王雪萌，修寶林，呂雨澤，葛菁萍,*

(1.黑龍江大學 生命科學學院微生物黑龍江省高校重點實驗室，哈爾濱 150080；2.黑龍江大學 農(nóng)業(yè)微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150500)

0 引 言

細菌調(diào)控小RNA(small regulatory RNA, sRNA)，是一種通過調(diào)整基因表達、蛋白活性來適應外部環(huán)境的調(diào)控機制[1-2]。每個sRNA具有多個調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的特定基因，在細胞內(nèi)部基因形成復雜的控制表達機制。目前，對sRNA主要研究內(nèi)容集中在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性、調(diào)控蛋白表達效果、調(diào)控多重因子參與細胞代謝等方面[3-5]，且以與目的mRNA互補配對其基因表達效果產(chǎn)生影響的sRNA基因功能的研究方向居多，此研究sRNA-sgrS屬于其中之一[6]。當菌體內(nèi)的葡萄糖過多以及糖磷酸濃度達到一定閾值時，會引起sgrS所調(diào)控的相關的應激代謝(又叫葡萄糖—磷酸鹽應激)。sgrS與編碼糖轉(zhuǎn)運蛋白目的基因相結(jié)合，加快葡萄糖—磷酸代謝，抑制了葡萄糖的攝取，以阻止糖—磷酸的積累[7]，同時促進葡萄糖載體蛋白GmRNA的降解，導致葡萄糖轉(zhuǎn)運載體蛋白G合成減少，使葡萄糖的攝入減少。且當sgrS與葡萄糖轉(zhuǎn)運載體蛋白G結(jié)合，使其喪失轉(zhuǎn)運功能，使葡萄糖的攝入減少。

近年來，由于克雷伯氏菌屬(Klebisella)中的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)與其他菌株相比具有底物物質(zhì)廣泛、產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率高、轉(zhuǎn)化丙酮酸至 2,3-BD的3個關鍵酶(α-乙酰乳酸脫羧酶、α-乙酰乳酸合成酶、已偶姻還原酶)均在同一個操縱子budABC上、耐高葡萄糖壓力等優(yōu)勢，如何使K.pneumoniae高產(chǎn) 2,3-BD成為了當前國內(nèi)外實驗室研究熱點[8-9]?，F(xiàn)階段K.pneumoniae發(fā)酵高產(chǎn) 2,3-BD的研究主要集中在3個方面：①通過過量表達 2,3-BD代謝途徑的關鍵酶基因的方法提高 2,3-BD的產(chǎn)量；②采用敲除其他副產(chǎn)物代謝途徑關鍵酶基因的方法減少其他副產(chǎn)物產(chǎn)量；③培養(yǎng)基成分、搖瓶培養(yǎng)條件單因素研究優(yōu)化 2,3-BD的發(fā)酵條件。

由于sgrS基因?qū)儆诨蜷g的非編碼區(qū)，不轉(zhuǎn)譯蛋白質(zhì)，但可以調(diào)控靶細胞及目的mRNA，對于敲除關鍵酶基因，將sgrS基因敲除具有對菌體自身代謝影響小、傷害低的特點[10]?；蚯贸夹g的快速發(fā)展為探索sRNA的基因調(diào)控提供了技術支持。基因敲除技術是一種基于基因組學以及分子遺傳學，且克服了隨即整合的盲目性和偶然性，從而得到理想化結(jié)果的基因修飾技術。常見的基因敲除技術有利用同源重組技術、利用隨機插入突變、RNA干擾等[11-12]。此λRed同源重組技術是通過將插入失活的重組片段與染色體特定的區(qū)域片段進行同源重組的方法以達到基因敲除的目的。柳鵬福等[13]通過λRed同源重組技術將K.pneumoniae中l(wèi)uxS基因敲除，使菌株群體感應消失，luxS基因突變型菌株比野生型菌株以葡萄糖為底物生成 2,3-BD的能力提高了47.75%。Jung等[14]采用λRed同源重組系統(tǒng)構建產(chǎn)氣腸桿菌ldh基因缺失菌株，以葡萄糖為底物，使 2,3-BD的產(chǎn)量提高了16.7%。郭學武等[15]運用λRed同源重組技術成功敲除K.pneumoniae中磷酸轉(zhuǎn)乙?；富颍啾仍季昊蛉笔Ь?2,3-BD的產(chǎn)量提高了19.58%。本文選用的菌株為實驗室保藏的野生型菌株K.pneumoniaeHD79及敲除葡萄糖代謝副產(chǎn)物的關鍵酶基因—乳酸脫氫酶基因(ldh)及乙酸激酶基因(ack)的突變型菌株，采用λRed同源重組技術將sgrS基因敲除，構建K.pneumoniaeHD79及K.pneumoniaeHD79-02 sRNA-sgrS基因缺失重組菌株，并用熒光顯微鏡觀察，基因突變株構建成功，研究結(jié)果為后續(xù)研究K.pneumoniae葡萄糖轉(zhuǎn)運及對 2,3-BD的產(chǎn)量影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

本研究所用到菌株K.pneumoniaeHD79、K.pneumoniaeHD79-02(△ldh, △ack)和大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α均由黑龍江大學微生物重點實驗室提供，用于基因sgrS克隆轉(zhuǎn)化。

1.1.2 質(zhì)粒

pMD18-T購自大連寶生物工程，用于克隆載體。pEGFP-C3和pKD46均由黑龍江大學微生物重點實驗室提供，用于EGFP克隆和協(xié)助同源重組。

1.1.3 擴增引物

依據(jù)數(shù)據(jù)庫EMBL中sgrS及NCBI中EGFP基因序列信息，再結(jié)合克隆載體pMD18-T中酶切位點的分布情況，設計出用于PCR各對引物序列，見表1。

表1 引物序列、酶切位點及引物用途

1.1.4 培養(yǎng)基

1)LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH值7.0，121 ℃高壓滅菌15 min，用于K.pneumoniaeHD79及K.pneumoniaeHD79-02的培養(yǎng)。

2)LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，2%的瓊脂粉，pH值7.0，121 ℃高壓滅菌15 min，用于K.pneumoniaeHD79及K.pneumoniaeHD79-02的培養(yǎng)。

3)種子培養(yǎng)基：(NH4)2SO41 g/L，K2HPO4·3H2O 3.4 g/L，KH2PO41.3 g/L，MgSO40.2 g/L，酵母提取物1 g/L，F(xiàn)eSO41 g/L，ZnSO40.02 g/L，MnSO40.02 g/L，CaCl20.02 g/L，pH值7.0，121 ℃高壓滅菌15 min。然后將上述滅菌后的溶液與經(jīng)108 ℃高壓滅菌20 min的30 g/L葡萄糖粉末在無菌條件下混合。該培養(yǎng)基用于低溫保存的 2,3-BD發(fā)酵菌株的培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 出發(fā)菌株K.pneumoniaeHD79及K.pneumoniaeHD79-02基因組提取

將經(jīng)過菌株活化和復壯后的K.pneumoniaeHD79及K.pneumoniaeHD79-02接種到LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃，150 rpm的條件下培養(yǎng)至對數(shù)期，利用細菌基因組DNA(小量)提取試劑盒分別提取兩株菌體的基因組。

1.2.2 目的基因sgrS和標記基因EGFP的克隆

利用表1中的引物分別以目的基因sgrS和標記基因EGFP為模版進行PCR擴增，反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min；58 ℃退火1 min；72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。以pMD18-T載體為連接骨架，分別將加“A”后的sgrS基因和EGFP基因PCR產(chǎn)物與其在16 ℃金屬浴中過夜連接，將重組質(zhì)粒命名為pT-sgrS和pT-EGFP。

1.2.3 同源重組片段sgrSA1-EGFP-sgrSA2的構建

對質(zhì)粒pT-EGFP及pT-sgrS通過酶切、膠回收的方法得到EGFP基因片段及線性的質(zhì)粒pT-sgrS，而后通過T4連接酶得到重組載體pXL-sgrSA1-EGFP-sgrSA2，整體的構建策略見圖1。

圖1 同源重組片段sgrSA1-EGFP-sgrSA2 Fig.1 Construction of homologous recombination fragment sgrSA1-EGFP-sgrSA2

1.2.4 電轉(zhuǎn)化構建基因重組菌株

1)質(zhì)粒pKD46分別轉(zhuǎn)化至K.pneumoniaeHD79及K.pneumoniaeHD79-02。對含有pKD46質(zhì)粒的菌株進行搖瓶擴大培養(yǎng)，提取該菌株內(nèi)的質(zhì)粒進行EcoRI單酶切驗證。將單酶切結(jié)果正確的質(zhì)粒進行膠回收純化，并將膠回收后的質(zhì)粒再次進行1 %瓊脂糖凝膠電泳以驗證膠回收產(chǎn)物濃度。將質(zhì)粒pKD46分別電轉(zhuǎn)化至K.pneumoniaeHD79及K.pneumoniaeHD79-02[16]。

2)同源重組片段sgrSA1-EGFP-sgrSA2分別轉(zhuǎn)化至K.pneumoniaeHD79及K.pneumoniaeHD79-02。將純化后同源重組片段sgrSA1-EGFP-sgrSA2通過電轉(zhuǎn)化導入到含有pKD46質(zhì)粒并經(jīng)過L-阿拉伯糖誘導后的K.pneumoniaeHD79及K.pneumoniaeHD79-02感受態(tài)細胞中，實現(xiàn)宿主菌中sgrS基因敲除的目的。隨機挑取LB固體平板上(Amp 100 μg/mL)生長的單菌落，搖瓶擴大培養(yǎng)后，進行熒光顯微鏡觀察(藍光450 nm激發(fā))，觀察是否有綠色熒光蛋白出現(xiàn)。

2 結(jié)果分析

2.1 目的基因sgrS和標記基因EGFP的克隆

利用細菌基因組DNA(小量)提取試劑盒對原始菌株K.pneumoniaeHD79及K.pneumoniaeHD79-02進行基因組提取，對提取結(jié)果進行1 %瓊脂糖凝膠電泳(圖2(a))，在15 kb的上方各有一條清晰明亮的條帶，說明K.pneumoniaeHD79及K.pneumoniaeHD79-02進行基因組提取成功。

以上述提取的兩株原始菌株基因組為模板，以引物sgrS-up和sgrS-down對目的基因sgrS進行PCR擴增，以質(zhì)粒pEGFP-C3為模板，以EGFP-up和EGFP-down為引物，通過聚合酶Prime Star對EGFP基因進行PCR擴增。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，分別在411 bp和922 bp處出現(xiàn)清晰明亮條帶，與數(shù)據(jù)庫查詢一致，表明目的基因sgrS(圖2(b))和標記基因EGFP(圖2(c))的克隆成功。

圖2 細菌基因組提取及目的基因的擴增Fig.2 Bacterial genome extraction and Amplification of the target gene

2.2 基因元件的拼接

將目的基因sgrS和標記基因EGFP的擴增產(chǎn)物通過熱激法導入JM110感受態(tài)細胞中[17]。經(jīng)過藍白斑篩選、PCR及酶切驗證、測序檢測并后，獲得含sgrS基因的克隆載體pT-sgrS及含有EGFP基因的克隆載體pT-EGFP，見圖3。

圖3 克隆載體的菌液PCR驗證Fig.3 PCR amplification of bacterial fluid PCR of bacterial fluid PCR

2.3 同源重組片段sgrSA1-EGFP-sgrSA2的構建

分別對提取質(zhì)粒pT-sgrS和pT-EGFP進行BclI單酶切(圖4(a))，將酶切產(chǎn)物線性pT-sgrS(BclI, 3 103 bp)和EGFP(BclI, 922 bp)片段進行膠回收純化后，通過T4連接酶連接，連接產(chǎn)物通過熱激法導入JM110感受態(tài)細胞中。挑取平板菌落擴大培養(yǎng)后，對擴大培養(yǎng)菌株以sgrS-up和sgrS-down為引物進行菌液PCR，發(fā)現(xiàn)在1孔道有1 333 bp條帶出現(xiàn)，得到重組載體pT-sgrSA1-EGFP-sgrSA2(圖4(b))。

圖4 同源重組片段sgrSA1-EGFP-sgrSA2的PCR驗證Fig.4 PCR amplification of homologous recombination fragment sgrSA1-EGFP-sgrSA2

2.4 電轉(zhuǎn)化構建基因重組菌株

將輔助質(zhì)粒pKD46通過電轉(zhuǎn)化導入到K.pneumoniaeHD79和K.pneumoniaeHD79-02感受態(tài)細胞中，經(jīng)平板涂布培養(yǎng)，挑取菌落擴大培養(yǎng)后對對其進行pKD46質(zhì)粒提取(圖5(a))和BamH I單酶切驗證(圖5(b))。

圖5 電轉(zhuǎn)化篩選結(jié)果Fig.5 Results of electrotransformation screening

2.5 sgrS基因缺失重組菌株K.pneumoniae HD79及K.pneumoniae HD79-02的鑒定

將含有酶切結(jié)果正確的質(zhì)粒的K.pneumoniaeHD79和K.pneumoniaeHD79-02細胞再次制成感受態(tài)細胞，并在L-阿拉伯糖誘導后，將sgrS插入失活片段sgrSA1-EGFP-sgrSA2(KpnI/XhoI)導入這兩種感受態(tài)細胞中，最終得到sgrS缺失型菌株K.pneumoniaeHD79及K.pneumoniaeHD79-02。對重新構建的目的基因缺失型菌株進行熒光顯微鏡觀察(藍光450 nm激發(fā))，結(jié)果見圖6，sgrS缺失型菌株K.pneumoniaeHD79和K.pneumoniaeHD79-02構建成功。

圖6 熒光觀察結(jié)果(400×)Fig.6 Result of fluorescence observation(400×)

3 討 論

隨著基因工程技術與轉(zhuǎn)錄組學的不斷深入發(fā)展，通過對于菌株的基因敲除遺傳修飾改造，改變了菌株的遺傳基因，阻礙部分基因發(fā)揮其生理生物學功能，在隨機整合的基礎上得到目標結(jié)果。同RecA系統(tǒng)同源重組法、CRISPR/Cas系統(tǒng)介導的基因敲除方法相比較，λRed同源重組具有重組效率高、引物所需的同源臂較短[18]、應用菌株范圍廣等優(yōu)勢。韓琴等[19]通過λRed同源重組技術敲除了編碼葡萄糖特異性轉(zhuǎn)運蛋白的ptsG基因，構建大腸桿菌BL21基因缺陷重組菌株，從而使得大腸桿菌絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的活力最大值是空白對照組的9.6倍；陳欣等[20]通過λRed同源重組技術敲除了編碼乙酰氨基葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)運子的nagE基因以及編碼甘露糖磷酸轉(zhuǎn)運子的manX基因，插入外源基因卡那霉素基因，構建雙基因敲除大腸桿菌菌株，使得突變株產(chǎn)生的的氨基葡糖提高了186 %。

近年來，揭示K.pneumoniae相關基因的功能，通過基因修飾改變菌株遺傳代謝途徑，探究 2,3-BD的產(chǎn)量與基因的關系已經(jīng)成為當下K.pneumoniae研究方向熱門之一。K.pneumoniae產(chǎn) 2,3-BD以糖類為底物進行發(fā)酵生產(chǎn)，sgrS是由糖脅迫誘導的sRNA，調(diào)控大腸桿菌糖轉(zhuǎn)運蛋白PtsG的mRNA表達[21-22]。sRNA-sgrS通過與編碼膜上葡萄糖運載體EIICBGlc的ptsG的mRNA結(jié)合，加速該mRNA的降解，從而減少葡萄糖的攝入[23]。當sRNA-sgrS被敲除，使sgrS無法與葡萄糖運載體EIICBGlc的ptsG的mRNA結(jié)合，細胞內(nèi)磷酸糖的蓄積到一定閥值時，葡萄糖代謝壓力成為一種代謝功能障礙，導致細胞生長受到抑制，從而降低了細菌代謝速率[24-25]。此外研究發(fā)現(xiàn)，菌體中葡萄糖脫氧縮合形成磷酸糖，磷酸糖過高能夠?qū)晷纬梢环N脅迫壓力，抑制菌體生長[26]。菌體生長受到抑制，從而使自身代謝所消耗的葡萄糖轉(zhuǎn)為生產(chǎn) 2,3-BD，進一步提高 2,3-BD的產(chǎn)量。sgrS是與目的mRNA相互作用從而進行正向和負向調(diào)控糖類物質(zhì)的模型之一，操控了葡萄糖的運輸，通過敲除sgrS基因可解除限制，提高葡萄糖的運輸，提高了 2,3-BD的產(chǎn)量。

4 結(jié) 論

通過熒光顯微鏡篩選和PCR對sRNA-sgrS基因缺失突變株進行鑒定，為后續(xù)探索K.pneumoniaeHD79及K.pneumoniaeHD79-02的基因缺失重組菌株中 2,3-BD的產(chǎn)量、相關基因水平的表達情況、代謝指標的影響做鋪墊。此外，在國內(nèi)外針對sgrS基因在肺炎克雷伯氏菌中參與代謝調(diào)控報道較少，利用λRed同源重組技術構建sgrS基因缺失菌株，在此進一步研究葡萄糖濃度對2, 3-BD產(chǎn)量的影響，對在分子領域構建高產(chǎn)2, 3-BD的菌株提供了一定的技術支持。