胡文萍 董新龍,2 田志龍 湯繼順,3 劉秋月 王翔宇 狄 冉 張效生 張金龍 王金玉 儲明星*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100193； 2.揚(yáng)州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009； 3.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，合肥 230031； 4.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381)

動物受精的成敗決定種群能否在自然界穩(wěn)定存在。哺乳動物受精過程中主要經(jīng)歷了精子獲能、穿越放射冠、識別卵子透明帶、發(fā)生頂體反應(yīng)、精卵粘附與融合、卵母細(xì)胞第二極體排出、兩性原核的融合等步驟[1-2]。早期研究表明致育蛋白(Fertilin)存在于精子質(zhì)膜上，是一種在精子-卵質(zhì)膜粘附中起作用的精子表面蛋白，并可能參與受精卵融合[3-6]。致育蛋白由Fertilin α和Fertilin β 2 個亞基組成：敲除Fertilin α基因的雄性小鼠仍能生育[7]；敲除Fertilinβ基因小鼠表現(xiàn)出雄性不育，主要原因不是質(zhì)膜融合失敗，而是精子無法與透明帶粘附且從子宮向輸卵管的遷移發(fā)生障礙[8]。

Inoue等[9]發(fā)現(xiàn)精子表面蛋白Izumo1 (Izumo sperm-egg fusion 1, Izumo1)與精卵結(jié)合相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)：卵子表面的Juno蛋白是Izumo1在卵子表面的受體[10]；Izumo1和Juno的相互作用是精卵質(zhì)膜融合所必須，Izumo1和Juno也是目前發(fā)現(xiàn)的精子和卵子質(zhì)膜上的第一個配體-受體蛋白對。Izumo 是免疫球蛋白超家族(Immunoglobulin superfamily, IgSF)的成員[11-12]。而Izumo1是Izumo基因家族的成員之一，Izumo基因家族有4 個成員，分別為Izumo1、Izumo2、Izumo3和Izumo4，擁有同源的N端結(jié)構(gòu)域，“Izumo結(jié)構(gòu)域”。Izumo1～3是跨膜蛋白，均在睪丸上特異性表達(dá)。Izumo1也在人[14]、小鼠[9]、豬[1]、綿羊[15]等哺乳動物受精過程中表達(dá)。Izumo4是可溶性蛋白，在包括睪丸的多種組織中表達(dá)[9,13]。Izumo1的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域中有1 個免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)結(jié)構(gòu)域，并在成熟精子的頂層上表達(dá)，頂體反應(yīng)之后，Ig結(jié)構(gòu)域在精子表面暴露。Izumo1的Ig結(jié)構(gòu)域上存在1 個潛在的糖基化位點，在C-末端還有1 個跨膜結(jié)構(gòu)域和1 個短的胞質(zhì)內(nèi)尾巴，屬I型膜蛋白。

NCBI上公布的特克賽爾羊Izumo1基因位于第14 號染色體上，其DNA全長3 326 bp，擁有8 個外顯子和7 個內(nèi)含子，編碼320 個氨基酸。Izumo1基因編碼的蛋白質(zhì)位于精子質(zhì)膜內(nèi)部，在精子上特異性表達(dá)[14]。在頂體反應(yīng)發(fā)生時，Izumo1蛋白會從精子頭部前端重新定位到發(fā)生融合的位點，包括整個精子頭部和精子赤道部位，使得在頂體反應(yīng)后暴露在精子頭部的膜外。通過Izumo1的抗體抑制試驗?zāi)軌蛎黠@地抑制精卵間的結(jié)合和融合過程[1,9,11]，將Izumo肽段直接注射到體內(nèi)可以造成雌性小鼠免疫性不孕[16]。Izumo基因雙敲除的雌性小鼠具有正常生育能力，但是雄性小鼠雖然能夠正常生長、產(chǎn)生精子和進(jìn)行交配，卻無法產(chǎn)生后代。通過體外受精試驗發(fā)現(xiàn)，Izumo1-/-雄性小鼠的精子雖然可以與去透明帶卵母細(xì)胞正常結(jié)合，但不能繼續(xù)融合而是積留在質(zhì)膜外側(cè)的卵周隙中無法完成受精過程。將Izumo缺陷型精子注射到野生型卵母細(xì)胞中，能正常的產(chǎn)生子代，且其子代擁有正常的生育能力。人類精子也含有Izumo，添加抗人類Izumo的多克隆抗體能使精子無法與去透明帶的倉鼠卵融合[9]。這些結(jié)果均表明Izumo1參與介導(dǎo)并影響精卵融合過程。

目前，對于Izumo1基因的研究多在哺乳動物精卵融合方面。牛[17]、豬[1]、內(nèi)蒙古白絨山羊[14,18]、綿羊(品種未知)[14,18]和斑馬魚[19]的Izumo1基因被成功克隆。內(nèi)蒙古白絨山羊、綿羊(品種未知)2者的Izumo1基因同源性高達(dá)99.9%，并與牛、鼠和人Izumo1基因高度同源[18]。然而，Izumo1基因在各個物種中的多態(tài)性以及與產(chǎn)生子代數(shù)目的相關(guān)性研究，特別是有關(guān)多羔和常年發(fā)情的高繁殖力綿羊小尾寒羊[20-21]Izumo1基因的克隆，多態(tài)性檢測及與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)研究尚未見報道。本課題組前期對來自10 個綿羊品種的99 個個體進(jìn)行了全基因組重測序，獲得了大量的基因多態(tài)性數(shù)據(jù)。為研究Izumo1基因的多態(tài)性及與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系，本研究擬利用PCR和直接測序法對小尾寒羊和蘇尼特羊Izumo1基因DNA進(jìn)行擴(kuò)增和測序，并與本課題組前期綿羊重測序數(shù)據(jù)比對，在多羔和單羔綿羊群體中篩選出SNP位點，并采用Sequenom MassARRAY?技術(shù)進(jìn)行Izumo1基因分型，研究其SNP位點的各種基因型在各群體中的分布，以期獲得與繁殖相關(guān)的候選SNPs位點，為綿羊遺傳育種研究提供新的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

選擇760 只年齡在3 歲左右的經(jīng)產(chǎn)綿羊，包括：有產(chǎn)羔數(shù)記錄的多羔品種小尾寒羊380 只；5 個單羔品種共計380 只(單羔品種分別是蘇尼特羊100 只，灘羊80 只，薩?？搜?9 只，杜泊羊30 只，草原型藏羊131 只)。其中：小尾寒羊來自山東省鄆城縣誠聯(lián)小尾寒羊種羊場和山東省章丘市晟益牧業(yè)有限公司，蘇尼特羊來自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗民羊牧業(yè)有限責(zé)任公司，灘羊來自寧夏鹽池縣寧夏朔牧鹽池灘羊繁育有限公司，薩?？恕⒍挪囱騺碜员本┦许樍x區(qū)北京奧鑫牧業(yè)有限公司；草原型藏羊來自西藏當(dāng)雄縣。對所有綿羊進(jìn)行頸靜脈采血，每只綿羊分別采血10 mL，經(jīng)EDTA抗凝處理后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2×TaqPCR Master Mix(MT201-01)購自北京博邁德；TaKaRa LATaq?with GC Buffer (RR02AG)、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0 (9762)、E.coliDH5α Competent Cells (9057)、pMDTMe18-T Vector Cloning Kit (6011)均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 DNA提取及檢測

參照血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)說明書提取DNA。用Nanodrop 2000檢測DNA的純度和濃度，1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)綿羊Izumo1基因全基因組序列(GenBank登錄號為：NC_019471.2)，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計Izumo1基因DNA序列擴(kuò)增引物。Izumo1基因DNA序列較長，為了方便測序和提高測序準(zhǔn)確度，故分段設(shè)計4 對擴(kuò)增引物，分別是P1、P2、P3和P4。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。引物序列、擴(kuò)增片段大小及退火溫度見表1。

1.4 DNA序列擴(kuò)增

以提取的血液基因組DNA為模板，用上、下游分段引物擴(kuò)增目的基因DNA序列。

使用TaKaRa公司高保真LATaq酶體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體反應(yīng)體系如下：0.25 μL TaKaRa LATaq(5 U/μL)，10 μL 2× GC Buffer I (5 mmol/L Mg2+Plus)，3 μL dNTP Mixture (各2.5 mmol/L)，4.25 μL RNase-free ddH20，0.5 μL上游引物，0.5 μL下游引物，1.5 μL血液DNA模板，總計20 μL反應(yīng)體系。

1.4.2PCR反應(yīng)程序

Izumo1基因：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，Ta退火溫度退火1 min，72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測所得片段大小，將陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司克隆測序。

1.5 SNP位點篩選

DNAMAN軟件進(jìn)行多重比對和分析目的基因DNA序列，并結(jié)合Chromas軟件中的峰圖判斷和本課題組前期重測序數(shù)據(jù)，以同一位點不同堿基出現(xiàn)比例>30%認(rèn)定為SNP位點。初步篩選得到SNP位點，鑒定同義突變和非同義突變。

表1 綿羊Izumo1基因DNA擴(kuò)增引物Table 1 Primers used for amplifying DNA of Izumo1 gene in sheep

1.6 基因分型

對篩選獲得的目的基因SNP位點，通過Sequenom MassARRAY?(Sequenom iPLEXTMassay, San Diego, CA)基因分型系統(tǒng)對小尾寒羊、蘇尼特羊、灘羊、薩?？搜?、杜泊羊和草原型藏羊血液DNA樣品進(jìn)行SNP分型，試驗步驟按照儀器操作指南進(jìn)行。試驗由北京君諾德生物技術(shù)有限公司完成。

1.7 統(tǒng)計分析

用Popgene 32(version 3.2)軟件和PIC-CALC程序?qū)Λ@得的SNP位點分型結(jié)果進(jìn)行處理，計算其雜合度He(Heterozygosity)、多態(tài)信息含量PIC(Polymorphism information content)等。采用SPSS 18.0軟件卡方檢驗對2 個品種的各SNPs位點基因型頻率和基因頻率進(jìn)行差異顯著性檢驗，并與產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。相關(guān)性分析模型為：

yijkl=μ+Genotypei+Pj+Sk+eijkl

式中：yijkl為性狀觀察值；μ為總體均數(shù)；Genotypei為基因型效應(yīng)；Pj為胎次效應(yīng)；Sk為場次效應(yīng)；eijkl為隨機(jī)誤差。假定eijkl相互獨(dú)立，服從N(0，σ2)分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液DNA檢測結(jié)果

利用NanoDrop 2000超微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測小尾寒羊和蘇尼特羊組織DNA的純度、濃度和完整性。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D260nm/D280nm比值都在1.8～2.0范圍內(nèi)，濃度均在30 ng/μL 以上，電泳條帶合格，可用于后續(xù)試驗。

2.2 DNA序列擴(kuò)增結(jié)果

凝膠電泳結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增的DNA片段條帶明亮且單一，大小與設(shè)計一致，說明擴(kuò)增結(jié)果良好(圖1)。使用DNAMAN軟件對測序得到的DNA片段進(jìn)行序列拼接，成功得到2 種綿羊Izumo1基因完整DNA序列。特克賽爾羊Izumo1基因DNA全長序列為3 326 bp，本試驗擴(kuò)增得到的小尾寒羊Izumo1基因DNA全長序列3 385 bp，蘇尼特羊Izumo1基因DNA全長序列3 382 bp。BLAST結(jié)果顯示二者與特克賽爾羊Izumo1基因DNA序列的相似性都高于95%。與NCBI數(shù)據(jù)庫中提供的特克塞爾羊Izumo1基因DNA序列相比：在Izumo1基因DNA序列605 bp位置，小尾寒羊和蘇尼特羊分別多出了57和55 bp的序列(57 bp: ACCCCCCACCCCCCCCGCGCAGATGAGGCCA-CACTGGAAAAGGCATCCTGGAGTTTG；55 bp: ACCCCCCACCCCCCGCGCAGATGAGGCCACA-CTGGAAAAGGCATCCTGGAGTTTG)。

M：DL2 000 DNA分子量標(biāo)記； P1～ P4：綿羊Izumo1基因DNA擴(kuò)增引物。
M, DL2 000 DNA marker； P1-P4, primers used for amplifying DNA ofIzumo1gene in sheep.
圖1Izumo1基因序列分段擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖
Fig.1 Electrophoresis of segmental amplification products ofIzumo1gene

2.3 SNP位點篩選結(jié)果分析

用4 對引物分別對小尾寒羊和蘇尼特羊的60 個樣品進(jìn)行目的基因序列的SNP位點篩選，對PCR擴(kuò)增特異性好的單一條帶進(jìn)行雙向測序，測序峰圖清晰可辨的位點用于SNP統(tǒng)計共獲得了5 個SNP位點(g.54409483A>G，g.54410565A>G，g.54411606C>A，g.54411750T>C，g.54411792A>G)(圖2)。另外結(jié)合本課題組前期對10 個綿羊品種的99 個個體進(jìn)行的全基因組重測序數(shù)據(jù)，篩選得到Izumo1基因的另外3 個SNP突變位點(g.54409033T>A， g.54412107C>A，g.54412135A>G)。共篩選得到8 個潛在的SNPs位點， 6 個位于外顯子區(qū)域，均為錯義突變，2 個位于5’UTR。其中A/G轉(zhuǎn)換的數(shù)量最多，共有4 個；T/C 轉(zhuǎn)換的數(shù)量為1 個；C/A顛換2 個；T/A顛換1 個；不存在G/C顛換和G/T顛換。轉(zhuǎn)換的數(shù)量占總檢測到的SNPs位點的62.5%，顛換占37.5%。

圖2 通過擴(kuò)增獲得的5個Izumo1基因SNP位點
Fig.2 Five SNPs ofIzumo1gene obtained by amplification

2.4 Izumo1基因SNP位點與綿羊產(chǎn)羔性狀關(guān)聯(lián)分析

根據(jù)分型所獲得的數(shù)據(jù)，對上述8 個位點進(jìn)行了初步篩選，將在單、多羔綿羊群體中位點分布沒有差異的SNP位點排除，最終篩選獲得的g.54412135A>G和g.54412107C>A 2個位點。通過基因分型發(fā)現(xiàn)：Izumo1基因g.54412135A>G位點在多羔和單羔綿羊品種中存在GG、GA和AA 3種基因型，g.54412107C>A在多羔品種中存在CC和CA 2 種基因型，而在單羔品種中存在CC、CA和AA 3種基因型(表2)。g.54412135A>G位點在小尾寒羊、灘羊和草原型藏羊品種中存在GG、GA和AA 3種基因型，而在蘇尼特羊中存在GG和GA 2種基因型，在薩福克羊和杜泊羊中僅有GG 1種基因型；g.54412107C>A在小尾寒羊、蘇尼特羊、薩福克羊和草原型藏羊品種中存在CC和CA 2種基因型，而在灘羊和杜泊羊品種中存在CC、CA和AA 3種基因型(表3)。Izumo1基因的g.54412107C>A位點的基因型頻率和基因頻率在單、多羔綿羊群體間的分布差異均極顯著(P<0.01)。

利用Popgen 32軟件統(tǒng)計分析綿羊Izumo1基因2 個品種各SNP位點的多態(tài)性。由表3可知，在6 個品種中的g.54412135A>G多態(tài)位點多態(tài)信息含量(PIC)都屬于低度多態(tài)(PIC<0.25)；杜泊羊的g.54412107C>A多態(tài)位點屬于中度多態(tài)(0.25G多態(tài)位點處于哈代溫伯格平衡，6 個綿羊品種的 g.54412107C>A多態(tài)位點，均處于哈代溫伯格平衡。

表2 在單、多羔綿羊品種Izumo1基因2 個位點的基因型頻率和等位基因頻率分析Table 2 Genotype and allele frequencies of two SNPs of Izumo1 gene in monotocous and polytocous sheep

注：P<0.01表示差異極顯著。

Note:P<0.01 indicates extremely significant difference.

表3 6個綿羊品種中Izumo1基因的2個SNPs位點的群體遺傳學(xué)分析Table 3 Genetic polymorphism information of Izumo1 gene two SNPs in six sheep breeds

表3(續(xù))

注：P>0.05表示位點在該品種中處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)；P<0.05表示位點在該品種中不處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)。

Note:P>0.05 indicates the locus was under Hardy-Weinberg equilibrium.P<0.05 indicates the locus was not under Hardy-Weinberg equilibrium.

Izumo1基因g.54412135A>G和g.54412107C>A位點的不同基因型與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析統(tǒng)計結(jié)果?？煽闯? 個位點不同基因型與小尾寒羊不同胎次產(chǎn)羔數(shù)之間，不存在顯著關(guān)聯(lián)(P>0.05)(表4)。

表4 Izumo1基因2 個多態(tài)位點的不同基因型與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析Table 4 Association of differrent SNP genotypes of the Izumo1 gene with litter size in Small Tail Han sheep

3 討論與結(jié)論

基因序列的外顯子區(qū)域是相對保守的，因此在外顯子區(qū)SNP位點比較少，因此，外顯子出現(xiàn)變異的頻率僅為內(nèi)含子等區(qū)域的1/5[22]。外顯子區(qū)域中發(fā)生變異的影響遠(yuǎn)>內(nèi)含子區(qū)，因為外顯子的變異可能會造成氨基酸的改變，從而改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)與功能，然而，真核生物的基因表達(dá)調(diào)控非常復(fù)雜，是基因與多種轉(zhuǎn)錄因子共同參與、相互作用的結(jié)果。基因的非翻譯區(qū)(UTR)常常參與基因的表達(dá)調(diào)控。5′UTR常常可以決定轉(zhuǎn)錄的水平和方式，而 3′UTR 可以調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性[23-25]。因此，外顯子區(qū)和5′UTR的基因變異常常會直接影響生物性狀，在遺傳育種的研究中意義重大。

自2005 年Inoue等[9]發(fā)現(xiàn)Izumo1與精卵結(jié)合相關(guān)后，其功能和作用機(jī)制的研究在哺乳動物中展開，雖有報道陸續(xù)克隆了牛[17]、豬[1]、山羊[14,18]、綿羊[14,18]和斑馬魚[19]的Izumo1基因，而對于其單核苷酸多態(tài)性關(guān)注度并不高，Izumo1基因在各個物種中的多態(tài)性與產(chǎn)生子代數(shù)目的相關(guān)性的研究還未見報道。目前在Ensemble數(shù)據(jù)庫(http:∥asia.ensembl.org/Ovis_aries/Transcript/ProtVariations?db=core;g=ENSOARG00000012130;)中發(fā)布的綿羊(Ovisaries)Izumo1基因的SNPs位點只有7 條記錄。本研究在Izumo1基因DNA序列中篩選到8 個SNPs位點，豐富了綿羊Izumo1基因的單核苷酸多態(tài)性。其中，在外顯子區(qū)篩選到6 個SNPs位點并均為錯義突變，遺憾的是無法在6 個綿羊品種中進(jìn)行基因分型，只有2 個處于5′UTR中的位點分型成功。

產(chǎn)羔數(shù)是綿羊重要的繁殖性狀，已有研究對其研究主要聚焦在母羊排卵方面，發(fā)現(xiàn)了諸如生長分化因子9(GDF9)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IB(BMPR1B)等高繁殖力主效基因[26-30]，尤其是顯著影響小尾寒羊排卵數(shù)的BMPR1B基因FecB突變[31]。精子Izumo1蛋白，作為一種跨膜蛋白，主要對哺乳動物受精過程中的精卵融合具有重要作用[9]，能夠通過與卵子的識別和融合影響受精過程，猜測其可能對于綿羊繁殖也至關(guān)重要[14]。Inoue等[9]利用重組Izumo蛋白制備的多克隆抗體進(jìn)行免疫標(biāo)識，發(fā)現(xiàn)小鼠Izumo蛋白大小為56.4 ku，僅在睪丸組織中表達(dá)。Kim等[1]研究證實Izumo1蛋白位于精子質(zhì)膜內(nèi)部，在精子上特異性表達(dá)，只在精卵融合時才會在精子頭部檢測到。本研究只對小尾寒羊母羊進(jìn)行了產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)Izumo1基因的2 個多態(tài)性位點與小尾寒羊母羊不同胎次產(chǎn)羔數(shù)之間不存在顯著關(guān)聯(lián)。推測Izumo1基因可能在母羊個體本身并沒有重要的生物學(xué)作用，與母羊的產(chǎn)羔數(shù)性狀并不相關(guān)。在其他物種中，Izumo1是否與產(chǎn)生子代數(shù)量相關(guān)有待進(jìn)一步研究。Izumo1作為精卵質(zhì)膜融合的關(guān)鍵性配體蛋白，直接決定了精子是否能夠正常與卵子發(fā)生融合，推測Izumo1基因可能與公羊的繁殖力性狀有關(guān)。本研究克隆了完整的小尾寒羊和蘇尼特羊的Izumo1基因，并在Izumo1基因中獲得了8 個SNPs位點。其中：Izumo1基因的g.54412107C>A位點基因型頻率和等位基因頻率在單、多羔綿羊群體間的分布差異均極顯著。Izumo1基因g.54412135A>G和g.54412107C>A位點的不同基因型和小尾寒羊不同胎次的產(chǎn)羔數(shù)之間沒有顯著關(guān)聯(lián)(P>0.05)。