供），體重230～250 g，分別與健康成年雄性SD大鼠5只（西南醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供），體重230～250 g，按1∶1先后合籠飼養(yǎng)配種，以第二日晨發(fā)現(xiàn)雌鼠陰栓記為妊娠0 d，取出雌鼠單獨(dú)飼養(yǎng)至孕第14 d。將孕鼠隨機(jī)分為對照組和缺氧組，分別為6只和8只。

1.3 方法

1.3.1 宮內(nèi)缺氧 將缺氧組孕鼠自孕第14 d開始，放入設(shè)置好（氧濃度130 ml/L，二氧化碳濃度0.3～0.4 ml/L，溫度25℃，相對濕度75%～80%）的智能型三氣培養(yǎng)箱中制作缺氧腦損傷新生鼠模型，當(dāng)培養(yǎng)箱控制面板上的數(shù)值達(dá)到與設(shè)置值一致時開始記錄缺氧時間，自孕14 d開始每天缺氧2 h，連續(xù)5 d（孕期第 14、15、16、17、18 d），對照組不缺氧。兩組孕鼠自然分娩（孕第21 d），產(chǎn)后兩組每窩隨機(jī)選取新生鼠兩只飼養(yǎng)至30 d（30日齡）。

1.3.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 對30日齡的幼年大鼠進(jìn)行11 d的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)方法[1]如下：四象限階段訓(xùn)練，每個象限時間間隔10 min，若訓(xùn)練時大鼠下水60 s仍未找到平臺，則引導(dǎo)大鼠到平臺上，使其在平臺上停留10 s，連續(xù)訓(xùn)練5 d，第6 d（35日齡）進(jìn)行無平臺60 s空間探查測試，記錄在目標(biāo)象限的探查時間T1。第7 d開始維持4 d的對位訓(xùn)練，訓(xùn)練方法同前，僅平臺移至對側(cè)象限，第11 d（40日齡）進(jìn)行60 s無平臺對位探查測試，記錄在目標(biāo)象限的探查時間T2。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境不變，保持安靜，實(shí)驗(yàn)者始終處于同一位置，距泳池最近邊緣約60 cm。

1.3.3 幼鼠取材、石蠟切片、免疫組化染色 于Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)日取參與實(shí)驗(yàn)的幼年大鼠腦組織，常規(guī)石蠟切片（自大鼠大腦前囟向尾側(cè)方向2 mm處，經(jīng)海馬冠狀面切片，切片厚5μm），切片脫蠟至水，行SYN、Jmjd6免疫組化染色。

1.3.4 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 將各免疫組化染色切片放在網(wǎng)絡(luò)版數(shù)碼顯微鏡DMBA200下照相，放大400倍。用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司）對圖像進(jìn)行分析，所有指標(biāo)觀察面積為800×600像素，取海馬CA3區(qū)中的恒定部位對各指標(biāo)進(jìn)行分析。比較兩組SYN和Jmjd6陽性細(xì)胞的積分光密度（IOD）值。各指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。同一指標(biāo)組間比較運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，缺氧組幼年大鼠探查測試時間（T1）和對位探查測試時間（T2）均較對照組短，差異有顯著性（P＜0.05），見表 1。

表1 兩組幼年大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)在目標(biāo)象限搜索時間比較（±s，s）

表1 兩組幼年大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)在目標(biāo)象限搜索時間比較（±s，s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別 T1 24.38±4.89 18.47±4.41*n T2對照組缺氧組6 8 22.04±5.57 15.38±6.10*t值P值3.354 0.002 2.965 0.006

2.2 兩組幼年大鼠海馬CA3區(qū)SYN免疫組化染色結(jié)果

陽性物質(zhì)為棕黃色的點(diǎn)狀或細(xì)顆粒狀物，分布密集，且集中在多形層（見圖1、圖2）。圖像分析顯示，缺氧組SYN陽性細(xì)胞的IOD值比對照組小（P＜0.05），見表2。

圖1 對照組SYN陽性物質(zhì)（免疫組化染色法，400×）

圖2 缺氧組SYN陽性物質(zhì)（免疫組化染色法，400×）

2.3 兩組幼年大鼠海馬CA3區(qū)Jmjd6免疫組化染色結(jié)果

陽性細(xì)胞胞質(zhì)被染成棕黃色，細(xì)胞中央卵圓形或圓形空泡為細(xì)胞核；陽性細(xì)胞呈區(qū)域性分布，主要位于顆粒層（見圖3、圖4）。圖像分析顯示，缺氧組Jmjd6陽性細(xì)胞的IOD值比對照組高（P＜0.05），見表 2。

圖3 對照組Jmjd6陽性細(xì)胞（免疫組化染色法，400×）

圖4 缺氧組Jmjd6陽性細(xì)胞（免疫組化染色法，400×）

表2 SYN和Jmjd6陽性細(xì)胞積分光密度值比較

3 討論

3.1 宮內(nèi)缺氧導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力下降

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)由美國科學(xué)家Richard GM Morris于1981年創(chuàng)立[1]。目前常用來作為評價動物學(xué)習(xí)與記憶的模型。這一實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)是，嚙齒類動物在水中有強(qiáng)烈的逃避水環(huán)境的動機(jī)，并以最快、最直接的途徑逃離水環(huán)境。學(xué)會逃避水環(huán)境的過程體現(xiàn)動物的學(xué)習(xí)能力；根據(jù)周圍環(huán)境進(jìn)行空間定位，有目的地游往水中安全的地方（平臺），體現(xiàn)動物的空間記憶能力。海馬在工作、學(xué)習(xí)、記憶過程中發(fā)揮重要作用，對缺氧損傷極為敏感[2]。已有報道表明，缺氧能夠損傷大鼠空間記憶能力[3]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，自孕 14 d 開始孕鼠連續(xù)缺氧（130 ml/L）5 d（2 h/d）后，幼鼠探查測試和對位探查測試在目標(biāo)象限的搜索時間均較對照組明顯延長，說明缺氧組幼鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力下降，宮內(nèi)缺氧降低了大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力。

3.2 突觸體素含量降低導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力下降

突觸體素（synaptophysin，SYN）又稱P38，可作為海馬CA3區(qū)神經(jīng)元功能和損傷修復(fù)的標(biāo)示物[4]。突觸體素含量越低，記憶損傷越嚴(yán)重[5]。本實(shí)驗(yàn)通過對突觸體素免疫組化染色及其積分光密度檢測，發(fā)現(xiàn)缺氧組幼年大鼠海馬CA3區(qū)的突觸體素含量明顯少于對照組，IOD值顯著低于對照組。說明缺氧導(dǎo)致突觸體素含量降低，進(jìn)而導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力降低。

3.3 Jmjd6功能減弱導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力下降

Takeuchi等[6]于1995年發(fā)現(xiàn)Jumonji基因，該基因是小鼠神經(jīng)管形成的必需基因，其編碼產(chǎn)物Jmj蛋白質(zhì)含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（AT-rich interactiondomain，ARID）和兩種保守的 Jmj結(jié)構(gòu)域（JmjN、JmjC）。Jmjd6（Jumonji C domain containing gene 6）屬加雙氧酶，且是一種組蛋白精氨酸去甲基酶[7]。JmjC結(jié)構(gòu)域可以使精氨酸上的甲基羥基化而去掉甲基[8]，這需要氧的參與。在宮內(nèi)缺氧條件下，JmjC結(jié)構(gòu)域不能發(fā)揮正?；钚曰蚧钚院苋?。Jmjd6的加雙氧酶功能和組蛋白精氨酸的去甲基化功能就不能正常發(fā)揮或功能很弱，可以通過以下途徑影響宮內(nèi)缺氧幼年大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力：第一，Jmjd6可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化和增殖，異常調(diào)節(jié)可以影響細(xì)胞的成熟以及導(dǎo)致腫瘤[9]，缺氧使Jmjd6的功能不能正常發(fā)揮，從而導(dǎo)致功能不正常的神經(jīng)元不斷分化、增殖，造成智力低下；第二，不能正常發(fā)揮作用的Jmjd6通過改變基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子受體1（Flt1）而影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的再生功能[10]。所以，缺氧導(dǎo)致的Jmjd6不能正常發(fā)揮作用而抑制血管生成，在本實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為缺氧組幼年大鼠大腦中的血管數(shù)量減少，腦供血相對不足進(jìn)而出現(xiàn)智力低下。這與本次Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中缺氧組幼年大鼠探查測試和對位探查測試在目標(biāo)象限的搜索時間均較對照組短的結(jié)果一致。本研究對Jmjd6進(jìn)行了免疫組化染色及積分光密度檢測，發(fā)現(xiàn)缺氧組幼年大鼠海馬CA3區(qū)Jmjd6含量明顯高于對照組，說明宮內(nèi)缺氧可能導(dǎo)致Jmjd6功能不能正常發(fā)揮或功能減弱進(jìn)而造成海馬CA3區(qū)功能不正常的神經(jīng)元數(shù)量增多，從而降低了大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力。